全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ００２
收稿日期：２０１３－１０－０９
基金项目：国家自然科学基金（２１３７６２５５）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（ＳＳ２０１３ＡＡ０５０７０３⁃２）；青岛科技发展计划（１２⁃１⁃４⁃９⁃（３）⁃ｊｃｈ）
作者简介：任　 萌（１９８８—），男，陕西咸阳人，硕士研究生，研究方向：生物化工；杨建明（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｊｍｉｎｇ８８８＠ １２６􀆰 ｃｏｍ
响应面法优化 α 蒎烯发酵培养基
任　 萌１，２，杨建明２，３，咸　 漠３
（１􀆰 南京农业大学 生命科学学院，南京 ２１００９５； ２􀆰 青岛农业大学 生命科学学院，青岛 ２６６１０９；
３􀆰 中国科学院 青岛生物能源与过程研究所 生物基材料重点实验室，青岛 ２６６１０１）
摘　 要：利用响应面法对 α 蒎烯发酵培养基进行优化。 先利用单因素实验法筛选出 ＭＤ 牛肉粉为最有利于发酵
产 α 蒎烯的 Ｎ源。 此后用 Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ （Ｐ Ｂ）实验方法对相关影响因素效应进行评估，筛选出有显著效应
的 ３个因素：柠檬酸用量、牛肉粉用量以及培养基初始 ｐＨ。 然后用最陡爬坡实验逼近以上 ３因素最优水平。 最后
由中心组和实验设计法及响应曲面分析法确定主要因素的最佳条件。 在优化后的培养条件下，发现 α 蒎烯产量
从 １􀆰 ７１０ ｍｇ ／ Ｌ提升到 ７􀆰 ０５３ ｍｇ ／ Ｌ，发现产量提高了 ３倍左右。
关键词：大肠杆菌；α 蒎烯；优化；响应面分析
中图分类号：Ｑ８５１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－０００６－０６
Ｍｅｄｉｕｍ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ α⁃ｐｉｎｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
ＲＥＮ Ｍｅｎｇ１，２，ＹＡＮＧ Ｊｉａｎｍｉｎｇ２，３，ＸＩＡＮ Ｍｏ３
（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎＪｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９，Ｃｈｉｎａ； ３． ＣＡＳ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ⁃ｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ，
Ｑｉｎｇｄａｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｆｏｒ α⁃ｐｉｎｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｉｎｉｔｉａｌｌｙ，ＭＤ ｂｅｅｆ
ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｗｄｅｒ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ α⁃ｐｉｎｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｔｈｅｎ Ｐｌａｃｋｅｔｔ⁃
