全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
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KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$$7
收稿日期"#$%$ 6%$ 6$0
基金项目"国家自然科学基金资助项目#%$$80$%7$(华南农业大学博仕奥科学基金资助项目
作者简介"梁娟然#%!!$%$&女&广东佛山人&本科生&研究方向"酶学与酶工程(黄卓烈#联系人$&教授&博士生导师&@FPBQE"<=IDEQJ=f(HBI*JKI*HC
纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的
动力学行为和光谱学变化
梁娟然& 戴菲辉& 苏思莹& 黄卓烈
#华南农业大学 生命科学学院&广州 %$70#$
摘"要"为了探索二甲基亚砜对纤维素酶催化活性的影响&以羧甲基纤维素钠#9` 9$为底物来研究纤维素酶纯酶
在二甲基亚砜中的动力学变化)紫外吸收光谱)紫外差示光谱和荧光发射光谱 实验表明"在 &g的二甲基亚砜中&
纤维素酶的催化活性下降了 07*83g(其B
P
值从缓冲液中的 #j$$ PM:PU上升到二甲基亚砜中的 &j!## PM:PU(
在二甲基亚砜中&酶分子的肽键紫外吸收稍有改变&但其氨基酸基团的紫外吸收没有改变(其紫外差示光谱出现明
显的正峰和负峰(其荧光发射光谱没有改变 研究结果证明"二甲基亚砜通过轻微改变酶分子的肽链结构&使分子
构象改变&导致酶分子对底物的亲和力下降&从而降低其催化活性
关键词"纤维素酶(二甲基亚砜(动力学(光谱分析
中图分类号"+""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$#! 6$0
L./0E.:15/H190:E43J:-5/;0127:0636510./H.J0E-M613672G.H01263E.2/
U,Y-WTIBCOBC& Y^,[JQ=IQ&4S4QXQCM&.SY-WV=IDEQJ
#9DEJMJDNUQNJ4HQJCHJ& 4DIA= 9=QCBYMOQHIEAIOBESCQZJO(QAX& WIBCM<=DI %$70#& 9=QCB$
*K1E45:E"4DKQIPHBO;DGXPJA=XEHJEIED(J#9` 9$ LB(I(JK B(A=J(I;(AOBAJADQCZJ(AQMBAJA=JH=BCMJ(DN
cQCJAQH(& S2B;(DO)AQDC ()JHAOB& S2FKQNJOJCAQBE()JHAOB& BCK NEIDOJ(HJCHJJPQ((QDC ()JHAOBDNA=J
JCHOJB(JK ;X07j83g QC &g (DEIAQDC*B
P
ZBEIJOD(JNODP#j$$ PM:PUQC )=D()=BAJ;INJOAD&j!##
PM:PUQC &g ^` 45*S2B;(DO)AQDC DN)J)AQKJ;DCK(H=BCMJK (EQM=AEX& ;IAA=JS2B;(DO)AQDC DNBPQCD
BHQK >=J& dXO& BCK dO) KQK CDAH=BCMJ*d=JS2KQNJOJCAQBE()JHAOBDNHJEIEB(JQC ^` 45(DEIAQDC
(=DLJK CJMBAQZJBCK )D(QAQZJ)JBc(*d=JNEIDOJ(HJCHJJPQ((QDC ()JHAOBDNHJEIEB(JKQK CDAH=BCMJQC ^` F
45(DEIAQDC*,ALB()ODZJK A=BAKQPJA=XE(IENDGQKJHDIEK H=BCMJA=J(AOIHAIOJDN)J)AQKJH=BQC(ADAOBC(F
NDOPA=JHDCNDOPBAQDC DNHJEIEB(JPDEJHIEJ(*d=I(QAKJHOJB(JK A=JBNQCQAXDNA=JJC(AOBAJBCK KJHOJB(JK A=JHBABEXAQHBHAQZQAXDNA=JJCL0M I24H1"HJEIEB(J( KQPJA=XE(IENDGQKJ( cQCJAQH(( ()JHAOBEBCBEX(Q(
