全 文 ：第6卷第2期
2008年3月
生物加工过程
ChineseJournalofBioproeessEngineering
Mar．2008
· 17 ·
代谢途径酶活促进剂对番茄红素发酵的影响
解书怀，余晓斌，顾秋亚
(江南大学 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：考察了几种代谢途径中关键酶活促进剂对番茄红素发酵的影响。通过添加代谢途径中HMg—CoA还原酶
与MVA激酶酶活促进剂，提高类胡萝卜．紊前体物质的生物合成，从而促进三孢布拉霉茵合成番茄红素的能力。实
验结果表明，发酵24h分剐加入质量分数o．05％的某醇及其代谢产物A、1m#L的青霉素和质量分数0．1％p-紫
罗酮，番茄红素的产量分别提高了31％，32％及35％，最大产量达到1．54g／L。
关键词：三孢布拉氏霉；番茄红素；异戊二烯焦磷酸；促进剂
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0017一05
Enhancementoflycopeneproductionbyblakesleatrispora
usingcarotenoidbiosyntheticenzymepromoter
‘
XIEShu-huai，YUXiao-bin，GUQiu-ya
(TheKeyLaboratoryofIndustrialB otechnologMinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Studyontheeffectofdifferentofkeyenzymepromotersoflyc penebiosyntheticonlycopenefer-
mentation．AdditionofHMG·CoAreductaseactivityandMVAkinasepromotertofermentationmedium
werer cognizedasamethodofenhancingisoprenoidsynthesisandpromotinglycopeneyieldbyBlakeslea
trisporafermentation．Theresultofassaysindicatedthatwhena alcoholanditsmetabolitesA(0．05％)，
beta—ionone(0．1％)andPenicillin(1mg／L)wereadd dtotheone—dayoldcultureofBlakeskatrispora，
theproductionoflycopenewere31％，32％and35％，whichwereigherthanthosewithoutadditives，
respectively，themaximumyieldoflyeopenereached1．54g／L．
Keywords：Blakesleatrispora；lycopene；Isoprenoid；promoter．
在所有的类胡萝卜素中，番茄红素是最强的单
线态氧淬灭剂，具有抗氧化、防紫外辐射等功能，且
对前列腺癌、乳腺癌以及胰腺癌等癌症的癌细胞具
有抑制作用，对血管硬化和冠心病均有防治作用，
因而其在食品、化妆品以及医药领域具有重要
用途‘1|。
通过大量研究，人们已基本上搞清楚了类胡萝
卜素生物合成的主要途径L2。3J。在真菌中其生物合
成途径如图1所示。
提高番茄红素产量的方法很多，据文献报
道【4J：添加氧载体及表面活性剂可提高发酵过程中
氧的传递，增加摇瓶中溶解氧浓度，从而增加三孢
布拉霉发酵生产番茄红素的产量，而这些促进剂只
能在不改变菌体生理代谢特性的基础上一定程度
收稿日期：2007-07-26
基金项目：教育部长江学者与创新团队发展计划资助项目(IRT0532)；江南大学青年基金资助项目(101000-52210468)
作者简介：解书怀(1983一)，男，湖北荆州人，硕士研究生，研究方向：发酵工学。
联系人：余晓斌，教授，E—mail：xbyu@jiangnan．edu．cn
万方数据
· 18· 生物加工过程 第6卷第2期
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地提高类胡萝卜素的生物量，并不能从本质上使类
胡萝卜素的合成得以提高。在类胡萝卜素生物合
成途径中，HMG—CoA还原酶催化HMG-CoA形成甲
羟戊酸(MVA)，由于MVA的形成是一个不可逆过
程，因此，HMG—CoA还原酶被认为是动物、植物、真
菌可能也是昆虫的类异戊二烯代谢途径的一个限
速酶哺]。许多研究者都报道【6—7J，异戊二烯生物合
成途径的诱导，尤其是倍半萜类物质的合成，与
HMG—CoA还原酶活性成正相关。在类胡萝卜素生
物合成途径中，青霉素可以刺激MVA激酶酶活，从
而可以增加类胡萝卜素前体物质异戊二烯焦磷酸
(IPP)的合成，提高番茄红素的产量，但目前国内没
有具体实验证明。卢一紫罗酮作为三孢布拉霉正负菌
性激素三孢酸的结构类似物，对番茄红素发酵具有
明显的诱导作用。本文在此基础上考察添加试剂
A、青霉素及／3一紫罗酮对三孢布拉霉发酵生产番茄
红素的影响。
1材料与方法
1．1 菌株
三孢布拉霉(Blakesleatrispora)由本实验室
保藏。
1．2培养基
种子培养基黄豆粉23g／L，玉米粉47g／L，
