全 文 ：第 35 卷第 11 期
2015年 6月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.11
Jun.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(41101230)
收稿日期:2013鄄07鄄23; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄06鄄12
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: xpchen@ shu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201307231936
周京勇, 刘冬秀, 何池全, 刘晓艳, 沈燕芬, 龙锡恩, 陈学萍.土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测.生态学报,2015,35(11):3491鄄3503.
Zhou J Y, Liu D X, He C Q, Liu X Y, Shen Y F, Long X E, Chen X P.Molecular detection of diversity of anaerobic methanotroph in soil.Acta Ecologica
Sinica,2015,35(11):3491鄄3503.
土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测
周京勇1, 刘冬秀1, 何池全1, 刘晓艳1, 沈燕芬2, 龙锡恩3, 陈学萍1,*
1 上海大学环境与化学工程学院, 上海摇 200444
2 余姚市环境保护监测站, 余姚摇 315400
3 中国科学院城市环境研究所, 厦门摇 361021
摘要:甲烷厌氧氧化作用是减少海洋底泥甲烷释放的重要生物地球化学过程, 然而在陆地生态系统中甲烷厌氧氧化作用及其
功能菌群的生态功能仍然不确定。 对甲烷厌氧氧化菌多样性的研究可为减少甲烷排放提供重要科学依据。 与传统的分离培养
方法比较,分子检测方法是一种更为快速和高效的研究手段,可直接和全面的反映参与甲烷厌氧氧化作用的功能微生物。 以
DNA分子标记物为研究对象,重点探讨三类主要的分子标记基因,即 16S rRNA, mcrA 和 pmoA,所采用的相关探针和引物信
息,同时从定性和定量两个角度综述土壤甲烷厌氧氧化菌的多样性研究的主要进展,最后提出厌氧甲烷氧化菌多样性研究中存
在的一些问题和相应的解决思路。
关键词:土壤; 甲烷厌氧氧化菌; 功能基因; 多样性
Molecular detection of diversity of anaerobic methanotroph in soil
ZHOU Jingyong1, LIU Dongxiu1, HE Chiquan1, LIU Xiaoyan1, SHEN Yanfen2, LONG Xi忆en3,
CHEN Xueping1,*
1 School of Environmental and Chemical Engineering, Shanghai University, Shanghai 200444, China
2 Yuyao Environmental Protection Monitoring Station, Yuyao 315400, China
3 Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China
Abstract: Anaerobic oxidation of methane is the most important biogeochemical process to reduce methane released into the
atmosphere from marine sediments, however, the anaerobic oxidation of methane and related functional microorganisms in
soil still remain uncertain. Therefore, the studies on the diversity of anaerobic methanotrophs may be able to assist with
reducing methane emissions from soil. Compared with traditional culture鄄dependent methods, molecular methods
independent of culture techniques has vastly improved the knowledge on microbial diversity. This review mainly focused on
the recent progress surrounding abundance and diversity of anaerobic methanotrophs in soils with emphasis on the molecular
gene markers including 16S rRNA, mcrA and pmoA used for detecting anaerobic methanotrophs. Furthermore, the questions
existing in the present research as well as the related resolution were also discussed. Methane oxidation in anoxic
environments is microbially mediated and of global significance. In the last decade, the diversity of anaerobic methane
oxidation populations has been studied intensively. Initially, most studies concerning environmental AOM were carried out in
anaerobic marine waters and sediments where AOM was coupled to sulfate reduction. It is now known that there are also
some microorganisms capable of coupling AOM to denitrification. Fluorescence in situ hybridization with target probes firstly
showed that the sulfate dependent AOM archaea were in the absence of close physical association with sulfate reducing
http: / / www.ecologica.cn
bacteria. With the development of probes, different types of AOM consortia were visualized. In addition, most investigations
on the diversity of AOM archaea involved in the consortia were based on the 16S rRNA or mcrA gene phylogeny. Three
lineages of the sulfate dependent AOM have been identified that are referred to as ANME鄄1, ANME鄄2, ANME鄄3. The first
nitrate dependent methane oxidation cultures were initially enriched anaerobically, which contained a bacterium belonging to
the candidate division NC10. “Candidatus, Methylomirabilis oxyfera,冶 a member of the uncultured NC10 phylum, forms a
novel taxonomic group of bacterial methanotrophs. Recently, special primers targeting methane monooxygenase (pMMO) for
detection of anaerobic methanotrophs were developed. Based on these probes and primers, culture independent approaches
were used to screen samples from several oxygen鄄limited habitats for the presence of both sulfate and nitrate dependent
methane oxidation bacteria and archaea, e. g. quantitating the abundance of anaerobic methanotrophs by quantity PCR,
detecting the community structure by clone library. Although methane oxidation occurs in a variety of different habitats and
appears to be performed by different organisms, the distribution of AOM organisms in aquatic and terrestrial ecosystems