Ｂｕｒｍａｎ （ Ｐ⁃Ｂ） ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｍｅｄｉｕｍ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｔｈａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ α⁃ｐｉｎｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｅｖｅｌｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｗｄｅｒ，ｐＨ ａｎｄ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐａｔｈ ｏｆ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｗａｓ
ｕｓｅｄ ｔｏ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｔｈｒｅｅ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｓｔｅｐ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｅｆ
ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｗｄｅｒ，ｐＨ ａｎｄ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ α⁃ｐｉｎｅｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ １􀆰 ７１０ ｔｏ ７􀆰 ０５３ ｍｇ ／ Ｌ． Ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α⁃ｐｉｎｅｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｂｏｕｔ ３⁃ｆｏｌｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ；α⁃ｐｉｎｅｎｅ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 α 蒎烯用途广泛［１］，是多种名贵香料合成的中
间体［２－３］，在空气中可自动氧化聚合变稠，可被应用
于抗氧化剂［１］。
当 α 蒎烯体积浓度大于 ０􀆰 ０５％时即可达到对
多种昆虫的毒杀作用，因此可以作为潜在的新型农
药［４］。 根据 Ｍｅｙｌｅｍａｎｓ等［５］和 Ｈａｒｖｅｙ 等［６］的报道，
二聚化后的 α 蒎烯能量密度达到 ０􀆰 ９３８ ｇ ／ ｃｍ３，净
燃烧可以达到 ３９􀆰 ５ ＭＪ ／ Ｌ，几乎可以与 ＪＰ １０
（Ｃ１０Ｈ１６，一种高密度合成烃类液体燃料）相媲美［７］，
是一种潜在的高能燃料，α 蒎烯还可以用作医药合
成的中间体，用来合成具有生理活性的化学品，如
桃金娘烯醛、蒎酮酸酯等［８ ９］。
目前，工业上生产 α 蒎烯的主要原料是松节
油，可根据 ２ 种蒎烯沸点不同，采用蒸馏法进行制
备［１，１０］。 但随着森林资源的不断开发和利用，原料
松节油来源成为限制 α 蒎烯工业化生产的短板。
因此，开发一条新的可持续发展的 α 蒎烯工业生
产途径显得尤为重要，而新兴的微生物技术无疑是
非常具有吸引力的方法［１１－１２］。
响应面法作为一种统计学方法，近年来已被广
泛应用于生物领域，特别是发酵行业［１３－１６］。 而利用
响应面法，从培养基角度提高重组大肠杆菌生产α
蒎烯的产量，在国内尚未有报道。 因此，本文采用
重组大肠杆菌 ＹＪＭ２８作为实验菌株，通过响应面分
析法优化培养基，从而提高 α 蒎烯的产量，以期为
实现生物法生产 α 蒎烯，并逐步实现工业化应用