KH2P040．5g／L，VBl0．002g／L，pH6．3。
发酵培养基黄豆粉44g／L，玉米粉19g／L，
KH2P045．5g／L，VBl0．002s／L，MgS041 g／L，柠檬
酸O．8g／L，pH7．5。
1．3培养条件
250mL三角瓶装液量20mL，接种量10％(正
负菌接种比例1：30)，转速200r／min，27℃培养
5 d。
1．4测定方法
1．4．1菌体干质量测定45℃真空干燥，恒质量
后称量。
1．4．2番茄红素测定紫外分光光度计，502nm
条件下测定吸光值。
2实验结果与讨论
2．1试剂A添加时间对发酵的影响
图2所示为在番茄红素发酵过程中(O，12，24，
36，48，60，72，84，96，108h)添加0．15％的试剂A
对发酵的影响。实验结果如图2所示。
，
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●
芒
咖
瞧
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留
疑
≮
图2试剂A不同添加时间对番茄红素发酵的影响
Fig．2EffectsofreagemAadditiontimeonthe
productionoflycopene
图2表明：(1)在O一48h内，番茄红素的产量、
三孢布拉霉干质量均与试剂A的加入成正相关性。
原因可能是试剂A提高了HMG．CoAreductase酶活，
使类胡萝卜素合成的代谢流增加，三孢布拉霉菌体蛋
白合成也随之加快，而番茄红素为胞内代谢产物，随
着菌体量的合成，番茄红素产量也随之增加。这与图
2结论相符。与空白1．1s／L的番茄红素产量相比，
在发酵第一天加入0．15％的试剂A可以使番茄红素
产量提高26％，达到1．39g／L。(2)发酵48h后，试
剂A的加人对菌体与番茄红素的合成影响不大。因
为发酵48h后，三孢布拉霉正处于稳定生长期，菌体
生长基本已经完成。故试剂A的加入对菌体量与番
一l-1．∞董g＆。。鲁q
加：2
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万方数据
2008年3月 解书怀等：代谢途径酶活促进剂对番茄红素发酵的影响 ·19·
茄红素的合成作用并不明显。
2．2试剂A不同添加量对发酵的影响
图3为在发酵24h后向发酵液中添加不同质
量分数(o，0．05％，0．10％，0．15％，0．20％，0．25％)
的试剂A对发酵的影响。
图3试剂A不同添加量对番茄红素发酵的影响
Fig．3EffectofreagentAconcentrationonthe
productionoflyeopene
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由图3可知：在发酵24h向发酵液中添加质量
分数0．05％的试剂A，相对于空白，菌体量的合成
由96g／L提高到120g／L，提高了25％，而番茄红素
的产量则由1．14s／L提高了31％，最大值达到
1．49s／L。番茄红素的合成随着菌体量的增加而
增加。
2．3青霉素不同加入时间对发酵的影响
图4所示为在发酵过程中(0，12，24，36，48，60，
72，84，96，108h)添加1mg／L的青霉素对发酵的
影响。
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图4青霉素不同添加时间对番茄红素发酵的影响
Fig．4EffectsofPenicillinadditiontimeonthe
productionoflyeopene
由图4可以得出，接种时加入青霉素番茄红素
的产量反而降低，随着发酵进行，从发酵后24h开
始，加入青霉素均能提高番茄红素的产量，而且在
发酵24h加入时相对于空白的1．1g／L番茄红素的
产量提高了30％，达到最大值1．43g／L，但对菌体
合成量影响不大。原因可能是青霉素能显著提高
MVA(3-甲基3，5-二甲基戊酸)激酶活性且不影响
总蛋白质及碳水化合物的合成[8】，使类胡萝卜素前
体物质IPP的合成增加，从而使番茄红素的产量
增加。
2．4青霉素不同添加量对发酵的影响
在发酵第一天分别向发酵液中添加量为：O．50，
0．75，1，1．25，1．5mg／L的青霉素，以确定青霉素的
最佳添加量。实验结果见图5。
图5不同青霉素浓度对番茄红素发酵的影响
Fig．5EffectofPenicillinconcentrationonthe
productionoflycopene
实验表明，在发酵后第24h向发酵液中添加
I mg／L的青霉素，番茄红素产量提高最大，相对于
空白实验1．05g／L，提高32％，达到1．39g／L。从
图5可以看出：随着青霉素从0．5mg／L增加到1
mg／L，番茄红素的产量也随着增加。但随着青霉素
浓度继续增加，番茄红素产量不仅没有提高反而有
所下降，原因可能是高浓度的青霉素对菌体有一定
毒害作用或者对代谢过程中关键酶具有抑制作用，
抑制了类胡萝卜素生物合成。因为青霉素并不影
响总蛋白质及碳水化合物的合成，所以对菌体的合
成作用并不大，只是增加了单位菌体合成番茄红素
的能力。 ，
2．5 JB一紫罗酮不同添加时间对发酵的影响
在三孢布拉氏霉菌发酵过程中，届一紫罗酮作为
性激素——三孢酸的结构类似物，在发酵过程中添