remains to be fully revealed. Thus, several suggestions for future research on AOM processes and related microorganisms are
put forward as follows: 1) to investigate more diverse terrestrial environments where AOM may occur or is known to occur
based on genomic and biomarker 鄄related methods. 2) to combine the enrichment culture with molecular method to better
understand the mechanism of AOM and related microorganisms. The enrichment or isolation of these organisms will allow for
a variety of novel physiological, biochemical, and genomic studies of AOM one or more key organisms. 3) to detect the
environmental factors affecting the AOM process or organisms. Future biogeochemical studies also hold the potential to
further our understanding of this process. 4) to explore new types of AOM microorganisms coupled with SO2-4 , Mn
4+, Fe3+,
NO-3 acting as the electron acceptors. Understanding AOM communities and the environmental conditions under which they
consume methane may help to refine computational models for methane cycling on earth and should improve the accuracy of
long鄄term climate change projections.
Key Words: soil; anaerobic methanotrophs; functional gene; diversity
甲烷(CH4)是一种温室气体,其温室效应是二氧化碳的 26 倍,对全球变暖的“贡献率冶达到 15%[1]。 当
今国际重大环境科学计划(例如 IGBP、WCRP、IHDP、GCTE、IPCC)中,陆地生态系统碳循环是其中的核心研
究内容[2鄄4]。 陆地湿地甲烷排放是温室气体甲烷的最大排放源[5],据估计天然湿地每年向大气中排放 110 Tg
CH4,占全球 CH4排放总量的 15%—30%[6]。 此外,IPCC报告指出全球稻田 CH4排放量每年高达 35—56 Tg,
约占全球 CH4排放总量的 1 / 5[4]。 众所周知,甲烷厌氧氧化作用是海洋底泥中减少甲烷释放到大气中的重要
生物地球化学过程,尽管在陆地生态系统中甲烷厌氧氧化作用广泛存在,但其过程及关键微生物尚未清
楚[7]。 例如,有人应用13C同位素估算垃圾填埋场渗滤液污染羽土壤,发现甲烷厌氧氧化作用消耗了 80%—
90% CH4 [8]。 吕镇梅等[9]同样也证实了水稻田土壤甲烷厌氧氧化过程的存在,但结果表明水田土壤中的甲烷
厌氧氧化活性远低于甲烷好氧氧化活性,如以两者的氧化活性作为对甲烷氧化的贡献来计,则甲烷厌氧氧化
作用的贡献率一般都在整个甲烷氧化的 10%以下。 但在水田土壤淹没的情形下,由于土壤厌氧条件的形成
和甲烷扩散受阻,甲烷厌氧氧化的速率明显超过好氧氧化的速率,甲烷厌氧氧化在整个甲烷氧化中的贡献率
可到达 30%以上。 甲烷在这些厌氧生境中由产甲烷菌形成以后,经土壤和水层,逸散至大气,在途经土壤和
水层时可被栖息于其间的甲烷厌氧氧化菌(AOM)所氧化。 因此探索土壤甲烷厌氧氧化菌的多样性有助于深
入认知渍(淹)水土壤中甲烷厌氧消耗的微生物学机制,为减少甲烷排放通量提供科学基础,对减缓因温室效
应而带来的气候变暖具有重要意义。
近几十年来,分子生态学方法已成为土壤甲烷厌氧氧化菌多样性研究的关键手段,并取得了丰硕的成
果[10鄄12]。 近几年,国内也开始广泛关注甲烷厌氧氧化作用及其功能菌,多个课题组已经对其多方面进行了综
述[13鄄15]。 本文重点对土壤甲烷厌氧氧化菌的功能基因(16S rRNA, mcrA, pmoA)所采用的相关探针和引物序
2943 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
列进行了综述,并基于这些功能基因总结其在土壤甲烷厌氧氧化菌定性和定量分子检测方面的应用。
1摇 甲烷厌氧氧化菌的培养和分类
1.1摇 甲烷厌氧氧化菌的培养
由于土壤中微生物群落及环境因子极其复杂,能够被培养并分离出的微生物只是非常小的一部分,因此
传统上依赖于培养的方法仅能反映不到 1%的微生物种类多样性[16]。 由于在富集培养条件下甲烷厌氧氧化
菌生长速率慢,倍增时间长达数月,并且因其生物特性须在严格厌氧的条件下富集培养、工艺条件严格和影响
因子复杂,客观上阻碍了对甲烷厌氧氧化菌功能和作用机理研究。 许多科学家曾认为无法富集纯化依赖于硝
酸根的甲烷厌氧氧化菌[17鄄20]。 迄今,仅获得此类微生物的富集培养物。 最初由 Ettwig 课题组从新西兰淡水
底泥中富集得到硝酸盐甲烷厌氧氧化菌[21鄄23],此后陆续有来自其他淡水生境和人工污水处理系统中的富集
培养的报道(混合培养活性污泥和淡水底泥富集[24鄄27] )。 Vecherskaya 等[28]从甲烷驯化的微氧反硝化生物反
应器中筛选纯化到一株甲烷厌氧氧化菌,系统发育分析发现其属于 Methylocystis parvus。 与硝酸盐甲烷厌氧氧
化菌不同,硫酸盐甲烷厌氧氧化菌大多富集培养于海洋底泥,如 Eckernf觟rde 海湾沉积物[29鄄31]、Aarhus 海湾沉
积物[32]、Monterey海湾沉积物[33]。 国内闵航等[34]首次报道了 1株从浙江象山市郊青紫泥水稻田土壤中分离
到的能独立厌氧氧化甲烷的菌株。 因此,到目前为止,仅有少数几个课题组能富集培养有限生境中甲烷厌氧
氧化菌,不能充分描述甲烷厌氧氧化菌的多样性,而分子生态学方法的应用,能从分子水平上较为客观地揭示
微生物的多样性,有效地克服了传统培养方法的不足,提高了分析检测的速度及结果的准确性和完整性。
1.2摇 甲烷厌氧氧化菌的分类
1.2.1摇 硫酸盐甲烷厌氧氧化菌(SAMO)
参与 SAMO反应的甲烷厌氧氧化古菌(ANME)往往与硫酸盐还原细菌(SRB)形成共生体,因此甲烷氧化
的同时伴随着硫酸盐的还原。 根据系统发育分析,通常这类厌氧甲烷氧化菌分为三类: ANME鄄 1(Anaerobic
methanotrophic archaea )、 ANME鄄 2 、 ANME鄄 3,均属于广古菌门[35]。 其中, ANME鄄 1 与产甲烷微菌目
(Methanomicrobiales)和产甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)有较近的亲缘关系,ANME鄄2属于产甲烷八叠球
菌目(Methanosarcinales),ANME鄄3与甲烷拟球菌属(Methanococcoides)亲缘关系较近[35]。 这三类古菌彼此间
的进化距离较远,序列相似度仅为 75%—92%。 即使在 ANME鄄 2中,分枝 ANME鄄 2a、鄄 2b 与鄄 2c 相似度也较
低。 因此,虽然 ANME鄄1、ANME鄄2 、ANME鄄3属于不同的目或科,但是都具有在各种生境厌氧氧化甲烷的能
力。 然而,与 ANME鄄2的同源性较高的 ANME的一个新的分枝 GoM Arc1,试验表明它并不具备氧化甲烷的能
力,也不与硫酸盐还原菌(SRB)组成共生菌群[36鄄38]。 因此,此类甲烷厌氧氧化菌在甲烷的生物地球化学循环
过程中的作用还有待进一步研究。 ANME鄄1可以单细胞形式存在[39鄄40],也可以与硫酸盐还原菌以共生体的形
式存在[39],在黑海中甚至以编绕式存在[40鄄41]。 ANME鄄3 同样可以单细胞形式存在,或者与硫酸盐还原菌形成
外壳型或者混合型的共生体。 ANME鄄2往往与硫酸盐还原菌以外壳型或者混合型共生体存在[40,42]。
1.2.2摇 硝酸盐甲烷厌氧氧化菌 (DAMO)
硝酸盐甲烷厌氧氧化菌能够在完全无氧的情况下和反硝化耦联将甲烷氧化,它的电子受体是 NO-2 和
NO-3。 到目前为止,所有与反硝化过程耦合的甲烷厌氧氧化富集培养中都含有一定量(30%—80%)NC10 门
细菌,而且无论生境的地理差异都与 Methylomirabilis oxyfera 有较高的同源性,可能是同一菌种的不同菌株
(16S rRNA 同源性>97.5%)。 而 NC10门中其他种类的细菌是否具有甲烷厌氧氧化的能力不得而知。 根据
16S rRNA系统发育树,M. oxyfera 代表了新的甲烷营养型细菌分枝。 M. oxyfera和 Verrucomicrobia是目前已知
的唯一两类非变形菌门的甲烷营养型细菌。 在过去的一个世纪里,已经分离鉴定出 100 多种甲烷氧化菌[43]。
其分类及其亲缘关系的主要特点是 C1同化途径和细胞质膜均含有大量 pMMO酶,从而将甲烷氧化细菌主要
分成玉、域两类。 玉型利用磷酸核酮糖途径(RuMP)或者 Calvin鄄Benson鄄Bassham(CBB)循环和 C1同化途径丝
氨酸循环过程的酶,属于 酌鄄变形菌门。 II 型主要是丝氨酸同化途径,属于 琢鄄变形菌门。 根据系统发育分析,
3943摇 11期 摇 摇 摇 周京勇摇 等:土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www.ecologica.cn
M. oxyfera是有别于玉、域型的甲烷氧化菌。 由于分离纯培养的困难,其生理生化特点还有待进一步研究[44]。