提供理论基础。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 菌株
重组大肠杆菌 ＹＪＭ２８，中国科学院青岛生物能
源与过程研究所生物基化学品团队实验室构建及
保存。
１􀆰 ２　 培养基
Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培养基：蛋白胨 １０ ｇ、酵母粉
５ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ；加入蒸馏水定容到 １ ０００ ｍＬ，１２１ ℃
灭菌 ２０ ｍｉｎ 后冷却使用。 用前加入氨苄青霉素和
氯霉素，终质量浓度分别为 １００和 ３４ ｍｇ ／ Ｌ。
初始发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、牛肉粉 ９、
Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ９􀆰 ８、一水合柠檬酸 ６􀆰 ３、柠檬酸铁铵
０􀆰 ３；ＭｇＳＯ４ ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 用时添加氯霉素和氨苄青霉
素，终质量浓度分别为 １００及 ３４ ｍｇ ／ Ｌ。
１􀆰 ３　 培养条件
用灭菌牙签挑取单克隆于 ３ ｍＬ ＬＢ 培养液，
３７ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ培养过夜后进行活化，再按照 １％
（体积分数）接种量接种于装有 ３０ ｍＬ ＬＢ 培养基的
１００ ｍＬ三角瓶中，进行二级种子的培养。 按照 １％
接种量向装有 １００ ｍＬ发酵培养基的 ５９０ ｍＬ厌氧瓶
中，加入 １ ｍＬ二级种子培养液，３７ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ培
养至 ＯＤ６００达到 ０􀆰 ６～０􀆰 ９，加入 ＩＰＴＧ 诱导并加盖无
菌橡胶胶塞，终浓度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，诱导后培养温
度调至 ３０ ℃，转速不变，发酵 ４８ ｈ［１１，１７－１９］。
１􀆰 ４　 α 蒎烯浓度检测及菌浓测定
发酵结束后将发酵摇瓶放入 ６０ ℃烘箱加热处
理 ３０ ｍｉｎ，用气相进样针抽取 １ ｍＬ气体进行气相色
谱检测，以 α 蒎烯标准品作为定量标准。 仪器型
号： ＳＰ ６８９０ 气相色谱仪。 色谱柱：ＨＰ⁃ＩＮＮＯＷａｘ
毛细管色谱柱 （３０ ｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）。 检测
器：ＦＩＤ。 气化温度：２００ ℃。 柱温：５０ ℃保温 ０􀆰 ５
ｍｉｎ，然后 ４ ℃ ／ ｍｉｎ升温至 ７０ ℃，再以 ２０ ℃ ／ ｍｉｎ升
温至 ２５０ ℃，保温 ５ ｍｉｎ。 检测器温度：２００ ℃ ［１１，２０］。
用分光光度计在 ６００ ｎｍ波长测定菌体浓度。
１􀆰 ５　 Ｎ源筛选
按照 ９ ｇ ／ Ｌ 的添加量分别添加下列 ７ 种 Ｎ 源：
阿拉丁牛肉粉、奥博牛肉膏、国药牛肉膏、ＭＤ 牛肉
粉、双旋牛肉膏、Ｓｏｌａｒｂｉｏ牛肉膏和奥博牛肉粉［２１］。
１􀆰 ６　 Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｂｕｒｍａｎ（Ｐ Ｂ）实验设计
用 Ｐ Ｂ实验设计对涉及实验的 ８ 种因素进行
筛选，浓度水平及范围参考文献［１７，２２］并做了适
当调整，具体见表 １。
１􀆰 ７　 最陡爬坡实验
爬坡实验用于 Ｐ Ｂ实验结果筛选出的关键因
素，使关键因素浓度最大限度靠近响应值极大区
