全 文 ：第 ws卷 第 w期
u s s w年 z 月
林 业 科 学
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∂²¯1ws o‘²1w
∏¯ qou s s w
tsz杨次生木质部 °„基因的 • ×2°≤• 扩增及其鉴定
薛永常
k大连轻工业学院生物与食品学院 大连 ttysvwl
李金花 卢孟柱 张绮纹
k中国林业科学研究院林业研究所 北京 tsss|tl
关键词 } 欧美杨 tsz o苯丙氨酸解氨酶k°„l o • ×2°≤• o载体构建
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kusswlsw p st|v p sx
收稿日期 }ussu p tt p sy ∀
基金项目 }国家林业局 |w{项目 ) ) ) 控制林木木质素合成酶基因的引进及其转化技术研究k|w p w p utl ∀
Χλονινγ ανδ Ιδεντιφιχατιον οφ ΠΑΛ Γενε Αµ πλιφιεδ βψ ΡΤ2ΠΧΡ φροµ
Ποπυλυσ≅ ευραµεριχανα χϖq/ zwΠzy0 Σεχονδ Ξψλεµ µ ΡΝΑ
÷∏¨ ≠²±ª¦«¤±ª
k Χολλεγε οφ Βιο q & Φοοδ Τεχη qo ∆αλιαν Ινστιτυτε οφ Λιγητ Ινδυστρψ ∆αλιανttysvwl
¬¬±«∏¤ ∏ ±¨ª½«∏ «¤±ª ±¬º¨ ±
k Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ ΦορεστρψoΧΑΦ Βειϕινγtsss|tl
Αβστραχτ} „ ©µ¤ª°¨ ±·²© °„k³«¨ ±¼¯ ¤¯¤±¬±¨ ¤°°²±¬¤p¯¼¤¶¨l ª¨ ±¨ º¤¶¤°³¯¬©¬¨§ ¥¼ • ×p°≤• ©µ²° ³²³¯¤µk Ποπυλυσ ≅
ευραµεριχανα¦√ q / zwΠzy0l §¨√¨ ²¯³¬±ª ¶¨¦²±§ ¬¼¯ °¨ °• ‘„ qŒ·º¤¶ ¦¯²±¨ §¬±·² ³Š∞2× ∞¤¶¼ √¨ ¦·²µ¤±§¬§¨±·¬©¬¨§ ¥¼
µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ o °≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ¤±§ ¶¨ ∏´¨±¦¬±ªq ׫¨ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ²©·«¨ ¤°³¯¬©¬¨§ ⁄‘„ ©µ¤ª°¨ ±·º¤¶xyx ¥¤¶¨ ³¤¬µ¶q
„¯¬ª±°¨ ±·º¬·«·«¨ Πq κιτακαµιενσισ °„¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨ µ¨·µ¬¨√¨ §©µ²° ∞…±∏¦¯¨ ²·¬§¨ ¤¦¬§§¤·¤¥¤¶¨ k¤¦¦¨¶¶¬²± ±∏°¥¨µ
⁄vsyxyl ¶«²º¨ §·«¤··«¨ ©¬µ¶·wss ¥¤¶¨ ³¤¬µ¶¬± ¥²·«¶¨ ∏´¨±¦¨¶º¨ µ¨ ¤¯°²¶·¬§¨±·¬¦¤¯ q׫¨µ¨©²µ¨ ·«¨ ©µ¤ª°¨ ±·º¤¶³¤µ·²©°„
ª¨ ±¨ q„±§¥²·«²©¶¨±¶¨ ¤±§¤±·¬2¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¤¯ √¨ ¦·²µ¶º¨ µ¨ ¦²±¶·µ∏¦·¨§q