2摇 甲烷厌氧氧化菌多样性的主要分子标记物
鉴于自然环境中微生物群落的复杂性和传统的培养方法的局限性,分子生物学技术的应用越来越广泛,
它能提高分子检测的速度和分析结果的准确性。 检测甲烷氧化菌多样性的检测方法主要有温度梯度凝胶电
泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、荧光原位杂交(FISH)、末端限制性片段长度多态性分析(T鄄RFLP)、
高通量测序等新兴分子生态学技术。 这些分子生态学技术都需要建立在目标微生物群落的分子标记物的基
础上,目前已有的甲烷厌氧氧化菌的分子标记物主要包括特异基因探针,16SrRNA,功能基因 mcrA以及 pmoA
基因。
2.1摇 探针
基因探针(probe)又称“寡核苷酸探针冶,简称“探针冶,是一种核酸杂交应用。 由于核酸分子杂交的高特
异性及检测方法的高灵敏性,基因探针已经广泛用于环境微生物学中,检测土壤等生境中微生物多样性,鉴别
功能基因,定性、定量分析环境微生物的存在、丰度、分布等。 荧光原位杂交的是荧光标记特异核酸探针,然后
与被检测的染色体或 DNA片段变性鄄退火鄄复性进行杂交,通过荧光显微镜观察荧光信号,从而对所测目标进
行定性、定量或相对定位分析。
表 1总结了鉴定甲烷厌氧氧化菌及硫酸盐还原菌常用的一些特异性探针。 这些探针中,ANME2鄄 712 的
信号比 ANME鄄1鄄538弱,Eel鄄MS932同时可以检测到 ANME鄄 3,但是错配的几率较高,因此不推荐用此探针。
引物 ANME3鄄1249几乎可以覆盖 ANME鄄3的所有序列,而且具有特异性。 引物 AR468f几乎可以覆盖 ANME鄄
2c的所有序列,但是对于 ANME鄄2c没有严格的特异性。
基于上述探针,已经成功地将荧光原位杂交技术(FISH)技术应用于甲烷厌氧氧化菌种群的鉴定和种群
密度的定量表达[35]。 通过 FISH试验, Boetius等[42]首次从生物学角度证明甲烷氧化古菌与硫酸盐还原菌存
在共生关系,并观察到外壳型的共生体。 Raghoebarsing等[21]同样应用 FISH方法鉴定了甲烷氧化菌与反硝化
菌的共生体:甲烷氧化菌成簇存在于细胞聚集体中央, 反硝化菌则聚集在周围。 Wankel等[52]利用 FISH技术
检测热液沉积物中中温和嗜热厌氧甲烷氧化菌,结果发现所有沉积层孔隙中存在的厌氧甲烷氧化菌为
ANME鄄1a,并且脱硫叠球菌属鄄脱硫球菌属这类厌氧甲烷菌只有在较低温度下才能观察到。 Maignien 等[53]利
用 FISH技术发现 AOM过程中总细胞的 79%为厌氧甲烷氧化菌 ANME鄄1并且大部分 ANME鄄1细胞形成单一
反应链。 随着研究深入,FISH技术和离子质谱分析法相结合可以将 AOM联合体中古菌的系统发育和功能结
合进行研究。 Orphan等人[54]应用此技术直接证明了甲烷厌氧氧化偏好利用轻的碳同位素,与其他菌群的同
化途径不同。 Ettwig 等[22]将 FISH和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法相结合,发现甲烷氧化速率增加
伴随古菌细胞数目下降,说明细菌可能在厌氧甲烷氧化过程中起主导作用。
2.2摇 16S rRNA
Woese等[55]利用 16S或 18S rRNA / rDNA技术比较了二百多种原核生物和真核生物的序列图谱之后,定
义并建立了古菌界,建立了真细菌(后更名为细菌)、古细菌(古菌)和真核生物三大主干。 在众多生物类群
中,核糖体序列保守,结构也保守,再加上 16S rRNA 相比于细菌核糖体的两外两种类型 5S rRNA 和 23S
rRNA,遗传信息比较多,核苷酸数量适中,因此 16S rRNA 被认为是生物系统发育最为合适的指标,已成为应
用最为广泛的标记基因[56]。
许多研究以 16S rRNA 基因作为标记基因,对不同生境中甲烷厌氧氧化菌的多样性进行了表征。 Girguis
等[57]最先应用古菌通用引物对 Arch21F / Arch958R建立克隆文库对富集培养物进行多样性分析,并设计专性
引物对 AR468f / AR736r对 ANME鄄2c定量分析。 Miyashita[58]设计了一系列特异性扩增甲烷厌氧氧化菌 16S
rRNA 基因的一些引物对(ANME鄄1, ANME鄄2a, ANME鄄2b, ANME鄄2c and ANME鄄3) (表 2),并成功应用于硫
酸盐浓度较低的厌氧生境中甲烷厌氧氧化菌多样性的检测,如产甲烷污泥,水稻土壤,莲底泥和天然气土壤
4943 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
等。 硝酸盐甲烷厌氧氧化菌是采用古菌的通用引物(如 8F / 1492R) 进行 16S rRNA 基因的扩增,并通过系统
发育分析进行甲烷厌氧氧化菌的分类鉴定。 Ettwig 等[23]利用 FISH探针设计成引物对,对富集培养物进行系
统发育验证,并设计引物对 qP1F / qP1R, qP2F / qP2R定量分析富集培养物的生物量。
表 1摇 靶标甲烷厌氧氧化菌及硫酸盐还原菌的一些特异性探针
Table 1摇 Oligonucleotide probes for ANME (Anaerobic Methanotroph) archaea, their sulfate鄄reducing partners and denitrifying methane鄄
oxidizing bacteria
类群
Group
探针
Probe
序列 (5忆鄄3忆)
Sequence (5忆鄄3忆)
靶标类型
Target type
参考文献
References
SAMO ANME 1鄄350 AGTTTTCGCGCCTGATGC ANME鄄1 [42]
ANME1鄄862 GGCGGGCTTAACGGGCTTC ANME鄄1 [45]
ANME 2鄄538 GGCTACCACTCGGGCCGC
ANME鄄2, limnic AAA,
Methanolobus tindarius,
Methanococcus aeolicus
[46]
ANME 2鄄712 TTCGCCACAGATGGTCCC most ANME鄄2 [35]
Eel鄄MS932 AGCTCCACCCGTTGTAGT ANME鄄2, (ANME鄄3) [42]
ANME 2a鄄647 TCTTCCGGTCCCAAGCCT ANME鄄2a [40]
ANME 2c鄄622 CCCTTGGCAGTCTGATTG ANME鄄2c [40]
ANME 2c鄄760 CGCCCCCAGCTTTCGTCC ANME鄄2c [40]
ANME 3鄄1249 TCGGAGTAGGGACCCATT ANME鄄3 [47]
ANME鄄3鄄1249H3 GTCCCAATCATTGTAGCCGGC Helper probe for ANME鄄3鄄1249 [48]
ANME鄄3鄄1249H5 TTATGAGATTACCATCTCCTT [48]
MBGB525 AGAGCTGGTTTTACCGCG Marine benthic group B / Deep鄄sea [40]
MBGB335 TGCGCCTCGTAAGGCCTG archaeal group (MBGB, DSAG) [40]
MBGB380 GTAACCCCGTCACACTTT [40]
AAA鄄FW鄄641 GGT CCC AAG CCT ACC AGT AAA [49]
AAA鄄FW鄄834 TGC GGT CGC ACC GCA CCT AAA, [49]
SRB DSS 658 TCCACTTCCCTCTCCCAT Desulfosarcina / Desulfococcus( including ANME鄄2 partners) [50]
DBB 660 GAATTCCACTTTCCCCTCTG Desulfobulbus [51]
DBBA 655 CACTTTCCCCTCTAGTAC ANME鄄3鄄partner(Desulfobulbus relatives) [48]
DAMO S鄄*鄄DBACT鄄0193鄄 a鄄A鄄18 CGCTCGCCCCCTTTGGTC Denitrifying methaneoxidizing bacteria [21]
S鄄*鄄DBACT鄄0447鄄 a鄄A鄄18 CGCCGCCAAGTCATTCGT
S鄄*鄄DBACT鄄1027鄄 a鄄A鄄18 TCTCCACGCTCCCTTGCG
摇 摇 SAMO: 硫酸盐甲烷厌氧氧化菌 Sulphate鄄dependent anaerobic methane oxidation;SRB:硫酸盐还原菌 Sulfate Reducing Bacteria;DAMO:硝酸盐
甲烷厌氧氧化菌 Denitrification鄄dependent anaerobic methane oxidation
表 2摇 靶标甲烷厌氧氧化菌的一些 16S rRNA基因引物
Table 2摇 16S rRNA gene primers targeting methanotrophs
类群
Group
引物
Primer
序列 (5忆鄄3忆)
Sequence (5忆鄄3忆)
靶标类型
Targeted type
参考文献
References
SAMO ANME鄄1 337f AGGTCCTACGGGACGCAT ANME鄄1 [57]
ANME鄄1 724r GGTCAGACGCCTTCGCT
ANME1鄄395F
AAC TCT GAG TGC CTC CTA
AAC TCT GAG TGC CTC CAA
AAC TCT GAG TGC CCC CTA
ANME鄄1 [58]
ANME1鄄1417R CCT CAC CTA AAC CCC ACTCCT CAC CTA AAT CCC ACT [58]
ANME1GBHS鄄183F ATA CCT GGA ATG GGC GGA GBHS clone groupwithin the ANME鄄1 [58]
5943摇 11期 摇 摇 摇 周京勇摇 等:土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www.ecologica.cn
续表
类群
Group
引物
Primer
序列 (5忆鄄3忆)
Sequence (5忆鄄3忆)
