全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 189~192 189
收稿 2010-09-16 修定 　2010-12-01
资助 河南省烟草专卖局科技计划项目(20 0 81 2 2 5)。
* 通讯作者(E-mail: liuweiqun2004@126.com; Tel: 0371-63555153)。
温度与光照强度对烤烟番茄红素 β-环化酶基因表达的影响
贾峰 1, 徐文 2, 刘卫群 1,2,*, 王彦伟 2
河南农业大学 1国家烟草栽培生理生化重点实验室, 2生命科学学院, 郑州 450002
摘要: 选用水培烤烟叶圆片, 在 3种温度、3种光照及其交互作用的正交试验处理下进行试验, 检测了Lyc-β基因表达的结
果表明: 光照是影响Lyc-β基因表达的主要因子, 其次为温度, 最后是温度和光强交互作用。光照时间试验结果表明, Lyc-β
基因的表达在光照处理6 h时达到峰顶之后开始下调。
关键词: 烤烟; 番茄红素β-环化酶基因; 正交试验设计; 温度; 光照强度
Effects of Temperature and Light Intensity on Expression of Lycopene Cyclase
Gene in Tobacco (Nicotiana tabacum L.)
JIA Feng1, XU Wen2, LIU Wei-Qun1,2,*, WANG Yan-Wei2
1National Key Lab of Tobacco Culture and Physiology and Chemistry, 2College of Life Sciences, Henan Agricultural University,
Zhengzhou 450002, China
Abstract: In this research, the tobacco leaf discs were treated with three different temperatures and three
different light intensities using orthogonal experiment. The results of the expression of Lyc-β gene indicated that
the key factor affecting the expression of Lyc-β was light, followed by temperature, and then interactions of
temperature with light. Moreover, the results of light experiment showed that the expression of Lyc-β increased
to the highest point after 6 hours’ light-treatment, and then down-regulated.
Key words: tobacco; lycopene cyclase gene (Lyc-β); orthogonal experiment design; temperature; light intensity
番茄红素 β-环化酶(lycopene cyclase, Lyc-β)
催化对称的线状番茄红素分子在两端形成两个 β-
紫罗酮环, 形成β-胡萝卜素; 而番茄红素 ε-环化酶
是个单环化酶, 需要和番茄红素 β-环化酶共同作
用, 形成一个β环和一个 ε环的α-胡萝卜素和叶黄
素等(Cunningham和Gantt 1998; Isaacson等 2002;
Park等 2002), 因此, 番茄红素 ε-环化酶是类胡萝
卜素合成的关键酶。Ye等(2000)把番茄红素 β-环
化酶基因(Lyc-β)导入水稻, 使本来不含类胡萝卜素
的水稻胚乳中合成 4种类胡萝卜素。Dharmapuri
等(2002)把Lyc-β基因转入番茄, 可使番茄果实中的
类胡萝卜素增加近 10倍。表明 Lyc-β基因高表达
能够显著提高类胡萝卜素的生物合成。
在烤烟中, 类胡萝卜素是烟叶主要致香成分的
前提物(Cunningham等 1996; 杨虹琦等 2004; 王能
如等2009), 是形成不同烤烟香气的物质基础(周冀
衡和张建平 2008)。研究表明, 温度和光照对植物
类胡萝卜素合成有明显影响(Giuliano等1993; 朱长
甫等 2004), 但关于温度与光照强度及二者交互作
用对 Lyc-β基因表达的影响鲜有报道。本文以烟
草叶圆片为试材, 利用正交试验设计探讨温度与光
照强度及二者交互作用对 Lyc-β基因表达的影响,
为从分子水平揭示温度和光照与类胡萝卜素合成的
关系提供参考。
材料与方法
实验材料为烟草(Nicotiana tabacum L.)品种
‘K326’。采用漂浮育苗至 6叶期时, 移入Haogland
营养液中。水培 10周时, 在上午 11:00取 5株发
育一致的第 13~14片烟叶(从下向上数), 避开主脉
随机打孔取直径 1 cm的叶圆片, 用清水清洗 2遍,
放入参照Masclaux等(2005)方法配制的缓冲液(10
mmol·L-1 Mes, pH 6.5、40 mmol·L-1 KCl、10 mmol·
L-1 CaCl2)中分别进行实验, 试验重复 4次。
植物生理学报190
温度与光照强度的试验因子及水平见表 1。9
个实验处理根据正交试验设计表头 L9(34) (表 2)安
排, 处理时间为 2 h。
表 1 正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment
水平 温度 /℃ 光照强度 /μmol·m-2·s-1
1 2 5 500
2 3 0 650
3 3 5 800
表 2 L9(34)正交试验设计