加，可以诱导类胡萝卜素的合成【9J。在本实验过程
中，考察了发酵不同时间添加届．紫罗酮对番茄红素
合成产量的影响。实验数据表明，在发酵0d向发
酵液中添加口-紫罗酮，菌体合成类胡萝卜素水平受
到阻断，菌体颜色全为淡黄色。原因可能是在发酵
第0天加人口一紫罗酮，其对三孢布拉霉具有毒害作
用，影响了菌体生理代谢，从而使类胡萝卜素合成
受阻。在发酵4d内每隔12h向发酵液中添加口．
一I-1．∞)，一稠蜒巾霉导一q
Ⅲ线瑚舳∞柏加。
一I．1．∞≤g争。．c％
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万方数据
·20· 生物加工过程 第6卷第2期
紫罗酮，实验结果如图6所示。
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0．050％的试剂A，1m#L的青霉素与质量分数
0．100％的B一紫罗酮，在相同条件下培养120h，在
发酵120h内，三孢布拉霉菌体量，番茄红素产量，
实验数据表明：相对于空白对照，发酵24h加
入卢一紫罗酮，菌体量由90g／L提高到101g／L，提高
了12．2％，而番茄红素产量则由1．1g／L提高了
35％，达到1．49g／L，促进作用相当明显。
2．6 p一紫罗酮不同添加量对发酵的影响
在发酵第一天向发酵液中添加质量分数为：
0．025％，0．050％，0．100％，0．150％和0．200％的
卢一紫罗酮，考察不同浓度对发酵的影响。实验结果
如图7所示。
w(3一紫罗酮)，％
图7不同口一紫罗酮添加量对发酵的影响
Fig．7Effectofbeta-iononeconc ntration
ontheproductionoflycopene
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实验表明：在发酵第一天向发酵液中添加质量
分数0．100％的口一紫罗酮番茄红素产量提高最大，
相对于空白的1．14g／L提高了28％达到1．46g／L。
卢一紫罗酮作为三孢布拉霉发酵生产类胡萝卜素的前
体物质，其结构类似三孢酸，主要作用在于在三孢
布拉霉正负菌之间起到诱导作用。实验也表明，B一
紫罗酮最佳添加量为质量分数0．100％，过高的浓
度反而影响番茄红素的发酵。
2．7三种促进剂对发酵的复合影响
在发酵后24h同时向发酵液中加入质量分数
108 132
图8发酵过程曲线
Fig．8Fermentationprocesscurve
120
100—
80誓
60怒
柏鲁H-
20雹
q
O
’从图8可以看出，在发酵过程中，随着摇瓶培养
时间的延长，菌丝体量不断增加，到第96h达到最
大值，菌丝体干质量为114g／L，再继续培养，菌丝体
于质量下降。发酵液中番茄红素产量随着培养时
间的延长，开始合成，在第120h达最大值，质量浓
度为1．54g／L，此后产量呈下降趋势。还原糖含量
随着发酵进程不断下降，且下降幅度很大，在48h
以后，还原糖含量又开始回升一些，然后又开始下
降。发酵液的pH从一开始下降，到发酵后期pH有
点回升，但幅度不是很大。由摇瓶培养的发酵过程
曲线可以看出，在三种促进剂同时添加时，在发酵
48h时，三孢布拉霉菌株合成番茄红素的生产强度
和生产能力明显得到很大的提高，为工业化发酵生
产番茄红素提供了一定的经济基础。
3结论
(1)添加试剂A，刺激三孢布拉霉类胡萝卜素
合成代谢途径中试剂A代谢，使HMG—CoA还原酶
酶活提高两倍，实验结果表明：在发酵第一天添加
质量分数0．050％的试剂A，可使番茄红素产量提
高31％，最大达到1．49g／L。
(2)添加青霉素，青霉素的存在使MVA(3一甲基
3，5一二甲基戊酸)激酶活性增加了2倍，使类胡萝卜
素前体物质IPP合成增加，有利于代谢流向番茄红
素合成转移。实验表明：在发酵后第一天添加1
mg／L的青霉素，番茄红素产量提高32％。
(3)在发酵后第一天添加质量分数0．100％的
一．-1
6
4
2i
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2008年3月 解书怀等：代谢途径酶活促进剂对番茄红素发酵的影响 ·2l·
农业剩余物将变身造纸纤维和生物化学品
世界领先的林产品集团之一芬欧汇川集团与Chempolis公司签署技术特许协议，利用一项新技术生产
造纸纤维和生物化学产品。从此，农业生产所产生的剩余物连同其他非木材原料，如秸秆、麦草、芦苇等都
将作为原材料用于生产纸浆和生物化学产品。
Chempolis公司是一家芬兰科技公司。该公司研制的这项农业剩余物综合利用专利技术，不使用含硫或
含氯的化学品。因此，这一新方法的最大环保优势在于低水耗、低温室气体排放和工业生产对环境影响的
最小化。
全球最大畜禽类沼气发电厂在内蒙古投产
目前全球最大的畜禽类沼气发电厂在内蒙古正式投产发电。该电厂由内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有
限公司投资4500万元建设，年发电量可达l×107kW·h。
新建成的沼气发电厂可实现日处理牛粪280t，牛尿54t和冲洗水360t。该项目可Et生产沼气1．2万
m3，日发电3×104kW·h，每年生产有机肥约20万t。
(张春鹏)
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