靶标类型
Targeted type
参考文献
References
ANME1GBHS鄄841R AAC ACC GGC ACC ACT CGT [58]
ANME2a鄄426F
TGT TGG CTG TCC GGA TGA
TGT TGG CTG TCC AGA TGA
TGT TGG CTG TCC AGA TGG
ANME鄄2a [58]
ANME2a鄄1242R AGG TGC CCA TTG TCC CAA [58]
ANME2b鄄402F AGT GCC AGT ACT AAG TGC ANME鄄2b [58]
ANME2b鄄1251R TTT CGA GGT AGG TAC CCA [58]
ANME2c鄄AR468f
CGC ACA AGA TAG CAA GGG
CGC GCA AGA TAG CAA GGG
AGC ACA AGA TAG CAA GGG
ANME鄄2c [58]
ANME2c鄄1411R CCA AAC CTC ACT CAG ATG [58]
AR468f CGCACAAGATAGCAAGGG ANME鄄2c [57]
AR736r CGTCAGACCCGTTCTGGTA [57]
ANME 111f GGCTCAGTAACACGTGGA ANME鄄1and ANME鄄2 [59]
ARC915r GTGCTCCCCCGCCAATTCCT [60]
ANME3鄄140F GGA TTG GCA TAA CAC CGG ANME鄄3 [58]
ANME3鄄1249 TCG GAG TAG GGA CCC ATT
Arch20F / 21F TTCCGGTTGATCCYGCCGGA Archaea / ANMEs [57]
Arch958R YCCGGCGTTGAMTCCAATT [57]
ANMEF GGCUCAGUAACACGUGGA Archaea / ANMEs [59]
907R CCGTCAATTCCTTTRAGTTT [59]
ARC鄄8f TCCGGTTGATCCTGCC Archaea / ANMEs [61]
ARC鄄1492r GGCTACCTTGTTACGACTT [61]
DAMO 202F GACCAAAGGGGGCGAGCG M. oxyfera [23]
1545R CAKAAAGGAGGTGATCC M. oxyfera [62]
8F AGAGTTTGATYMTGGCTCAG NC10 bacteria [62]
193F GACCAAAGGGGGCGAGCG [23]
1043R TCTCCACGCTCCCTTGCG [23]
qP1F GGGCTTGACATCCCACGAACCTG M. oxyfera [23]
qP1R CGCCTTCCTCCAGCTTGACGC M. oxyfera [23]
qP2F GGG GAA CTG CCA GCG TCA AG M. oxyfera [23]
qP2R 覵CTC AGC GAC TTC GAG TAC AG M. oxyfera [23]
2.3摇 mcrA
逆甲烷生成途径是最早被提出, 也是研究最多的关于甲烷厌氧氧化途径的假说。 研究发现,产甲烷过程
涉及的大部分酶所催化的反应都是可逆的,即在不同反应条件下,同一反应在酶的催化下可向不同方向进行,
这为逆甲烷产生理论提供了理论支持。 硫酸盐甲烷厌氧氧化菌在酶作用下将甲烷最终转化为 CO2(反向产甲
烷),该过程所释放的电子通过某种电子传递体转移到 SRB 中,从而使硫酸盐发生还原作用。 已有研究发现
SAMO过程中的确存在某种酶能够催化甲烷的氧化,这种酶非常类似产甲烷过程的关键酶鄄甲基辅酶 M 还原
酶(Methyl鄄coenzyme Mreductase,MCR),该酶在产甲烷过程中能够催化甲烷的形成[63]。 mcrA 基因编码甲基辅
酶 M 还原酶(MCR)的 琢亚基, 而 ANME鄄1和 ANME鄄2都有 mcrA基因,在甲基辅酶 M还原酶的作用下,甲烷
首先被氧化为甲醇,再经过一系列脱氢酶的作用,最终转化为 CO2。
6943 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
表 3摇 靶标硫酸盐型甲烷厌氧氧化菌的一些 mcrA基因引物
Table 3摇 Some mcrA gene primers targeting SAMO
引物
Primer
序列 (5忆鄄3忆)
Sequence (5忆鄄3忆)
靶标类型
Targeted type
参考文献
References
MCRf TAY GAY CAR ATH TGG YT Methanogens / ANMEs [64]
MCRr ACR TTC ATN GCR TAR TT [64]
ME1 GCM ATG CAR ATH GGW ATG TC Methanogens / ANMEs [65]
ME2 TCA TKG CRT AGT TDG GRT AGT mcrA group a and c to e [65]
AOM39_F GCTGTGTAGCAGGAGAGTCA Methanogens / ANMEs mcrAgroup b [66]
AOM40_R GATTATCAGGTCACGCTCAC [66]
Forward primer TGGTTCGGAACGTACATGTC mcrA group a鄄b [67]
Reverse primer TCTYYTCCAGRATGTCCATG [67]
Forward primer GCTCTACGACCAGATMTGGCTTGG mcrA group c鄄d [67]
Reverse primer CCGTAGTACGTGAAGTCATCCAGCA [67]
Forward primer CHCTGGAAGATCACTTCGGTGGTTC mcrA group e [67]
Reverse primer RTATCCGAAGAARCCSAGTCKRCC [67]
MCR鄄IRDf TWY GAC CAR ATM TGG YT Methanogens / ANMEs [68]
MCR鄄IRDr ACR TTC ATB GCR TAR TT [68]
mcrA forward GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC Methanogens / ANMEs [69]
mcrA reverse TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT [69]
ANME1鄄MCRf GAC CAG TTG TGG TTC GGA AC Methanogens / ANME1 [68]
ANME1鄄MCRAr ATC TCG AAT GGC ATT CCC TC [68]
2.4摇 pmoA
对于甲烷氧化菌的研究,应用较多的基因是编码甲烷单加氧酶(pMMO)的 pmoA基因,是好氧甲烷氧化第
一步(CH4+2H
++O2寅CH3OH+H2O)的一个关键酶。 M. oxyfera是一个新的甲烷氧化菌的种属,能在缺氧条件
下从亚硝酸盐氧化甲烷的反应中获取能量。 M. oxyfera厌氧微生物中 pmoA基因的存在说明其特殊代谢过程:
分子态的氧被从氮氧化物中还原出来,然后用生成的氧气通过由 pMMO开始的完整好氧途径来氧化甲烷[70]。
由于 M. oxyfera的 pmoA序列尤其是在反引物上有几个关键碱基的错配,所以用常用的好氧甲烷氧化菌 pmoA
基因引物对 A189 / A682[71],Mb661[72] / A650[73]都不能扩增 pmoA 基因。 Luesken 等[26]在前引物 A189 上把一
个不稳定碱基替换,就变成了一个兼并引物 A189_b,它能够匹配大多数的甲烷氧化菌。 同时又设计了针对亚
硝酸盐为电子受体的厌氧甲烷氧化菌特异的 nest鄄PCR 引物,命名为 cmo182 和 cmo568。 这些新引物对最早
检测到 Ooijpolder排水沟底泥中亚硝酸盐甲烷厌氧氧化菌的 DAMO 多样性[23],并且得到了特殊脂肪酸的验
证[74]。 到目前为止,这些引物对陆续检测了一些低浓度氧气生境的 DAMO,例如新西兰的废水处理
(wastewater treatment plants (WWTP) [75鄄76],中国的高寒泥炭沼泽[77],德国的污染水体[78]。
表 4摇 靶标甲烷厌氧氧化菌的一些 pmoA 基因引物
Table 4摇 Primers targeting pmoA gene of methanotrophs
引物 Primer 序列 (5忆鄄3忆) Sequence (5忆鄄3忆) 特异性 Specificity 参考文献 References
A189_b GGNGACTGGGACTTYTGG M. oxyfera [26]
cmo682 AAAYCCGGCRAAGAACGA M. oxyfera [26]
cmo182 TCACGTTGACGCCGATCC M. oxyfera [26]
cmo568 GCACATACTCCATCCCCATC M. oxyfera [26]
NA437Rdeg RAATGTTCGRAGCGTVCCBC NC10 [78]
NA555R TCCCCATCCACACCCACCAG NC10 [78]
7943摇 11期 摇 摇 摇 周京勇摇 等:土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www.ecologica.cn
3摇 甲烷厌氧氧化菌的分子多样性特征
3.1摇 硫酸盐甲烷厌氧氧化菌
16S rRNA的系统发育分析发现,古菌域中至少有 3 个不同的组代表了甲烷营养型古菌:ANME鄄 1(包括
a、b两个分支)、ANME鄄2(包括 a、b、c、d四个分支)、 ANME鄄3。 但是,根据 ANME鄄mcrA基因的系统发育分析,
甲烷厌氧氧化菌则归属于 6个不同的发育型(a, b, c, d, e, f),其系统发育位置离产甲烷八叠球菌目等产甲
烷菌较远。 然而,从 16S rRNA或 ANME鄄mcrA建立的系统发育关系是一致的,比如基于 16S rRNA 的 ANME鄄
1,鄄2c,鄄2a,鄄3分别对应于 ANME鄄mcrA的 a鄄b,c鄄d,e,f分支。 基于这些分子标记的系统发育分析发现,不同的