Κεψ ωορδσ} Ποπυλυσ≅ ευραµεριχανα¦√ q/ zwΠzy0 o°«¨ ±¼¯ ¤¯¤±¬±¨ ¤°°²±¬¤2¯ ¼¤¶¨k°„l o• ×2°≤• o∂ ¦¨·²µ¦²±¶·µ∏¦·¬²±
木质素是一种由肉桂醇等单体聚合而成的酚类多聚体 o是植物体中一种主要的天然产物 o广泛存在于维
管植物中 ∀木本植物中木质素含量较高 o一般约占干重的 tx h ∗ vy h k⁄²∏ª¯¤¶ot||yl ∀木质素与纤维素 !几
丁质一起成为世界上最丰富的天然多聚物之一 o是仅次于纤维素而居第二的有机组分 ∀木材中木质素的含
量与木材利用关系密切 ∀培育木质素含量低的林木品种是提高纸浆材纸浆得率的一个重要手段 ∀木质素是
在一系列酶类催化下聚合而成的 o通过对这些酶的调节可以控制木质素单体的合成速率 o从而影响木质素的
组成和含量 ∀在此方面已经做了大量的工作 o并且得到了木质素含量或组成发生变化的转基因植株
k„·¤±¤¶¶²√¤ ετ αλqot||x ~ ≤¤°³¥¨¯¯ ετ αλqot||y ~ ⁄²∏ª¯¤¶ot||y ~ Šµ¬°¤2°¨ ·¨ ±¤·¬ ετ αλqot||| ~ …²¨µ­¤± ετ αλqo
ussvl ∀°„k苯丙氨酸解氨酶l作为木质素生物合成途径中的第一个限速酶 o其表达及其丰度直接影响木质
素生物合成的整个过程 ∀杨树 °„活性主要在正在发育的木质部 !嫩茎和嫩叶中最高k≥«¬±­¬ ετ αλqot||zl ∀
而在刺槐k Ροβινια πσευδοαχαχιαl树干中 o显著的 °„活性表现在边材的较嫩部分k与木质化有关l和边材 p心
材的分界处k与类黄酮生物合成有关lk‹∏ ετ αλqot|||l ∀当 °„活性下降时 o植物体中的木质素含量下降 u
倍k…¤·¨ ετ αλqot||w ~≥¨ º¤¯·ετ αλqot||zl o木质素单体发生变化 oŠ单体含量降低 ∀°„的超量表达后木质素
的含量明显增加了k’¶¤®¤¥¨ ετ αλqot||xl ∀本文通过对欧美杨 tsz杨k Ποπυλυσ≅ ευραµεριχανα ¦√ q / zwΠzy0l次
生木质部中 °• ‘„进行 • ×2°≤• 扩增 o期望得到在木质部特异表达的 °„基因片段 o通过载体构建转化其它
树种 o得到木质素含量或其组成发生改变的转基因植株 ∀
1 材料与方法
t qt 材料和试剂 植物材料为正在分化的 u ¤生 tsz杨茎的次生木质部 ∀试剂中 ±∏¬¦®³µ²³ ¬µ¦² °• ‘„
°∏µ¬©¬¦¤·¬²± ®¬·为 „°¨ µ¶«¤° °«¤µ°¤¦¬¤…¬²·¨¦«q公司产品 o≥∏³¨µ¶¦µ¬³·× ’±¨ 2≥·¨³ • ×2°≤• ≥¼¶·¨°为 ŠŒ…≤’2…•公
司产品 o³Š∞2× ∞¤¶¼载体k³Š∞2× ∞¤¶¼ ∂ ¦¨·²µl !³Š∞2z©k n l !≤Œ„° !琼脂糖 !×w ⁄‘„连接酶 !§‘×° !t®¥⁄‘„
¤§§¨µ为 °µ²°¨ ª¤公司产品 ∀ פ´ ⁄‘„ 聚合酶为北京鼎国生物技术发展中心产品 o使用的重蒸水为经过
¬¯¯¬2± 超纯水器过滤及除菌并经高温高压灭菌后的水 ∀
t1u 研究方法与步骤 ktl材料的处理 }参考 …∏ª²¶等kt||xl法 ∀取正在分化的 u ¤生 tsz杨茎部 o剥去树皮
部分 o只剩下里面的木质部和部分形成层部分 o用消毒过的医用解剖刀迅速刮取次生木质部表面 o厚度约 t