""纤维素酶#HJEIEB(J$是一种能够降解纤维素生
成葡萄糖的酶 自从科学家在蜗牛消化液中发现
纤维素酶后&人们对其做了大量的研究&特别是自
#$ 世纪 3$ 年代以来&对纤维素酶的基础和应用研
究都取得了很大的进展 目前&该酶在酿造工业)
饲料生产)纺织工业)牛仔裤产品的洗涤和加工等
领域的应用非常广泛
近年来&有机溶剂对酶分子的稳定性和催化活
性的影响受到人们的极大重视 很多人在此方面
进行了卓有成效的探索&使该领域的理论研究和实
际应用都取得了重大进展*% 63+ 不同的有机溶剂对
不同酶的影响效果有较大的差异
二甲基亚砜是一种常见的有机溶剂&其应用很
广泛 为了探索二甲基亚砜对酶的催化作用是否
有影响&本研究在最适温度和最适 ).的条件下&以
羧甲基纤维素钠#9` 9$为底物&研究纤维素酶在二
甲基亚砜微扰条件下的反应特性)催化动力学及其
紫外吸收光谱)紫外差示光谱和荧光发射光谱&以
揭示在二甲基亚砜微扰条件下酶的催化活力)酶分
子构型及构象变化规律&探索纤维素酶在二甲基亚
砜微扰条件下催化反应的可能作用性质
C?材料与方法
CNC?实验材料
纤维素酶&从日本进口的绿色木霉#L*247&%#*+
12*2%#>JO(*JG[O$中提取的纯酶
考马斯亮蓝W#$)考马斯亮蓝 b#$)牛血清蛋
白)9` 9&美国 4QMPB公司产品(二甲基亚砜)&&
二硝基水杨酸# -^4$以及其他试剂为国产分析纯
CN@?实验方法
%$蛋白质含量测定"参照 \OBKNDOK*!+的考马斯
亮蓝W #$ 法进行
#$纤维素酶活性的测定"以 $j%g9` 9溶液为
底物&纤维素酶在 ).j$)$j%PDE:U磷酸缓冲液
#>\4$中水解底物 9` 9产生的还原糖&能在碱性条
件下将 -^4还原&生成棕红色的氨基化合物&此氨基
化合物在 0$ CP波长处有最大吸收 测定其光吸收
值并与标准曲线比较&计算纤维素酶活性 在此条件
下纤维素酶催化 9` 9形成 % PM葡萄糖定为 % 个活
性单位#S$ 酶的催化活性用比活性#S:PM$表示
&$纤维素酶的电泳鉴定"利用聚丙烯酰胺凝
胶电泳法#>YW@$鉴定纤维素酶的纯度 电泳浓缩
胶质量分数为 0g&分离胶质量分数为 8g 电泳后
用考马斯亮蓝b #$ 溶液染色
0$纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的反应
动力学测定"在一定浓度的二甲基亚砜存在下&测
定纤维素酶在不同底物浓度下的反应速率&用双倒
数作图法求出反应的B
P
和1
PBG

$纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的光谱
研究"纤维素酶的紫外吸收光谱和差示光谱用日
本产.QABH=QS&$%$ 型光谱仪测定(荧光发射光谱用
日本产.QABH=Q[ 0$$ 型荧光光谱仪测定
@?结果与讨论
@=C?纤维素酶的电泳鉴定
用>YW@法鉴定纤维素酶的纯度&结果见图 %
由图 % 可见"在 Y和 \泳道上都出现一条蛋白带&
说明此酶达到电泳纯度&可以用于催化动力学和分
子光谱学测定
Y)\%泳道(6%负极(/%正极
图 C?纤维素酶的电泳图谱
U.;=C?a.5;45J27:0636510./060:E429-2401.1
图 @?二甲基亚砜对纤维素酶活性的影响
U.;=@?#70:E27H.J0E-M613672G.H02/:06365105:E.W.EM
@=@?纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的催化活
性和反应动力学
""二甲基亚砜浓度对纤维素酶活性的影响如图 #
所示 从图 #可以看出"%g的二甲基亚砜明显降低
了纤维素酶的活性 随着二甲基亚砜浓度的升高&纤
维素酶活性受抑制的变化不大&基本处于平稳状态
当质量分数为 &g时&酶活性比对照下降了 07j83g
说明二甲基亚砜对纤维素酶有极大的抑制作用&低浓
度的二甲基亚砜就可以使酶活性急剧下降
图 &为纤维素酶在缓冲液中的反应动力学曲线&
其中
"
为底物质量浓度&1为反应速率 从图 & 可以
$& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
看出"根据双倒数作图法求出纤维素酶的B
P
为 #j$$
PM:PU&1
PBG
为$j8!