发育类型即可以共同存在于一个海洋甲烷渗漏区[42],也可能以某一类型优势存在于一个生境中,比如在黑海
生物垫中主要存在 ANME鄄 1,而在水合物脊的渗漏底泥( seep鄄sediment from Hydrate Ridge)主要是 ANME鄄
2[42]。 此外,即使在同一生境中也呈现出不同的群落结构,比如黑海的微生物垫中同时存在 ANME鄄 1 和
ANME鄄2,ANME鄄1聚在内层,而 ANME鄄2包围在外层,说明不同的甲烷厌氧氧化菌群落偏好不同的生态环境。
ANME鄄1和鄄 2两大类群在研究的众多生境中都是主要类群,ANME鄄3仅在少数几个生境中报道过。
自然环境中甲烷的厌氧氧化最早在海底沉积物中发现。 20世纪 70 年代以来,开展了大量针对海底沉积
物厌氧甲烷氧化古菌生理特性及其多样性的研究工作。 一般认为海洋中 SAMO 与 SRB 形成共生体,但是陆
地生态系统中硫酸盐浓度较低,认为其可能限制了 SRB 的生长,从而限制了共生的 SAMO 的生长。 例如,
Kadnikov等[79]发现了贝加尔湖底泥表层(0—20 cm)硫酸根浓度最高仅约 0.17 mmol / L,而大于 20 cm深度的
底泥中均低于 0.04 mmol / L,并且建立的古菌克隆文库中没有发现 SAMO 和 SRB。 直到 2006 年,Alain 等
人[80]首次在陆地生态系统(喀尔巴阡山脉的泥火山)中发现大量沉积有机物转化为甲烷并释放到大气中,并
且 ANME鄄2a是主要的功能古菌。 之后陆续有学者在垃圾填埋场[81]、厌氧水体[82]中检测到少量( < 1%)
ANME鄄1和 ANME鄄2古菌的存在。 除此以外,还在众多土壤生境中发现了另一类名为 AAA 的甲烷厌氧氧化
菌(表 5),此类甲烷厌氧氧化菌与 ANME鄄2 有最近的亲缘关系,但是与 ANME鄄 2的任何一个分支都不同源。
除了 ANME鄄3,在陆地生态系统中发现了其他各类甲烷厌氧氧化菌,有着较高多样性。 此外,从功能基因的定
量分析的结果判断,土壤不同生境中存在着活跃的甲烷厌氧氧化菌。 例如 Chang等人[83]应用 ANME鄄2a 的特
异性引物检测发现中国台湾泥火山 7 cm和 29 cm深度的土壤中厌氧甲烷菌最丰富,高达 1.4 伊 107和 2.15 伊
107 copies / g 沉积物,而其他深度的土壤中约 104 copies / g 沉积物。 Wrede等人[84]建立了古菌的克隆文库发现
ANME鄄2a占 14%,所有硝酸盐甲烷厌氧氧化菌则占古菌克隆文库的 22%。 Takeuchi 等人[85]在日本的 Kanto
平原土壤中发现甲烷厌氧氧化菌的拷贝数也达到 104—106 copies / g湿土。 但是,一般海洋中甲烷厌氧氧化菌
数量>1010个 / cm3,在研究最多的黑海的 Hydrate Ridge中优势菌 ANME鄄2最高可达 108个 / cm3 [35]。
3.2摇 硝酸盐甲烷厌氧氧化菌
目前硝酸盐 /亚硝酸盐甲烷厌氧氧化菌均属于 NC10 门,经基因组测序、蛋白表达、生理研究确定此类细
菌命名为 Candidatus Methylomirabilis oxygera。 虽然 16S rRNA 基因与此类细菌同源的细菌分布在各种生境
中[23],但是目前关于硝酸盐 /亚硝酸盐甲烷厌氧氧化菌的富集培养只存在于两个生态系统中:淡水沉积物和
污水处理污泥。 然而,Candidatus Methylomirabilis oxygera 是否是唯一的硝酸盐 /亚硝酸盐甲烷厌氧氧化菌还
不得而知。 根据 NC10门设计的特异引物[23],将基因库中的序列比对之后发现,此类细菌可以细分为 4 个类
群:a,b,c及 d。 然而,目前所富集的细菌均归属于 a类群,说明 a 类群是硝酸盐甲烷厌氧氧化作用的主要功
能群。
学者们在德国寡营养湖(Constance湖[78])的深水底泥表层、日本淡水湖(Biwa 湖[92])的深水底泥表层、内
陆浅水湖泊底泥表层[93]均能检测到 DAMO菌,并且,用同样的引物定量分析发现,Biwa 湖和西湖中 DAMO的
数量分别为 105—106 copies / mL 沉积物及 105 copies / g 干土。 此外,在其他生境中,也发现了一定数量的
DAMO。 例如,引物的设计者 Ettwig等[18]在新西兰的一个富营养化的沟渠中发现了 107—1010 copies / mg DNA
8943 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
的 DAMO。 Brunssummerheide泥炭地中维管植物(具有根际泌氧能力)的根系最深达 60 cm,因此在 80—100
cm深度发现了大量的 DAMO(3.2伊107个 / g干土)。 Wang等检测了长期施氮肥的水稻土 0—100 cm的 DAMO
的分布,结果发现表层(0—10 cm)中拷贝数最高((1.0依 0.1)伊105—(7.5 依 0.4)伊104 copies / g干土),40 cm以
下深度要比表层少一个数量级,70 cm以下则低于检测限[94]。 因此,在不同的土壤生境中存在丰富的 DAMO。
表 5摇 不同土壤生境中甲烷厌氧氧化菌的类型
Table 5摇 Overview of ANME habitats. Sequences released until December 2013 have been considered
研究生境
Habtat site
引物
Primer
甲烷厌氧氧化菌类型
Anaerobic methanotrophic archaea groups
ANME鄄1 ANME鄄2a ANME鄄2b ANME鄄2c ANME鄄3 AAA
参考文献
References
美国北方泥炭地酸性草甸沼泽
Bear Meadows bog acidic,
boreal peatland, USA
A21f /
Eury498
+ [86]
罗马尼亚喀尔巴阡山泥火山沉积物
Carpathian mountains mud volcano
sediments, Rumania
A21f / A958r + + [80]
美国佛罗里达沼泽
Florida Everglades soil, USA 23F / 1492R
+ [87]
日本平原地下沉积物
Kanto Plain subsurface sediment,Japan
Arc109F /
Arc915R
+ [88]
美国密歇根草本泥炭沼泽
Michigan Hollow fen soil, USA A1F / 1492R
+ [89]
美国泥炭地 Peatland soil, USA 1AF / 1100R + [90]
日本石油污染土壤
Petroleum鄄contaminated soil, Japan
A341f /
A1063r
+ [91]
中国西藏高原湿地土壤
Tibetan plateau wetland soil, China
915F /
1492R
+ [79]
瑞士湖泊沉积物
Sediment of Lake Cadagno, Switzerland A20f / A958r
+ [49]
德国泥火山
Nirano mud volcano field, Germany A21f / A958r
+ + + [84]
中国台湾泥火山
Mud Volcano in eastern Taiwan, China A8f / U1513
+ + + [83]
摇 摇 “+冶表示对应生境中检测到的甲烷厌氧氧化菌类型
4摇 总结
分子检测方法的应用为揭示自然环境中甲烷厌氧氧化菌的多样性提供了科学准确的研究工具,特别是基
于功能基因方面的分子检测极大地促进了甲烷厌氧氧化菌多样性及生态功能方面的研究。 迄今为止,对于自
然环境中甲烷厌氧氧化菌主要分为 SAMO和 DAMO 两种类型,分别与硫酸盐还原过程和硝酸盐还原过程耦
合。 由于陆地生态系统中 SO2-4 含量较少,因此对 SAMO的研究一般针对海底沉积物,但是某些含有高浓度硫
酸盐的农田土壤如反酸田等 SAMO的研究还很缺乏。 而且,关于 DAMO 氧化菌的富集培养只存在于淡水沉
积物和污水处理污泥两个生态系统中,缺乏对农田土壤等不同生态系统的大范围研究。 虽然学者们针对不同
厌氧甲烷氧化过程的功能基因设计出很多引物序列,但是这些引物的特异性在不同土壤生态系统里的应用还
有待检验。 另外对其他类型的甲烷厌氧氧化过程研究甚少,如 Fe3+、MnO-4和 ClO
-
4等,虽然有研究报道存在以
这些离子为电子受体的 AOM过程,但是缺乏对不同生态系统此过程的深入研究。 因此,建议今后应用分子
检测方法在以下几个方面开展深入研究:(1)根据 SAMO和 DAMO 的发生特点,对我国不同土壤生态系统进
行深入研究,扩大研究范围,分析可能发生的甲烷氧化过程及其分子机理;(2)将分离培养和分子检测相结
合,分析不同土壤生态系统厌氧甲烷氧化菌的多样性及生态功能;(3)不同土壤生态系统中甲烷厌氧氧化菌
的多样性及与植物、根系和环境因子之间的关系;(4)目前已研究发现极端环境中好氧甲烷氧化菌的广泛存
9943摇 11期 摇 摇 摇 周京勇摇 等:土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www.ecologica.cn
在[95],在此环境中是否存在新型的由微生物介导的甲烷厌氧氧化作用与机制。
参考文献(References):
[ 1 ]摇 Caldwell S L, Laidler J R, Brewer E A, Eberly J O, Sandborgh S C, Colwell F S. Anaerobic oxidation of methane: mechanisms, bioenergetics,
and the ecology of associated microorganisms. Environmental Science and Technology, 2008, 42(18): 6791鄄6799.
[ 2 ] 摇 Reeburgh W S. “Soft spots冶 in the global methane budget / / Lidstrom M E, Tabita F R, eds. Microbial Growth on C1 Compounds. Netherlands:
Springer, 1996: 334鄄342.