°°左右 ∀液氮研磨成粉末后 o提取 °• ‘„ ∀
kul°• ‘„提取 }按 ±∏¬¦®³µ²³ ¬¦µ² °• ‘„ °∏µ¬©¬¦¤·¬²± ®¬·试剂盒提供的方法提取 °• ‘„ ∀
kvl • ×2°≤• 扩增 }按 ≥∏³¨µ≥¦µ¬³·× ’±¨ 2≥·¨³ • ×2°≤• 试剂盒提供的条件对提取的 °• ‘„进行 • ×2°≤• 扩
增 o根据实际情况略有改动 ∀扩增引物是根据 ∞…k欧洲分子生物学实验室l中 ’¶¤®¤¥¨ 等kt||xl发表的
Ποπυλυσ κιτακαµιενσισ 叶 片 °„ 的 ¦⁄‘„ 序 列 k ⁄vsyxy l 设 计 的 o其 序 列 为 }正 向 引 物 } xχ2
×׊≤„Š„„„≤≤„„„Š≤„„Š„vχ ~反向引物 }xχ2≤×≤≤×≤≤„„„׊≤≤×≤„„Š× vχ ∀在 °¨ µ®¬±2∞¯ °¨ µ Š¨ ±¨ „°³ °≤•
≥¼¶·¨° |yss上进行 • ×2°≤• 扩增 ∀扩增体系为 xs ˏo其中 u ≅反应混合物 ux ˏo模板 °• ‘„ k约 ts ±ª#ˏptl
u ˏo正向引物及反向引物kts Λ°²¯#ptl各 t ˏo水 us ˏo• ×Πפ´ 酶混合物 t ˏ ∀扩增条件 }¦⁄‘„合成为
xs ε vs °¬±∀预变性为 |w ε v °¬±∀vy个循环为 }变性 o|w ε vs¶~退火 oxz ε t °¬±~延伸 ozuβ≤ t °¬±∀循环完
毕后在 zu ε 延伸 ts °¬±∀利用 ≥∏³¨ ¦¯²Œ±¦q公司的 Š¨ ±∞¯∏·¨× ¬±∏¶∞·…µ≥³¬± ≤²¯∏°±¶试剂盒条件纯化回收
t h琼脂糖电泳后的目的片段 ∀
kwl目的片段与 × p载体k³Š∞2× ∞¤¶¼ ∂ ¦¨·²µl的直接连接 }按试剂盒条件进行 o在室温kuxβ≤l连接 v «
后 o用于转化大肠杆菌 ts| ∀
kxl重组质粒的鉴定 }采用限制性内切酶酶切 !特异性引物扩增及测序 ∀
kyl中间载体的构建 }将 ³Š∞2z©k n l载体和上面获得的经鉴定正确的重组质粒分别用 ∞¦²• ´进行单
酶切 ∀单酶切后的 ³Š∞2z©k n l载体经 ≤Œ„°k小牛碱式磷酸酶l脱磷酸化 o然后与上述重组质粒的 ∞¦²• ´
酶切后的目的片段进行连接 o转化大肠杆菌 ts| ∀所得重组质粒经测序鉴定插入片段的方向 ∀
kzl°„表达载体的构建 }分别用 ÷¥¤´和 …¤°‹ ´双酶切kyl中得到的已经鉴定方向的重组质粒和 ³…´
tut质粒 o回收重组质粒酶切的目的 ⁄‘„片段和中间载体 ³…´ tut的 ⁄‘„大片段 o进行连接 o构建了正义
°„植物表达载体 ∀同理 o分别用 ÷¥¤ ´和 …¤°‹ ´双酶切kyl中得到的已经鉴定方向的重组质粒和 ³…¬±
wv{质粒 o回收目的 ⁄‘„片段和中间载体 ³…¬± wv{的 ⁄‘„大片段 o进行连接 o从而构建了 °„反义植物表达
载体 ∀用于转化根瘤农杆菌kΑγροβαχτεριυµ τυµεφεχιενσl…„wwsw ∀
2 结果与分析
u qt tsz杨次生木质部中 °• ‘„含量及性质的鉴定 制备高纯度的 °• ‘„是 • ×2°≤• 成功的必要前提 ∀对
步骤kul提取的 °• ‘„经稀释后分别在 uys ±°和 u{s ±°处测定其吸收值 ∀其 ’⁄uysΠ’⁄u{s比值大于 t1y o表明
该 °• ‘„纯度符合试验要求 ∀经计算 °• ‘„的得率为 us1{ Λª#ªpt鲜重 ∀
u qu 目的基因片断的克隆及其鉴定 按 …∏ª²¶等kt||xl法提取的 °• ‘„经 • ×2°≤• 扩增 !t h琼脂糖电泳后