域，步长及变化方向根据 ＰＢ实验结果得出［１３，１５］。
１􀆰 ８　 中心组合实验设计（ＣＣＤ）
响应面分析法用于确定 Ｐ Ｂ 实验筛选出的重
要影响因素的最佳浓度和考察因素之间的交互作
用，最终提高 α 蒎烯产量［１３］。 实验采用三因素五
水平实验设计表，其中包含 １个星点 α（１􀆰 ６８），正负
水平各为 １，中心点重复 ６次，组数为 ２０。 其他不显
著组分设为原始值（见表 ４），并以此构建模型［２１］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 培养基 Ｎ源筛选及 Ｐ Ｂ实验结果
Ｎ源筛选结果见图 １，由 Ｐ Ｂ实验设计及其回
归分析结果见表 １和表 ２。
在 Ｎ 源筛选实验中选用阿拉丁牛肉粉、ＭＤ 牛
肉粉和双旋牛肉膏等 ７种 Ｎ源，结果见图 １。 由图 １
可知：ＭＤ 牛肉粉作为 Ｎ 源时 α 蒎烯产量最高，达
到 ３８７􀆰 ４５ μｇ ／ Ｌ，其次是阿拉丁牛肉粉，之后是奥博
牛肉膏。 在发酵过程中，以 ＭＤ 牛肉粉和奥博牛肉
粉作为 Ｎ源进行 α 蒎烯发酵时，产量差距不大；在
７　 第 ６期 任　 萌等：响应面法优化 α 蒎烯发酵培养基
菌体培养阶段时，ＭＤ 牛肉粉实验组菌体浓度达到
诱导所需要求的培养时间为 ３ ｈ 左右，而奥博牛肉
膏组则需要 ５ ｈ左右，增加了发酵结束所需时间；后
期发酵阶段 ＭＤ 牛肉粉实验组的菌体生长正常，发
酵结束后菌体不发生自溶，而奥博牛肉膏实验组在
３０ ｈ时菌体进入衰亡阶段，发生自溶。 因此，选取
ＭＤ牛肉粉作为 Ｎ源进行下一步实验。
Ｐ Ｂ实验采用 Ｎ＝ １２的实验设计表，对涉及试
验的 ８个因素进行考察，每个因素采取高低（ －１，＋
１）２个水平，以发酵结束后的 α 蒎烯浓度作为响应
值，实验设计及结果见表 ２。
１—双旋牛肉膏； ２—Ｓｏｌａｒｂｉｏ牛肉膏； ３—国药牛肉膏； ４—阿拉丁
牛肉粉； ５—奥博牛肉膏； ６—ＭＤ牛肉粉； ７—奥博牛肉粉
图 １　 Ｎ源对 α 蒎烯产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α⁃ｐｉｎｅｎｅ
表 １　 Ｐ Ｂ实验设计因素水平及效应分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐ⁃Ｂ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
变量编码 因素 单位 低水平 高水平 系数 Ｆ Ｐ
模型 ２４９􀆰 ３８８ １􀆰 ７８１ ５５７ ０􀆰 ０４４ ６
Ａ 葡萄糖 ｇ ／ Ｌ ２０ ３０ －５􀆰 １９７９ ２ ０􀆰 ０７５ ０３３ ０􀆰 ８０１ ９
Ｂ 牛肉粉 ｇ ／ Ｌ ９ ２０ －４９􀆰 ５３０ ４ ６􀆰 ８１３ ００６ ０􀆰 ０２９ ７
Ｃ ＭｇＳＯ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ２ ３ －７􀆰 １６２９ ２ ０􀆰 １４２４ ８７ ０􀆰 ７３０ ９
Ｄ 柠檬酸铁铵 ｇ ／ Ｌ ０􀆰 ３ ０􀆰 ４５ １５􀆰 １８１ ２５ ０􀆰 ６４０ ０４４ ０􀆰 ４８２ ２
Ｅ Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ｇ ／ Ｌ ９􀆰 ８ １４􀆰 ７ １６􀆰 ９４６ ２５ ０􀆰 ７９７ ５２１ ０􀆰 ４３７ ６
Ｆ ｐＨ ７􀆰 ０ ７􀆰 ５ －３８􀆰 ４５８ ８ ４􀆰 １０７ ５７２ ０􀆰 ０３５ ８
Ｇ 一水合柠檬酸 ｇ ／ Ｌ ２􀆰 １ ４􀆰 ２ －２４􀆰 ０６２ ９ １􀆰 ６０８ ０２ ０􀆰 ０３７ ９
Ｈ 甜菜碱 ｇ ／ Ｌ ０􀆰 １ ０􀆰 ４ －４􀆰 ９７６ ２５ ０􀆰 ０６８ ７７ ０􀆰 ８１０ １