[ 3 ] 摇 Hinrichs K U, Boetius A. The anaerobic oxidation of methane: new insights in microbial ecology and biogeochemistry / / Wefer G, Billett D,
Hebbeln D, Joergensen B B, Schl俟ter M, van Weering T C E, eds. Ocean Margin Systems. Germany, Berlin: Springer, 2002: 457鄄477.
[ 4 ] 摇 IPCC. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Summary for policy makers. Contribution of Working Group I to the Fourth Assessment
Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Cambridge: Cambridge University Press, 2007: 539鄄543.
[ 5 ] 摇 Mikaloff Fletcher S E, Tans P P, Bruhwiler L M, Miller J B, Heimann M. CH4 sources estimated from atmospheric observations of CH4 and its
13C / 12C isotopic ratios: 1. Inverse modeling of source processes. Global Biogeochemical Cycles, 2004, 18(4), doi: 10.1029 / 2004GB002224.
[ 6 ] 摇 Matthews E, Fung I. Methane emission from natural wetlands: global distribution, area and environmental characteristics of sources. Global
Biogeochemical Cycles, 1987, 1(1): 61鄄86.
[ 7 ] 摇 孙治雷, 何拥军, 李军, 黄威, 李清, 李季伟, 王丰. 海洋环境中甲烷厌氧氧化机理及环境效应. 地球科学进展, 2012, 27( 11):
1262鄄1273.
[ 8 ] 摇 Grossman E L, Cifuentes L A, Cozzarelli I M. Anaerobic methane oxidation in a landfill鄄leachate plume. Environmental Science and Technology,
2002, 36(11): 2436鄄2442.
[ 9 ] 摇 吕镇梅, 闵航, 陈中云, 吕琴. 水稻田土壤甲烷厌氧氧化在整个甲烷氧化中的贡献率. 环境科学, 2005, 26(4): 13鄄17.
[10] 摇 Valentine D L, Reeburgh W S. New perspectives on anaerobic methane oxidation. Environmental Microbiology, 2000, 2(5): 477鄄484.
[11] 摇 Zhu G B, Jetten M S, Kuschk P, Ettwig K F, Yin C Q. Potential roles of anaerobic ammonium and methane oxidation in the nitrogen cycle of
wetland ecosystems. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86(4): 1043鄄1055.
[12] 摇 Thauer R K. Anaerobic oxidation of methane with sulfate: on the reversibility of the reactions that are catalyzed by enzymes also involved in
methanogenesis from CO2 . Current Opinion in Microbiology, 2011, 14(3): 292鄄299.
[13] 摇 沈李东, 胡宝兰, 郑平. 甲烷厌氧氧化微生物的研究进展. 土壤学报, 2011, 48(3): 619鄄628.
[14] 摇 张梦竹, 李琳, 刘俊新. 硝酸盐和硫酸盐厌氧氧化甲烷途径及氧化菌群. 微生物学通报, 2012, 39(5): 702鄄710.
[15] 摇 朱静平, 孙丽. 甲烷厌氧氧化技术研究进展. 中国沼气, 2010, 28(2): 30鄄33, 37鄄37.
[16] 摇 Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1995, 59(1): 143鄄169.
[17] 摇 Mason I. Methane as a carbon source in biological denitrification. Journal Water Pollution Control Federation, 1977, 49(5): 855鄄857.
[18] 摇 Thalasso F, Vallecillo A, Garc侏a鄄Encina P, Fdz鄄polanco F. The use of methane as a sole carbon source for wastewater denitrification. Water
Research, 1997, 31(1): 55鄄60.
[19] 摇 Eisentraeger A, Klag P, Vansbotter B, Heymann E, Dott W. Denitrification of groundwater with methane as sole hydrogen donor. Water Research,
2001, 35(9): 2261鄄2267.
[20] 摇 Waki M, Suzuki K, Osada T, Tanaka Y, Ike M, Fujita M. Microbiological activities contributing to nitrogen removal with methane: effects of
methyl fluoride and tungstate. Bioresource Technology, 2004, 94(3): 339鄄343.
[21] 摇 Raghoebarsing A A, Pol A, van de Pas鄄Schoonen K T, Smolders A J P, Ettwig K F, Rijpstra W I C, Schouten S, Damst佴 J S, Op den Camp H J
M, Jetten M S M, Strous M. A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification. Nature, 2006, 440(7086): 918鄄921.
[22] 摇 Ettwig K F, Shima S, van de Pas鄄Schoonen K T, Kahnt J, Medema M H, Op den Camp H J, Jetten M S, Strous M. Denitrifying bacteria
anaerobically oxidize methane in the absence of Archaea. Environmental Microbiology, 2008, 10(11): 3164鄄3173.
[23] 摇 Ettwig K F, van Alen T, van de Pas鄄Schoonen K T, Jetten M S M, Strous M. Enrichment and molecular detection of denitrifying methanotrophic
bacteria of the NC10 phylum. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(11): 3656鄄3662.
[24] 摇 Hu S H, Zeng R J, Burow L C, Lant P, Keller J, Yuan Z G. Enrichment of denitrifying anaerobic methane oxidizing microorganisms.
Environmental Microbiology Reports, 2009, 1(5): 377鄄384.
[25] 摇 Zhu B L, van Dijk G, Fritz C, Smolders A J P, Pol A, Jetten M S M, Ettwig K F. Anaerobic oxidization of methane in a minerotrophic peatland:
enrichment of nitrite鄄dependent methane鄄oxidizing bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(24): 8657鄄8665.
[26] 摇 Luesken F A, van Alen T A, van der Biezen E, Frijters C, Toonen G, Kampman C, Hendrickx T L, Zeeman G, Temmink H, Strous M, Op den
Camp H J, Jetten M S. Diversity and enrichment of nitrite鄄dependent anaerobic methane oxidizing bacteria from wastewater sludge. Applied
Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(4): 845鄄854.
[27] 摇 Kampman C, Hendrickx T L G, Luesken F A, van Alen T A, Op den Camp H J M, Jetten M S M, Zeeman G, Buisman C J N, Temmink H.
0053 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
Enrichment of denitrifying methanotrophic bacteria for application after direct low鄄temperature anaerobic sewage treatment. Journal of Hazardous
Materials, 2012, 227鄄228: 164鄄171.摇
[28] 摇 Vecherskaya M, Dijkema C, Saad H R, Stams A J M. Microaerobic and anaerobic metabolism of a Methylocystis parvus strain isolated from a
denitrifying bioreactor. Environmental Microbiology Reports, 2009, 1(5): 442鄄449.
[29] 摇 Meulepas R J W, Jagersma C G, Gieteling J, Buisman C J N, Stams A J M, Lens P N L. Enrichment of anaerobic methanotrophs in a sulfate鄄
reducing membrane bioreactor. Biotechnology and Bioengineering, 2009, 104(3): 458鄄470.
[30] 摇 Jagersma G C, Meulepas R J W, Heikamp鄄de Jong I, Gieteling J, Klimiuk A, Schouten S, Damst佴 J S S, Lens P N L, Stams A J M. Microbial
diversity and community structure of a highly active anaerobic methane oxidizing sulfate鄄reducing enrichment. Environmental Microbiology, 2009,
11(12): 3223鄄3232.
[31] 摇 Jagersma C G, Meulepas R J W, Timmers P H A, Szperl A, Lens P N L, Stams A J M. Enrichment of ANME鄄1 from Eckernf觟rde Bay sediment on
thiosulfate, methane and short鄄chain fatty acids. Journal of Biotechnology, 2012, 157(4): 482鄄489.
[32] 摇 Webster G, Sass H, Cragg B A, Gorra R, Knab N J, Green C J, Mathes F, Fry J C, Weightman A J, Parkes R J. Enrichment and cultivation of
prokaryotes associated with the sulphate鄄methane transition zone of diffusion鄄controlled sediments of Aarhus Bay, Denmark, under heterotrophic
conditions. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 77(2): 248鄄263.
[33] 摇 Girguis P R, Cozen A E, DeLong E F. Growth and population dynamics of anaerobic methane鄄oxidizing archaea and sulfate鄄reducing bacteria in a
continuous鄄flow bioreactor. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(7): 3725鄄3733.
[34] 摇 闵航, 谭玉龙, 吴伟祥, 陈中云, 陈美慈. 一个厌氧甲烷氧化菌菌株的分离、纯化和特征研究. 浙江大学学报: 农业与生命科学版, 2002,
28(6): 619鄄624.