分析可知 o其扩增的 ⁄‘„片段约为 yss ¥³左右 o和期望的大小基本相当 ∀选取在 ³Š∞2× ∞¤¶¼载体上的 u
个内切酶 °¶·´ 和 ‘¦²´对重组质粒进行双酶切 o得到一个约 yss ¥³的片段 o且在测序结果中找到了所采用
的正向引物序列与反向引物序列 o插入片段为 xyx¥³o因此可以断定插入载体的 ⁄‘„片段即为所扩增的 ⁄‘„
片段 o从而证明了重组质粒的正确性 ∀
利用 ≤¯ ∏¶·¤¯¬t1{软件将 • ×2°≤• 扩增的 °„片段序列与 ’¶¤®¤¥¨ 等kt||xl在 ∞…核酸序列库上发表
的 Πq κιτακαµιενσισ叶片 °„的¦⁄‘„序列k⁄vsyxyl进行比较 o其结果如图 t ∀从图 t可以看出 o经 • ×2°≤• 所
扩增的 ⁄‘„ 片段与 Πq κιτακαµιενσισ的 °„的 ¦⁄‘„ 序列的前 wss个碱基几乎完全相同 o其相似度超过
|x h ∀基本可以断定此扩增的 ⁄‘„片段即为 °„基因片段 ∀从而证明了重组质粒中插入片段的正确性 ∀
此重组质粒定名为 ³Š∞2×2°„质粒 ∀
u qv 中间载体构建 在方法kyl中构建的重组质粒经限制性内切酶酶切 !特异引物扩增及测序证明插入到
³Š∞2z©k n l载体的 ⁄‘„片段即为所扩增的片段 o测序证明该片段是以正向插入的 o此中间载体定名为
³Š∞2z©k n l2°„∀
w|t 林 业 科 学 ws卷
图 t 扩增的 ⁄‘„片段与 Πq κιτακαµιενσισ
°„¦⁄‘„序列的比较图
ƒ¬ªqt „¯¬ª±°¨ ±·²© ⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤°³¯¬©¬¨§©µ²° Πq ≅ ευραµεριχανα ¦√ q/ zwΠ
zy0 ¶¨¦²±§¬¼¯ °¨ °• ‘„ º¬·«·«¨ °„¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ©µ²° Πq κιτακαµιενσισ
相同碱基用 3 表示 ∀ ³¤¯ 为 tsz杨扩增产物 °„片段序列 o°„t为 Πq
κιτακαµιενσισ的 °„¦⁄‘„序列 ∀Œ§¨ ±·¬¤¯ µ¨¶¬§∏¨¶¤µ¨ °¤µ®¨ §¥¼¤¶·¨µ¬¶®¶¥¯²º
·«¨ ¤¯¬ª±°¨ ±·q³¤¯ ¬¶⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ¤°³¯¬©¬¨§©µ²° Πq≅ ευραµεριχανα ¦√ q/ zwΠ
zy0 ~°„t ¬¶·«¨ ²µ¬ª¬±¤¯ °„¦⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ©µ²° Πq κιτακαµιενσισq
u qw 表达载体构建 在选择双元载体时就应该考
虑载体上的多克隆位点与中间载体相应酶切位点
间的相互关系问题 o以便最终决定中间载体的酶切
片段在双元载体的插入方向 ∀本文所选择的双元
载体 ³…´ tut和 ³…¬± wv{都有 ÷¥¤´和 …¤°‹ ´酶
切位点 o但二者的方向相反 o这就为构建 °„的正
义和反义表达载体提供了方便 ∀构建结果示意图
如图 u !v ∀通过对重组质粒的特异引物的 °≤• 扩
增 o能够扩增出和目的片段一样大小的扩增片段 o
从而证明该目的片段的确插入了该载体中 ∀
³…¬±wv{为中国科学院微生物研究所构建的一
个双元载体 o它含有双倍增强子的 ≤¤ ∂vx≥启动