　 注：表中 Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８４ ６； Ａｄｊ Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９７６ ２。
表 ２　 Ｐ Ｂ实验设计及结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｐ⁃Ｂ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
实验组 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ
ρ（α 蒎烯） ／ （ｍｇ·Ｌ－１）
实际值 预计值
１ １ －１ １ １ －１ １ １ －１ ０􀆰 ７１９ ０􀆰 ７２５
２ －１ １ １ －１ １ １ １ －１ １􀆰 ２１３ １􀆰 １３４
３ １ １ －１ －１ －１ １ －１ １ ０􀆰 ８９９ ０􀆰 ８７６
４ －１ －１ １ －１ １ １ －１ １ ０􀆰 １６１ ０􀆰 １３７
５ １ －１ １ １ １ －１ －１ １ ０􀆰 ４０１ ０􀆰 ３７５
６ １ １ －１ １ １ １ －１ －１ ０􀆰 ４７７ ０􀆰 ４９９
７ １ －１ －１ －１ １ －１ １ －１ ０􀆰 １７１ ０􀆰 １６６
８ －１ １ １ １ －１ －１ －１ －１ ０􀆰 ７９７ ０􀆰 ７７３
９ －１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ －１ ０􀆰 ５０５ ０􀆰 ５０９
１０ １ １ １ －１ －１ －１ １ １ ０􀆰 ６６２ ０􀆰 ６８１
１１ －１ －１ －１ １ －１ １ １ １ ０􀆰 ２４９ ０􀆰 ２３９
１２ －１ １ －１ １ １ －１ １ １ １􀆰 ６９３ １􀆰 ７１０
８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
　 　 利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ７􀆰 ０ 软件对表 ２ 中的实验
数据建立多元一次回归模型，得回归方程如下：
Ｙ ＝ － ６６２􀆰 ３２ － １３７􀆰 ６２Ａ２ ＋ １９８􀆰 １９Ｂ － ６０􀆰 ４２Ｃ ＋
１１􀆰 ０５Ｄ －９４􀆰 ６４Ｅ ＋ ２８１􀆰 ９６Ｆ ＋ ６９􀆰 ９３Ｇ － ６８􀆰 ０８。
分析结果见表 １。 由表 １ 可知，模型的 Ｐ 值
（０􀆰 ０４４ ６） ＜０􀆰 ０５，说明模型有 ４􀆰 ４６％的可能性被
实验中的噪声影响，该模型结果可靠性较高。 ８ 种
因素对响应值的影响在 α＝ ０􀆰 ０５ 的水平差距显著，
其中，一水合柠檬酸、ｐＨ 以及牛肉粉 ３ 种因素对
响应值有重要影响，Ｐ 值依次为 ０􀆰 ０３７ ９、０􀆰 ０３５ ８
和０􀆰 ０２９ ７，均小于 ０􀆰 ０５，说明 ３ 种条件均可提高
α 蒎烯产量，特别是牛肉粉和一水合柠檬酸。 牛
肉粉作为有机 Ｎ源，增加用量可促进菌体生长，增
加产物合成；另一方面，由于前期菌体生长过盛，
造成发酵液黏度增高，溶氧降低，在发酵后期会抑
制菌体生长，造成菌体提前衰老，导致菌体自溶；
作为一种弱有机酸，一水合柠檬酸可调节发酵培
养基的 ｐＨ，起到缓冲培养基 ｐＨ 的作用，另外，从
代谢角度考虑，增加一水合柠檬酸用量，可以加快
柠檬酸循环，从而加快乙酰 ＣｏＡ 的消耗速率，造成
代谢流向 ＴＣＡ 循环靠拢，导致流向甲羟戊酸
（ＭＶＡ）途径的乙酰 ＣｏＡ 减少，从而降低 α 蒎烯
的合成速率。 因此，可通过抑制 ＴＣＡ的循环速度，
减少代谢流向 ＴＣＡ循环靠拢，增加流向 ＭＶＡ的代
谢流，从而提高 α 蒎烯产量。
由表 １ 可知，实验涉及的因素对响应值呈正效
应的有：柠檬酸铁铵和 Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ；对响应值呈