[35] 摇 Knittel K, Boetius A. Anaerobic oxidation of methane: progress with an unknown process. Annual Review of Microbiology, 2009, 63 ( 1):
311鄄334.
[36] 摇 Martinez R J, Mills H J, Story S, Sobecky P A. Prokaryotic diversity and metabolically active microbial populations in sediments from an active
mud volcano in the Gulf of Mexico. Environmental Microbiology, 2006, 8(10): 1783鄄1796.
[37] 摇 Mills H J, Martinez R J, Story S, Sobecky P A. Characterization of microbial community structure in Gulf of Mexico gas hydrates: comparative
analysis of DNA鄄 and RNA鄄derived clone libraries. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(6): 3225鄄3247.
[38] 摇 Lloyd K G, Lapham L, Teske A. An anaerobic methane鄄oxidizing community of ANME鄄 1b archaea in hypersaline Gulf of Mexico sediments.
Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(11): 7218鄄7230.
[39] 摇 Orphan V J, Hinrichs K U, Ussler III W, Paull C K, Taylor L T, Sylva S P, Hayes J M, Delong E F. Comparative analysis of methane鄄oxidizing
archaea and sulfate鄄reducing bacteria anoxic marine sediments. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(4): 1922鄄1934.
[40] 摇 Knittel K, L觟sekann T, Boetius A, Kort R, Amann R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and
Environmental Microbiology, 2005, 71(1): 467鄄479.
[41] 摇 Michaelis W, Seifert R, Nauhaus K, Treude T, Thiel V, Blumenberg M, Knittel K, Gieseke A, Peterknecht K, Pape T, Botius A, Amann R,
J覬rgensen B B, Widdel F, Peckmann J, Pimenov N V, Gulin M B. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.
Science, 2002, 297(5583): 1013鄄1015.
[42] 摇 Boetius A, Ravenschlag K, Schubert C J, Richert D, Widdel F, Gieseke A, Amann R, J覬rgensen B B, Witte U, Pfannkuche O. A marine
microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature, 2000, 407(6804): 623鄄626.
[43] 摇 Whittenbury R, Phillips K C, Wilkinson J F. Enrichment, isolation and some properties of methane鄄utilizing bacteria. Journal of General
Microbiology, 1970, 61(2): 205鄄218.
[44] 摇 Wu M L, Ettwig K F, Jetten M S M, Strous M, Keltjens J T, van Niftrik L. A new intra鄄aerobic metabolism in the nitrite鄄dependent anaerobic
methane鄄oxidizing bacterium Candidatus ‘Methylomirabilis oxyfera爷 . Biochemical Society Transactions, 2011, 39(1): 243鄄248.
[45] 摇 Orphan V J, House C H, Hinrichs K U, Mckeegan K D, Delong E F. Multiple archaeal groups mediate methane oxidation in anoxic cold seep
sediments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(11): 7663鄄7668.
[46] 摇 Treude T, Knittel K, Blumenberg M, Seifert R, Boetius A. Subsurface microbial methanotrophic mats in the Black Sea. Applied and Environmental
Microbiology, 2005, 71(10): 6375鄄6378.
[47] 摇 Niemann H, L觟sekann T, de Beer D, Elvert M, Nadalig T, Knittel K, Amann R, Sauter E J, Schl俟ter M, Klages M, Foucher J P, Boetius A.
Novel microbial communities of the Haakon Mosby mud volcano and their role as a methane sink. Nature, 2006, 443(7113): 854鄄858.
[48] 摇 L觟sekann T, Knittel K, Nadalig T, Fuchs B, Niemann H, Boetius A, Amann R. Diversity and abundance of aerobic and anaerobic methane
oxidizers at the Haakon Mosby Mud Volcano, Barents Sea. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(10): 3348鄄3362.
[49] 摇 Schubert C J, Vazquez F, L觟sekann T, Knittel K, Tonolla M, Boetius A. Evidence for anaerobic oxidation of methane in sediments of a freshwater
system (Lago di Cadagno) . FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(1): 26鄄38.
[50] 摇 Manz W, Eisenbrecher M, Neu T R, Szewzyk U. Abundance and spatial organization of gram negative sulfate鄄reducing bacteria in activated sludge
investigated by in situ probing with specific 16S rRNA targeted oligonucleotides. FEMS Microbiology Ecology, 1998, 25(1): 43鄄61.
[51] 摇 Devereux R, Kane M D, Winfrey J, Stahl D A. Genus鄄 and group鄄specific hybridization probes for determinative and environmental studies of
1053摇 11期 摇 摇 摇 周京勇摇 等:土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www.ecologica.cn
sulfate鄄reducing bacteria. Systematic and Applied Microbiology, 1992, 15(4): 601鄄609.
[52] 摇 Wankel S D, Adams M M, Johnston D T, Hansel C M, Joye S B, Girguis P R. Anaerobic methane oxidation in metalliferous hydrothermal
sediments: influence on carbon flux and decoupling from sulfate reduction. Environmental Microbiology, 2012, 2726鄄2740.
[53] 摇 Maignien L, Parkes R J, Cragg B, Niemann H, Knittel K, Coulon S, Akhmetzhanov A, Boon N. Anaerobic oxidation of methane in hypersaline
cold seep sediments. FEMS Microbiology Ecology, 2013, 83(1): 214鄄231.
[54] 摇 Orphan V J, House C H, Hinrichs K U, McKeegan K D, Delong E F. Methane鄄consuming archaea revealed by directly coupled isotopic and
phylogenetic analysis. Science, 2001, 293(5529): 484鄄487.
[55] 摇 Woese C R, Gutell R, Gupta R, Noller H F. Detailed analysis of the higher鄄order structure of 16S鄄like ribosomal ribonucleic acids. Microbiology
Reviews, 1983, 47(4): 621鄄669.
[56] 摇 Head I M, Saunders J R, Pickup R W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated
microorganisms. Microbial Ecology, 1998, 35(1): 1鄄21.
[57] 摇 Girguis P R, Orphan V J, Hallam S J, Delong E F. Growth and methane oxidation rates of anaerobic methanotrophic archaea in a continuous鄄flow
bioreactor. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(9): 5472鄄5482.
[58] 摇 Miyashita A, Mochimaru H, Kazama H, Ohashi A, Yamaguchi T, Nunoura T, Horikoshi K, Takai K, Imachi H. Development of 16S rRNA gene鄄
targeted primers for detection of archaeal anaerobic methanotrophs (ANMEs). FEMS Microbiology Letters, 2009, 297(1): 31鄄37.
[59] 摇 Thomsen T R, Finster K, Ramsing N B. Biogeochemical and molecular signatures of anaerobic methane oxidation in a marine sediment. Applied and
Environmental Microbiology, 2001, 67(4): 1646鄄1656.
[60] 摇 Stahl D A, Amann R. Development and application of nucleic acid probes / / Stackebrandt E, Goodfellow M, eds. Nucleic Acid Techniques in
Bacterial Systematics. England, Chichester: Wiley and Sons, 1991: 205鄄248.
[61] 摇 Banning N, Brock F, Fry J C, Parkes R J, Hornibrook E C, Weightman A J. Investigation of the methanogen population structure and activity in a
brackish lake sediment. Environmental Microbiology, 2005, 7(7): 947鄄990 .
[62] 摇 Juretschko S, Timmermann G, Schmid M, Schleifer K H, Pommerening鄄R觟ser A, Koops H P, Wagner M. Combined molecular and conventional
analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira鄄like bacteria as dominant populations. Applied
and Environmental Microbiology, 1998, 64(8): 3042鄄3051.
[63] 摇 Kr俟ger M, Meyerdierks A, Gl觟ckner F O, Amann R, Widdel F, Kube M, Reinhardt R, Kahnt J, B觟cher R, Thauer R K, Shima S. A
conspicuous nickel protein in microbial mats that oxidize methane anaerobically. Nature, 2003, 426(6968): 878鄄881.
[64] 摇 Lueders T, Chin K J, Conrad R, Friedrich M. Molecular analyses of methyl鄄coenzyme M reductase鄄subunit (mcrA) genes in rice field soil and
enrichment cultures reveal the methanogenic phenotype of a novel archaeal lineage. Environmental Microbiology, 2001, 3(3): 194鄄204.
[65] 摇 Hales C N, Desai M, Ozanne S E, Crowther N J. Fishing in the stream of diabetes: from measuring insulin to the control of fetal organogenesis.
Biochemical Society Transactions, 1996, 24(2): 341鄄350.
[66] 摇 Hallam S J, Girguis P R, Preston C M, Richardson P M, Delong E F. Identification of methyl coenzyme M reductase A (mcrA) genes associated
with methane鄄oxidizing archaea. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(9): 5483鄄5491.
