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2012
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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.5
Sep.2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.05.012
NOPH
:2012-04-15
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Cloningandexpressionofphenylalanineammonialyasegeneof
RhodosporidiumtoruloidesinEscherichiacoli
HOUWenting,ZHANGLiang,GUZhenghua,DINGChongyang,SHIGuiyang
(NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,KeyLaboratoryofIndustrial
BiotechnologyoftheMinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:ThecDNAfragmentofpalgenewasamplifiedfromRhodosporidiumtoruloidesbyRTPCR.Nu
cleotidesequencingidentifiedthegeneof99% similaritywithreportedpalgene.UsingpET28a(+)with
T7promoterasavector,therecombinantplasmidpET28a(+)palwasconstructedandthenexpressedin
E.coliBL21(DE3).Afteroptimization,thespecificactivityofPALreached4299U/g.Theconversion
rateoftranscinnamicacidwas4852% andtheconcentrationofLphenylalaninewas173g/LItwas
shownthatthegenepalfromR.toruloideswashighlyexpressed.
Keywords:phenylalanineammonialyase(PAL);reversetranscription;recombinantexpression
WXKWF
(phenylalanineammonialyase,
PAL,EC4315)
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PCR
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5µè
99%。
1—palgene;M—λDNA/PstImarker
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pal
J¬
RT PCR
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Fig.2 ElectrophoresisanalysisofRTPCRproductof
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1—pMD18 T pal/EcoRI;M—λDNA/PstImarker
f
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pMD18 T pal
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Fig.3 Electrophoresisanalysisofenzymatic
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pET 28a(+) pal^
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Fig.4 Enzymeanalysisofrecombinant
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2—pET 28a(+) pal/EcoliBL21(DE3);
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Fig.5 SDSPAGEanalysisofPALexpressionlevels
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Fig.8 Efectoftemperatureonspecific
activityofPAL
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.IÊ234
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Fig.9 EfcetofIPTGaddingtimeon
specificactivityofPAL
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[13]。
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[14]
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[15]
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:
[1]
¹9Î
,
r
,
b-
.
WXKWF
(PAL)
2ÅÓdh
[J].
NRYÆ»®
,2008,29(7):306308.
[2]
ÔF
,
!cd
,
Ùª
.
WXKWF2²*TL¼ÅÓ
dh
[J].
5¤ôõTL¼i
,2002,8(6):672675.
[3] GilbertHJ,ClarkeN,GibsonRK,etal.Molecularcloningofthe
phenylalanineammonialyasegenefromRhodosporidiumtoruloides
inEscherichiacoliK12[J].JBacteriol,1985,161(1):314320.
[4]
or
.
WXKWFSh2norsÆÂ
cDNA
¿2
¢
[D].
Ð
:
$¼
,2008.
[5]
ȍ
,
eKÊ
,
5eh
,
y
.
m_åWXKWFSh2
qn
[J].
ż¼i
:
¹º»¼Á
,1993,12(4):1822.
[6] GilbertHJ,TulyM.Synthesisanddegradationofphenylalanine
ammonialyaseofRhodosporidium toruloides[J].JBacteriol,
1982,150(2):498505.
[7] SambrookJ,RusselDW.Molecularcloning:alaboratorymanual
[M].NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,2001.
[8] JiaSR,CuiJD,LiY.etal.ProductionofLphenylalaninefrom
transcinnamicacidsbyhighlevelexpressionofphenylalanine
ammonialyasegenefromRhodosporidiumtoruloidesinEscherichia
coli[J].BiochemEngJ,2008,42(3):193197.
[9] YamadaS,NabeK,IzuoN,etal.ProductionofLphenylalanine
fromtranscinnamicacidwithRhodotorulaglutiniscontrainingL
phenylalanineammonialyaseactivity[J].ApplEnvironMicrobi
ol,1981,42(5):773778.
[10]
¹¤Î
,
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,
hi
.
WXKWF ¡S
@g`,mRK½MXG9%
[J].
mÃ9¼Y¶¼i
,
2008,22(6):10151019.
[11]
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,
%
,
klm
,
y
.T7
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cDNA
¡Sc2mx
r²Ï9
[J].
TLY¶¼i
,
1997,13(4):362367.
[12] Novagen
mÌ
.pET
Ú¡\ç÷
[EB/OL].[20120102].
htp://ishare.iask.sina.com.cn/f/18559596.html?from=isn
om.
[13]
\nt
.
IY¶Q¼
[M].
¿À
:
äNTNÁ
,2010:99.
[14] OrumH,RasmussenOF.ExpressioninE.coliofthegeneenco
dingphenylalanineammonialyasefromRhodosporidiumtoruloides
[J].ApplMicrobiolBiotechnol,1992,36(6):745748.
[15] FaulknerJDB,AnsonJG,TuiteMF,eta1.Highlevelexpres
sionofthephenylalanineammonialyaseencodinggenefromRho
dosporiciumtoruloidesinSaccharomycescerevisiaeandEscherichia
coliusingabifunctionalexpressionsystem[J].Gene,1994,
143(1):
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