负效应的因素有：葡萄糖、牛肉粉、ｐＨ、ＭｇＳＯ４和一水
合柠檬酸和甜菜碱。 因此，可通过增加呈正效应因
素的用量来增加产量。
２􀆰 ２　 最陡爬坡实验
根据 Ｐ Ｂ 实验筛选出的重要因素对响应值
的影响效应及其大小，设计最陡爬坡实验的变化
步长及变化方向，设计及结果见表 ３。 由表 ３ 可
知：３ 种因素的最优条件在实验 ３ 与实验 ５ 之间，
因此，将实验 ４ 作为响应面分析实验中心点的实
验条件。
２􀆰 ３　 关键组分浓度的优化
在 Ｐ Ｂ实验及最陡爬坡实验基础上确定了 ３
个重要影响因素及响应面分析实验的中心点，采用
中心组合设计（ＣＣＤ）对牛肉粉、一水合柠檬酸以及
ｐＨ这 ３种对响应值有重要影响的因素进行三因素
五水平（－α、－１、０、１ 和 α）的响应面分析实验，实验
设计及结果见表 ４和表 ５。
表 ３　 最陡爬坡实验设计及结果
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈ ｏｆ ｓｔｅｅｐｅｓｔ
ａｓｃｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
实验组 ρ（一水合柠檬酸） ／（ｇ·Ｌ－１） ｐＨ
ρ（牛肉粉） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（α 蒎烯） ／
（ｍｇ·Ｌ－１）
０ ４􀆰 ２０ ７􀆰 ５ ２０ １􀆰 ５９３
１ ３􀆰 ７８ ７􀆰 ４ １８ ２􀆰 ２９３
２ ３􀆰 ３６ ７􀆰 ３ １６ ３􀆰 ６５６
３ ２􀆰 ９４ ７􀆰 ２ １４ ２􀆰 ８４１
４ ２􀆰 ５２ ７􀆰 １ １２ ４􀆰 ８３５
５ ２􀆰 １０ ７􀆰 ０ ９ ２􀆰 １９６
　 注：步长为牛肉粉 ２ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ０􀆰 １以及一水合柠檬酸 ０􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ。
表 ４　 因素水平表
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ
变量 组分
变量水平
－α －１ ０ １ α
Ａ 牛肉粉 ８􀆰 ６ １０ １２ １４ １５􀆰 ４
Ｂ ｐＨ ６􀆰 ９ ７ ７􀆰 １ ７􀆰 ２ ７􀆰 ３
Ｃ 一水合柠檬酸 １􀆰 ８ ２􀆰 １ ２􀆰 ５２ ２􀆰 ９４ ３􀆰 ２
实验中共涉及 ２０ 个试验点，包括 １４ 个析因点
和零点（重复 ６ 次来评价实验误差）。 用 Ｄｅｓｉｇｎ
Ｅｘｐｅｒｔ ７􀆰 ０软件对表 ５ 的实验数据进行二次多元回
归拟合并建立回归方程，得回归方程如下： Ｙ ＝
４ ８４０􀆰 ７７ － １ ３６３􀆰 ５９Ａ － １６０􀆰 ９０Ｂ － ２５４􀆰 ２４Ｃ －
２７５􀆰 ８７ＡＢ － ９１􀆰 ７２ＡＣ － １２４􀆰 ７６ＢＣ － ３２７􀆰 ９８Ａ２ ＋
９３８􀆰 ７２Ｂ２ － １６８􀆰 ３４Ｃ２，式中 Ｙ 为产物 α 蒎烯的质
量浓度（ｍｇ ／ Ｌ）。
对回归方程进行方差分析，分析结果见表 ６。
由表 ６ 可知：３ 个因素对产物产量的影响大小顺
序为：牛肉粉、一水合柠檬酸、培养基初始 ｐＨ。
模型的 Ｐ 值 （ ０􀆰 ０００ ４） ＜ ０􀆰 ０１，说明模型在 α ＝
０􀆰 ０１ 水平上差异极显著；失拟项 Ｐ ＝ ０􀆰 ５７２ ９ ＞
０􀆰 １，说明选择模型正确；模型的相关系数 Ｒ２
（０􀆰 ９０９ ９） ＞ ０􀆰 ９，表明模型拟合良好。 综上所
述，该模型能够对 α 蒎烯发酵实验进行可信度
较高的预测和分析。
９　 第 ６期 任　 萌等：响应面法优化 α 蒎烯发酵培养基
表 ５　 中心组合设计及实验结果