[67] 摇 Nunoura T, Oida H, Toki T, Ashi J, Takai K, Horikoshi K. Quantification of mcrA by quantitative fluorescent PCR in sediments from methane
seep of the Nankai Trough. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 57(1): 149鄄157.
[68] 摇 Lever M A. Anaerobic Carbon Cycling Pathways in the Subseafloor Investigated via Functional Genes, Chemical Gradients, Stable Carbon Isotopes,
and Thermo鄄Dynamic Calculations [D]. Chapel Hill, NC, USA: The University of North Carolina at Chapel Hill, 2008.
[69] 摇 Luton P E, Wayne J M, Sharp R J, Riley P W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen
populations in landfill. Microbiology, 2002, 148(11): 3521鄄3530.
[70] 摇 Ettwig K F, Butler M K, Paslier D L, Pelletier E, Mangenot S, Kuypers M M M, Schreiber F, Dutilh B E, Zedelius J, de Beer D Gloerich J,
Wessels H J C T, van Alen T, Luesken F, Wu M L, van de Pas鄄Schoonen K T, Op den Camp H J M, Janssen鄄Megens E M, Francoijs K J,
Stunnenberg H, Weissenbach J, Jetten M S M, Strous M. Nitrite鄄driven anaerobic methane oxidation by oxygenic bacteria. Nature, 2010, 464
(7288): 543鄄548.
[71] 摇 Holmes A J, Costello A, Lidstrom M E, Murrell J C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be
evolutionarily related. FEMS Microbiology Letters, 1995, 132(3): 203鄄208.
[72] 摇 Costello A M, Lidstrom M E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake
sediments. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(11): 5066鄄5074.
[73] 摇 Bourne D G, McDonald I R, Murrell J C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish
soils. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(9): 3802鄄3809.
[74] 摇 Kool D M, Zhu B L, Rijpstra W I C, Jetten M S M, Ettwig K F, Damst佴 J S S. Rare Branched Fatty Acids Characterize the Lipid Composition of
the Intra鄄Aerobic Methane Oxidizer "Candidatus Methylomirabilis oxyfera" . Applied and Environmental Microbiology, 2013, 78(24): 8650鄄8656.
[75] 摇 Ho A, Vlaeminck S E, Ettwig K F, Schneider B, Frenzel P, Boon N. Revisiting methanotrophic communities in sewage treatment plants. Applied
and Environmental Microbiology, 2013, 79(8): 2841鄄2846.
2053 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
[76]摇 Van der Star W R L, Abma W R, Blommers D, Mulder J W, Tokutomi T, Strous M, Picioreanu C, van Loosdrecht M C M. Startup of reactors for
anoxic ammonium oxidation: experiences from the first full鄄scale anammox reactor in Rotterdam. Water Research, 2007, 41(18): 4149鄄4163.
[77] 摇 Zhang, G S, Tian J Q, Jiang N, Guo X P, Wang Y F, Dong X Z. Methanogen community in Zoige wetland of Tibetan plateau and phenotypic
characterization of a dominant uncultured methanogen cluster ZC鄄I. Environmental Microbiology, 2008, 10(7): 1850鄄1860.
[78] 摇 Deutzmann J S, Schink B. Anaerobic oxidation of methane in sediments of Lake Constance, an oligotrophic freshwater lake. Applied and
Environmental Microbiology, 2011, 77(13): 4429鄄4436.
[79] 摇 Kadnikov V V, Mardanov A V, Beletsky A V, Shubenkova O V, Pogodaeva T V, Zemskaya T I, Ravin N V, Skryabin K G. Microbial community
structure in methane hydrate鄄bearing sediments of freshwater Lake Baikal. FEMS Microbiology Ecology, 2012, 79(2): 348鄄358.
[80] 摇 Alain K, Holler T, Musat F, Elvert M, Treude T, Kr俟ger M. Microbiological investigation of methane鄄 and hydrocarbon鄄discharging mud volcanoes
in the Carpathian Mountains, Romania. Environmental Microbiology, 2006, 8(4): 574鄄590.
[81] 摇 Lu Z M, He Z L, Parisi V A, Kang S, Deng Y, Van Nostrand J D, Masoner J R, Cozzarelli I M, Suflita J M, Zhou J Z. GeoChip鄄based analysis
of microbial functional gene diversity in a landfill leachate鄄contaminated aquifer. Environmental Science & Technology, 2013, 46(11): 5824鄄5833.
[82] 摇 L佼pez鄄Archilla A I, Moreira D, Velasco S, Garcia L P. Archaeal and bacterial community composition of a pristine coastal aquifer in Do觡ana
National Park, Spain. Aquatic Microbial Ecology, 2007, 47(2): 123鄄139.
[83] 摇 Chang Y H, Cheng T W, Lai W J, Tsai W Y, Sun C H, Lin L H, Wang P L. Microbial methane cycling in a terrestrial mud volcano in eastern
Taiwan. Environmental Microbiology, 2012, 14(4): 895鄄908.
[84] 摇 Wrede C, Brady S, Rockstroh S, Dreier A, Kokoschka S, Heinzelmann S M, Reitner J, Taviani M, Daniel R, Hoppert M. Aerobic and anaerobic
methane oxidation in terrestrial mud volcanoes in the Northern Apennines. Sedimentary Geology, 2012, 263: 210鄄219.
[85] 摇 Takeuchi M, Yoshioka H, Seo Y, Tanabe S, Tamaki H, Kamagata Y, Takahashi H A, Igari S, Mayumi D, Sakata S. A distinct freshwater鄄
adapted subgroup of ANME鄄 1 dominates active archaeal communities in terrestrial subsurfaces in Japan. Environmental Microbiology, 2011, 13
(12): 3206鄄3218.
[86] 摇 Steinberg L M, Regan J M. Phylogenetic comparison of the methanogenic communities from an acidic, oligotrophic fen and an anaerobic digester
treating municipal wastewater sludge. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(21): 6663鄄6671
[87]摇 Castro H, Ogram A, Reddy K R. Phylogenetic characterization of methanogenic assemblages in eutrophic and oligotrophic areas of the Florida
Everglades. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(11): 6559鄄6568.
[88] 摇 Takerchi M, Komai T, Hanada S, Tamaki H, Tanabe S, Miyachi Y, Uchiyama M, Nakazawa T, Kimura K, Kamagata Y. Bacterial and archaeal
16S rRNA genes in Late Pleistocene to Holocene muddy sediments from the Kanto Plain of Japan. Geomicrobiology Journal, 2009, 26 ( 2):
104鄄118.
[89] 摇 Cadillo鄄Quiroz H, Yashiro E, Yavitt J B, Zinder S H. Characterization of the archaeal community in a minerotrophic fen and terminal restriction
fragment length polymorphism鄄directed isolation of a novel hydrogenotrophic methanogen. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(7):
2059鄄2068.
[90] 摇 Cadillo鄄Quiroz H, Brauer S, Yashiro E, Sun C, Yavitt J, Zinder S. Vertical profiles of methanogenesis and methanogens in two contrasting acidic
peatlands in central New York State, USA. Environmental Microbiology, 2006, 8(8): 1428鄄1440.
[91] 摇 Kasai Y, Takahata Y, Hoaki T, Watanabe K. Physiological and molecular characterization of a microbial community established in unsaturated,
petroleum鄄contaminated soil. Environmental Microbiology, 2005, 7(6): 806鄄818.
[92] 摇 Kojima H, Tsutsumi M, Ishikawa K, Lwata T, Mu茁mann M, Fukui M. Distribution of putative denitrifying methane oxidizing bacteria in sediment
of a freshwater lake, Lake Biwa. Systematic and Applied Microbiology, 2012, 35(4): 233鄄238.
[93] 摇 朱群, 沈李东, 胡宝兰, 楼莉萍, 程东庆. 西湖底泥中的反硝化型甲烷厌氧氧化菌的分子生物学检测. 环境科学学报, 2013, 33(5):
1321鄄1325.
[94] 摇 Wang Y, Zhu G B, Harhangi H R, Zhu B L, Jetten M S M, Yin C Q, Op den Camp H J M. Co鄄occurrence and distribution of nitrite鄄dependent
anaerobic ammonium and methane oxidizing bacteria in a paddy soil. FEMS Microbiology Letters, 2012, 336(2): 79鄄88.
[95] 摇 郑勇, 郑袁明, 张丽梅, 贺纪正. 极端环境下嗜热酸甲烷营养细菌研究进展. 生态学报, 2009, 29(7): 3864鄄3871.
3053摇 11期 摇 摇 摇 周京勇摇 等:土壤中甲烷厌氧氧化菌多样性的分子检测 摇