Table 2 Design of orthogonal experiment design
编号 温度 光照强度 温度 × 光强 空列
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 2 1 2 3
5 2 2 3 1
6 2 3 1 2
7 3 1 3 2
8 3 2 1 3
9 3 3 2 1
　　
在温度 30 ℃、光照强度 650 μmol·m-2·s-1下,
分别照射叶圆片 2、4、6、8、10 h, 检测光照
时间对 Lyc-β基因的影响。
用蒸馏水清洗、滤纸吸干处理后的叶圆片,
提取总RNA。cDNA第一链的合成以及半定量RT-
PCR体系参照戚元成等(2009)文中的方法进行。
引物设计如下: 烟草Lyc-β基因(GenBank登录号为
X81787.1)上游引物5 CAAGAAAGAATGGTGGCT
3, 下游引物5 CAGGCGAGATGACAAGAA 3 (扩增
片段长度为432 bp); 肌动蛋白基因(Actin) (GenBank
登录号为 EU938079)上游引物 5 TTGACGGA-
AAGAGGTTAT 3, 下游引物 5 GTTGGAAGGT-
GCTGAGAG 3 (扩增片段长度为 484 bp)。以肌
动蛋白基因的相对含量作为内参, 在扩增26~30个
循环后, 5 μL的扩增产物进行 1% (W/V)琼脂糖凝
胶电泳, 溴化乙锭(EB)染色后检测, 采用UVI Band
软件对基因相对表达条带进行定量分析。为方便
比较, 设定处理 1表达量为 100%。
实验设计及计算分析采用DPS 6.55软件进行,
三水平处理之间用Duncan’s测验作显著性分析, 不
同的小写字母表示差异达到 P<0.05水平。
结果与讨论
1 RNA电泳检测
不同温度和光照强度处理后的叶圆片提取总
RNA的电泳结果(图 1)表明, 28S、18S、5S三条
带中28S和18S带比较亮, 说明RNA样品未发生降
解。A260/A280比值在 1.90~2.00之间, 说明 RNA样
品的纯度高, 可用于 cDNA的合成。不同光照时间
处理后的叶圆片总RNA纯度高, 也能够用于cDNA
的合成。
2 温度和光照强度对Lyc-β基因表达的影响
温度和光照强度正交设计组合处理叶圆片后,
Actin和 Lyc-β基因的扩增结果(图 2)表明, Actin和
Lyc-β基因的扩增产物条带比较清晰, 基本上没有
拖尾现象。在 9个不同的处理之间, Lyc-β基因的
图 1 烟叶总RNA的电泳检测
Fig.1 Results of agarose gel of total RNA extraction
1: 25 ℃, 500 μmol·m-2·s-1光照; 2: 25 ℃, 650 μmol·m-2·s-1光
照; 3: 25 ℃, 800 μmol·m-2·s-1光照; 4: 30 ℃, 500 μmol·m-2·s-1光照;
5: 30 ℃, 650 μmol·m-2·s-1光照; 6: 30 ℃, 800 μmol·m-2·s-1光照; 7:
35 ℃, 500 μmol·m-2·s-1光照; 8: 35 ℃, 650 μmol·m-2·s-1光照; 9: 35
℃, 800 μmol·m-2· s-1光照。下图同此。
图 2 Lyc-β基因的半定量RT-PCR结果
Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of Lyc-β gene
贾峰等: 温度与光照强度对烤烟番茄红素 β -环化酶基因表达的影响 191
表达有较大的差异。这表明, 温度和光照处理能够
下调或上调 Lyc-β基因的表达。
在温度25 ℃时, Lyc-β基因的表达随着光照强
度的增加持续上升, 当光照强度为 800 μmol·m-2·s-1
时, Lyc-β基因表达是光照强度为 500 μmol·m-2·s-1
的 2.1倍, 表明较低的温度和较强的光照能够使
Lyc-β基因表达升高(图 3和表 3)。在 30 ℃时, 该
基因的表达随着光照强度升高略有下降, 而继续增
加光照强度, 则该基因的表达明显上调。在 35 ℃
时, 随着光照强度的增加, 该基因的表达表现为先
升高后下降的单峰曲线变化。这说明在较高温度
下, 持续提高光照强度并不能够使基因的表达上调。
显上调。较高光照强度(800 μmol·m-2·s-1)下, Lyc-
β基因在 25 ℃时的表达较高, 但随着温度的升高,
基因的表达明显下调。总之, Lyc-β基因的表达的
调控受到温度和光照的相互影响, 只有在适当的温
度和光照的条件下, 才能够有利于 Lyc-β基因的表
达。这与 Lurie等(1996)的研究结果高温能够抑制
番茄类胡萝卜素合成途径中的关键酶-八氢番茄红
素合成酶基因的表达有相似之处。
另外, 实验的极差结果(表 3)表明, 3个因子对
Lyc-β基因表达影响作用的大小顺序是: 光照强度>
温度>温度与光照的交互作用。光照强度对该基
因的表达影响较大, 但没有达到差异显著水平(P<
0.05)。
3 光照时间对 Lyc-β基因表达的影响
不同光照时间处理后 Lyc-β基因的表达结果
(图4)表明, Lyc-β基因的表达随着光照时间的延长
逐渐上调, 在处理 6 h时达到峰顶, 之后开始下降。
这一变化结果与陶俊等(2003)文中得出的光信号能
够影响果皮类胡萝卜素形成的结果相符合。
图 4 不同光照时间处理后 Lyc-β基因的
半定量RT-PCR结果
Fig.4 Semi-quantitative RT-PCR analysis of
Lyc-β after different light time
参考文献
戚元成, 马雷, 王菲菲, 刘卫群(2009). 烟草打顶对腐胺 N-甲基转
移酶基因表达的影响. 植物生理学通讯, 45 (7): 684~686
陶俊, 张上隆, 安新民, 赵智中(2003). 光照对柑橘果皮类胡萝卜