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
实验组
变量水平 ρ（α 蒎烯） ／ （ｍｇ·Ｌ－１）
Ａ
ρ（牛肉粉） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｂ
ｐＨ
Ｃ
ρ（一水合柠檬酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
实际值 预计值
１ ０ ０ ０ ４􀆰 ８９２ ４􀆰 ８７１
２ ０ ０ α ３􀆰 １５３ ３􀆰 １９７
３ ０ ０ ０ ４􀆰 ８４７ ４􀆰 ８７１
４ －１ １ －１ ７􀆰 ０１７ ７􀆰 ０４９
５ －１ －１ １ ６􀆰 １８０ ６􀆰 １９４
６ －１ －１ －１ ６􀆰 ２７７ ６􀆰 ２６６
７ １ １ －１ ３􀆰 ７５０ ３􀆰 ７５４
８ α ０ ０ １􀆰 ９５２ １􀆰 ９２０
９ ０ α ０ ６􀆰 ２９６ ６􀆰 ２２５
１０ ０ ０ ０ ４􀆰 ８３８ ４􀆰 ８７１
１１ １ １ １ ２􀆰 ７８６ ２􀆰 ７９２
１２ １ －１ －１ ４􀆰 ３２５ ４􀆰 ３７８
１３ －１ １ １ ６􀆰 ２０９ ６􀆰 １９７
１４ ０ ０ ０ ４􀆰 ８０４ ４􀆰 ８７１
１５ １ －１ １ ４􀆰 ６４９ ４􀆰 ６３５
１６ －α　 ０ ０ ５􀆰 １９３ ５􀆰 ２０６
１７ ０ －α　 ０ ７􀆰 ０１４ ７􀆰 ０１６
１８ ０ ０ ０ ４􀆰 ８９３ ４􀆰 ８７１
１９ ０ ０ －α　 ４􀆰 ８９４ ４􀆰 ８９２
２０ ０ ０ ０ ４􀆰 ８２９ ４􀆰 ８７１
表 ６　 中心组合实验结果的方差分析
Ｔａｂｌｅ ６　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ
变量 ＳＳ ＤＦ ＭＳ ＣＥ Ｆ值 Ｐ值 显著性
模型 １ ９９０ ５９０ ９ ２２１ １７６􀆰 ７ １ ０２４􀆰 １９ １１􀆰 ２１７ ７２ ０􀆰 ０００ ４ ∗∗
Ａ １ １５８ ７７４ １ １ １５８ ７７４ －２９１􀆰 ２９ ５８􀆰 ７７１ １２ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
Ｂ １６ １３４􀆰 ７２ １ １６ １３４􀆰 ７２ －３４􀆰 ３７ ０􀆰 ８１８ ３２７ ０􀆰 ３８６ ９
Ｃ ４０ ２８３􀆰 ６９ １ ４０ ２８３􀆰 ６９ －５４􀆰 ３１ ２􀆰 ０４３ １２４ ０􀆰 ０３３ ４ ∗
ＡＢ ２７７ ８３ １ ２７ ７８３ －５８􀆰 ９３ １􀆰 ４０９ １０９ ０􀆰 ２６２ ６
ＡＣ ３ ０７１􀆰 １２６ １ ３ ０７１􀆰 １２６ －１９􀆰 ５９ ０􀆰 １５５ ７６３ ０􀆰 ７０１ ４
ＢＣ ５ ６８１􀆰 ８４ １ ５ ６８１􀆰 ８４ －２６􀆰 ６５ ０􀆰 ２８８ １７４ ０􀆰 ６０３ １
Ａ２ ６４ ０８８􀆰 ２８ １ ６４ ０８８􀆰 ２８ －６６􀆰 ６９ ３􀆰 ２５０ ４５４ ０􀆰 ０４１ ６ ∗
Ｂ２ ５９９ １７６􀆰 ５ １ ５９９ １７６􀆰 ５ ２０３􀆰 ９０ ３０􀆰 ３８９ ２６ ０􀆰 ０００ ３ ∗∗
Ｃ２ １５ ３０２􀆰 ７５ １ １５ ３０２􀆰 ７５ －３２􀆰 ５９ ０􀆰 ７７６ １３１ ０􀆰 ３９９ ０
残差 １９７ １６７􀆰 ２ １０ １９ ７１６􀆰 ７２
缺失度 １９４ １７０􀆰 ３ ５ ３８ ８３４􀆰 ０７ ６４􀆰 ７９１ ８７ ０􀆰 ５７２ ９
纯误差 ２ ９９６􀆰 ８３２ ５ ５９９􀆰 ３６６ ４
总变异 ２ １８７ ７５７ １９
　 注：Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９０９ ９； ＳＳ为平方和； ＤＦ为自由度； ＭＳ为均方； ＣＥ为系数预测。 ∗∗表示在 ９９％置信度下显著；∗表示在 ９５％置信度下显著。