"
M:#
"
M!PQC$ 图0为纤维素酶
在 &g二甲基亚砜中的反应动力学曲线 根据双倒
数 作 图 法 可 求 得 B
P
为 &j!## PM:PU& 1
PBG
为
%j#70
"
M:#
"
M!PQC$ 与在缓冲液中的情况相比&纤
维素酶在二甲基亚砜体系中的 B
P
和 1
PBG
都升高了
说明二甲基亚砜对纤维素酶活性的抑制作用主要是
降低了酶与底物的亲和力所致
图 O?纤维素酶在缓冲液中的反应动力学曲线
U.;=O?,0636510b./0E.:1:34W0./9-219-5E0K3704
图 P?纤维素酶在二甲基亚砜中的动力学曲线
U.;=P?L./0E.:1:34W027:0636510./H.J0E-M6
13672G.H01263E.2/
@NO?纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的光谱
#j&j%"纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的紫外
吸收光谱
纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的紫外吸收
光谱如图 )图 7所示 从图 可以看出"纤维素酶在
波长 #87 CP处出现了第 %个吸收峰&在 ##$ CP处出
现第 #个吸收峰&并且吸收强度比第一吸收峰小 图
7为将酶在 &g二甲基亚砜中的各波长的吸收值扣除
了纯 &g二甲基亚砜中的吸收值后所得到的光谱图
由图 7可知"纤维素酶在 &g的二甲基亚砜中&第一吸
收峰基本没发生变化&而原先 ##$ CP处的吸收峰分
解成 #个峰&其一是在 ## CP处形成的小尖峰&其二
是在 #$3 CP处形成的另一个峰 由图 7 还可知"在
二甲基亚砜存在下&酶分子的立体构象发生改变&导
致吸收光谱有所变化
图 Q?纤维素酶在缓冲液中的紫外吸收光谱
U.;=Q?*K1249E.2/190:E43J27:0636510./K3704
图 R?纤维素酶在二甲基亚砜中的紫外吸收光谱
U.;=R?*K1249E.2/190:E43J27:0636510./
H.J0E-M613672G.H0
一般地&蛋白质的紫外吸收光谱在 #3$ h#!$ CP
及 #$$ h#& CP两处各有 %个吸收峰 #$ CP左右是
低谷(#3$ h#!$ CP的峰是酪氨酸#dXO$和色氨酸#dO)$
的侧链所引发(#8 CP的峰是苯丙氨酸#>=J$所引发(
#$$ h#& CP处的峰是由肽键的吸收所引起*%$ 6%%+ 纤
维素酶在#87和##$ CP处各有%个吸收峰 在二甲基
亚砜溶液中&纤维素酶在 #87 CP处的吸收峰没发生变
化&说明其紫外吸收基团没有变化 但是在 ##$ CP的
吸收峰分裂成为 #个小峰&说明二甲基亚砜的存在稍
微改变了纤维素酶肽键的共价结构
#j&j#"纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的紫外
差示光谱
图 8为纤维素酶在 &g二甲基亚砜溶液中的紫
外差示光谱 紫外差示光谱的变化能进一步反映酶
与dXO及dO)残基有关的构象变化*%#+ 从图 8 可以
看出"光谱曲线出现了明显的正峰#虚线上方$和负
峰#虚线下方$ 这说明在二甲基亚砜存在时&二甲
基亚砜会使纤维素酶分子的构象发生变化 酶分子
中dO))dXO)>=J所处的空间位置发生了改变&也就是
%&"第 # 期 梁娟然等"纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的动力学行为和光谱学变化
酶分子主链的构象发生了变化 若酶分子构象改变
太大&对催化不利&从而引起酶活性的下降
图 Y?纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的紫外
差示光谱
U.;=Y?13672G.H01263E.2/
#j&j&"纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的荧光
发射光谱
图 3为纤维素酶在缓冲溶液中荧光发射光谱 从
图 3可以看出"其发射主峰在 &7#j3 CP处&在#3 CP处
有 %个小峰 图 !为纤维素酶在 &g二甲基亚砜中的
荧光发射光谱 从图 ! 可以看出"酶的特征发射峰还
是在&7#j3 CP附近&峰形与图3的基本相同&只是荧光
强度有所升高而已 这说明在二甲基亚砜存在下&纤
维素酶分子的荧光基团基本没有改变&还是保持天然
的状态 这就说明二甲基亚砜的存在没有大幅度改变
纤维素酶的分子构型
图 ]?纤维素酶在缓冲液中的荧光发射光谱
U.;=]?U632401:0/:00J.11.2/190:E43J27:0636510./K3704
O?结论
纤维素酶在 &g二甲基亚砜中酶活性下降了
07j83g&说明二甲基亚砜对纤维素酶的抑制作用明
显&能使纤维素酶的活力急剧下降 动力学研究结
果表明"在二甲基亚砜中纤维素酶的 B
P
值升高了
说明在二甲基亚砜中&酶对底物的亲和力下降了
B
P
值的变化可能是由有机物与酶底物结合部位构
图 >?纤维素酶在二甲基亚砜微扰条件下的荧光
发射光谱
U.;=>?U632401:0/:00J.11.2/190:E43J27:0636510./
H.J0E-M613672G.H01263E.2/
象的变化引起的 但是&本实验结果也表明&在二
甲基亚砜作用下&纤维素酶的 1
PBG
也提高了 对这
种现象的解释有赖于以后进一步的实验研究
综上所述&在二甲基亚砜的存在下&纤维素酶
的分子构型没有太大的变化&但是酶分子的立体构
象却大大改变了 这样就使酶分子B
P
值升高&对底
物的亲和力下降&进而导致其催化活性下降
参考文献"
* % +" D^CMY& J`XJOT^ &_JCKOQHc \4&JABE*@NJHADN(JHDCKBOX(AOIHF
AIOJDC A=JBHAQZQAXDNJCYOH=QZJ(DN\QDH=JP\QD)=X&%!!7&&&0 ##$"0$7F0%0*
* # +"WOQJ;JCDL_&_EQ;BCDZY *`9BC HDCNDOPBAQDCBEH=BCMJ(;JOJF
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* 7 +"4JOJ;OXBcDZBUd&VDOQC -Y&_BOXBcQC YY*,P)ODZJPJCADN
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* 3 +"4EXAQHBHAQZQAXDNH=JPQHBEXPDKQNQJK )B)BQC QC BaIJDI(DOMBCQH
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