素和色泽形成的影响. 应用生态学报, 14 (11): 1833~1836
王能如, 李章海, 王东胜, 徐增汉, 周慧玲, 朱显灵(2009). 我国烤
烟主体香味成分研究初报. 中国烟草科学, 30 (3): 1~6
杨虹琦, 周冀衡, 罗泽民, 杨述元(2004). 不同产区烤烟中质体色
素及降解产物的研究. 西南农业大学学报, 26 (5): 64~68
周冀衡, 张建平(2008). 构建中式卷烟优质特色烟叶原料保障体
系是新形势下中国烟草的战略选择. 中国烟草学报, ( 1 ) :
图 3 不同处理后 Lyc-β基因的相对表达量
Fig.3 Relative expression of Lyc-β gene
after different treatments
表 3 Lyc-β基因相对表达量的数据分析
Table 3 Analysis of relative expression of Lyc-β gene
Lyc- β基因的相对表达量 /%
平均值
温度 光照强度 温度 × 光强
K1 150.67a 111.00a 160.67a
K2 161.33a 159.33a 142.67a
K3 137.00a 178.67a 145.67a
极差 24.33 67.67 16.21
　　不同的小写字母表示数值之间具有 5 % 的显著性差异。
相同较低光照强度(500 μmol·m-2·s-1)下, Lyc-β
基因的表达在30℃时出现高峰, 而温度或低或高都
不利于该基因的表达(图 3)。中等光照强度(650
μmol·m-2·s-1)下, 随着从 25℃升高到 30℃时该基因
表达的升高不明显; 当温度为 35℃时, 基因表达明
植物生理学报192
68~70, 77
朱长甫, 陈星, 王英典(2004). 植物类胡萝卜素生物合成及其相关
基因在基因工程中的应用. 植物生理与分子生物学学报, 30
(6): 609~618
Cunningham Jr FX, Gantt E (1998). Genes and enzymes of
carotenoid biosynthesis in plants. Ann Rev Plant Biol, 49 (1):
557~583
Cunningham Jr FX, Pogson B, Sun Z, McDonald KA, DellaPenna
D, Gantt E (1996). Functional analysis of the β and ε lyco-
pene cyclase enzymes of Arabidopsis reveals a mechanism
for control of cyclic carotenoid formation. Plant Cell, 8
(9): 1613~1626
Dharmapuri S, Rosati C, Pallara P, Aquilani R, Bouvier F, Camara
B, Giuliano G (2002). Metabolic engineering of xanthophyll
content in tomato fruits. FEBS Lett, 519 (1): 30~34
Giuliano G, Bartley G, Scolnik P (1993). Regulation of carotenoid
biosynthesis during tomato development. Plant Cell, 5 (4):
379~387
Isaacson T, Ronen G, Zamir D, Hirschberg J (2002). Cloning of
tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essen-
tial for the production of β-carotene and xanthophylls in
plants. Plant Cell, 14 (2): 333~342
Lurie S, Handros A, Fallik E, Shapira R (1996). Reversible inhibi-
tion of tomato fruit gene expression at high temperature.
Effects on tomato fruit ripening. Plant Physiol, 110 (4):
1207~1214
Masclaux D, Carrayol E, Valadier M (2005). The two nitrogen
mobilisation- and senescence-associated GS1 and GDH genes
are controlled by C and N metabolites. Planta, 221 (4):
580~588
Park H, Kreunen S, Cuttriss A, DellaPenna D, Pogson B (2002).
Identification of the carotenoid isomerase provides insight
into carotenoid biosynthesis, prolamellar body formation,
and photomorphogenesis. Plant Cell, 14 (2): 321~332
Ye X, Al-Babili S, Kloti A, Zhang J, Lucca P, Beyer P, Potrykus
I (2000). Engineering the provitamin A (β-carotene) bio-
synthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm.
Science, 287 (1): 303~305