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
　 　 利用软件 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ７􀆰 ０对表 ５的实验数据
进行响应曲面拟合，结果见图 ２。 由图 ２可知：ｐＨ和牛
肉粉交互作用不显著，牛肉粉用量和一水合柠檬酸用
量、一水合柠檬酸用量与 ｐＨ之间交互作用显著。 由软
件对模拟出的响应曲面进行分析，发现回归方程存在
稳定点（极大值点）。 对响应曲面立体图形进行岭嵴分
析（ｒｉｄｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ），得到极大值点所对应的各主要因素
预测的实际值分别是：牛肉粉用量、ｐＨ和一水合柠檬
酸用量，分别为 １０ ｇ ／ Ｌ、７􀆰 ２和 ２􀆰 １６ ｇ ／ Ｌ，此时的响应值
最大，发酵产物 α 蒎烯质量浓度为 ７􀆰 ０７８ ｍｇ ／ Ｌ。
图 ２　 牛肉粉、Ｃ６Ｈ８Ｏ７·Ｈ２Ｏ和 ｐＨ响应面分析曲面图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌｏｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α⁃ｐｉｎｅｎｅ
２􀆰 ４　 回归模型验证
用以上确定的主要因素用量配制发酵培养基，
进行 ３次平行试验，得到的产物质量浓度平均值是
７􀆰 ０５３ ｍｇ ／ Ｌ，和预测值 ７􀆰 ０７８ ｍｇ ／ Ｌ 高度基本一致
（相似性达 ９９􀆰 ６％），说明响应面分析法可靠性较
高，与实际情况拟合良好。 通过培养基组分的优
化，ＹＪＭ２８发酵的 α 蒎烯产量从 １􀆰 ７１０ ｍｇ ／ Ｌ 提高
到 ７􀆰 ０５３ ｍｇ ／ Ｌ，约提高了 ３倍。
３　 结　 论
采用响应面法对影响菌株 ＹＪＭ２８发酵水平的 ８
个因素进行优化，所得结论如下：
１）经过 Ｐ Ｂ 实验设计法筛选出 ３ 个影响因
素，牛肉粉、一水合柠檬酸和培养基初始 ｐＨ；
２）然后用最陡爬坡实验法接近 ３ 个重要因素
的最优水平，发现最优水平将出现在牛肉粉 １２ ｇ ／ Ｌ，
培养基初始 ｐＨ ７􀆰 １，一水合柠檬酸 ２􀆰 ５２ ｇ ／ Ｌ附近；
３）最后用 ＣＣＤ 设计和响应曲面分析法确定重
要因素的最佳水平，即：牛肉粉 １０ ｇ ／ Ｌ，培养基初始
ｐＨ ７􀆰 ２，一水合柠檬酸 ２􀆰 １６ ｇ ／ Ｌ；
４）经过上述方法得到最佳发酵培养基条件：牛
肉粉 １０ ｇ ／ Ｌ，培养基初始 ｐＨ ７􀆰 ２，一水合柠檬酸
２􀆰 １６ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，柠檬酸铁铵 ０􀆰 ４５ ｇ ／ Ｌ，
甜菜碱 ０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ９􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ，优化后产
物 α 蒎烯产量从最初的 １􀆰 ７１０ ｍｇ ／ Ｌ 提升到 ７􀆰 ０５３
ｍｇ ／ Ｌ，产量增加了 ３倍左右。
结果表明，通过优化菌株 ＹＪＭ２８ 发酵培养基，
α 蒎烯产量提升明显，说明响应面法优化 ＹＪＭ２８
发酵培养基方法可行，效果显著，为后续的进一步
优化和放大提供了理论基础。 但是优化后的 α 蒎
烯产量离工业化要求相差甚远，后期可能围绕发酵
条件或者菌株本身开展研究，以进一步提高 α 蒎
烯产量。
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（责任编辑　 周晓薇）
２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