子及 א / 80片段翻译增强子 o它能介导外源基因在
杨树中的高效表达 k李太元等 ot||w ~陈颖等 o
t||xl ∀本文将目的 ⁄‘„片段克隆到该双元载体 o
去转化农杆菌 ∀通过对重组质粒的特异引物 °≤•
扩增 o能够得到和目的片段一样大小的扩增片段 o
从而证明该目的片段的确插入到了该载体中 ∀
3 讨论
木质素是由不同的木质素单体聚合而成的 ∀
高等植物中主要有 u种类型 }k¤l裸子植物木质素
主要包括邻甲氧基苯基亚基kŠ单体l o及由松柏醇
及少数由 π p肉桂醇聚合而成的 π p羟苯基亚基
k‹单体l ~k¥l被子植物木质素既包括由芥子醇聚
合成的芥子基亚基k≥单体l o还有 Š单体及少量的
‹单体 ∀在双子叶植物中 oŠ单体和 ≥ 单体占主
要 ∀木质素含量是造纸业中的主要限制因子 oŠΠ≥
单体的比例对于造纸中木质素的去除难易起着决
定性作用 ∀在具相似木质素含量的裸子植物和被
子植物中 o被子植物中的木质素较易去除k≤«¬¤±ª
ετ αλqot|{{l o且针叶树纸浆的残余木质素含量要
比阔叶树纸浆高 o表明木质素分子结构而不是其含
量是决定其能否快速去除的主要因子 ∀而被子植
物中 Š亚基的降低和 ≥亚基的比例增加 o木质素在
造纸中更易去除k≤«¬¤±ª ετ αλqot|{{ ~ °¬´∏¨ °¤¯ ετ
αλqot||{l ∀因为 °„活性下降导致木质素单体中
Š单体含量降低 o因此 ≥Њ比率上升k≥¨ º¤¯·ετ αλqo
t||zl o对于造纸的木材中木质素的去除有利 ∀ °„
可能参与了 Š单体或 ≥单体特异途径的代谢调节
从而影响了 ≥Њ的比率k…¤·¨ ετ αλqot||wl ∀因此木
质素单体组成改变已经成为基因工程提高木浆得
率的主要手段 ∀木质素合成酶基因的表达具有一定的时空性 o‹∏等kt||{l在美洲山杨k Πqτρεµυλοιδεσl发现 u
种在区域化和生理功能上不同的 w≤kw p肉桂酸 ≤²„连接酶l基因 ) ) ) °·w≤t和 °·w≤u o二者分别在正在分
x|t 第 w期 薛永常等 }tsz杨次生木质部 °„基因的 • ×2°≤• 扩增及其鉴定
化的木质部组织及表皮细胞中表达 ∀另外他们发现在 °·w≤t表达受抑制的杨树中虽然木质素最高降低了
wx h o但其纤维素含量增加了 tx h o在转基因品系中在细胞水平和整株水平上的结构整体性没有变化k‹∏ ετ
αλqot|||l ∀木质素和纤维素间的消长对于提高木浆得率也起着主要的作用 ∀本文从 tsz杨次生木质部
°• ‘„所扩增的 ⁄‘„片段与 Πq κιτακαµιενσισ的叶片 °„的 ¦⁄‘„序列的前 wss个碱基几乎完全相同 o但整
个序列仍有很大差别 o说明 °„基因在叶片 !次生木质部不同部位表达也具有时空性 o可能是同一个基因的
不同区域表达 ∀
图 u °„的正向表达载体 ³…´tut2°„的构建
ƒ¬ªqu ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¤¯ √¨ ¦·²µ
³…´tut2°„²©°„Š¨ ±¨
图 v °„反义表达载体 ³…¬±wv{p°„的构建
ƒ¬ªqv ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²©¤±·¬p¶¨±¶¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¤¯ √¨ ¦·²µ
³…¬±wv{p°„²©°„Š¨ ±¨
因此 o在基因工程改造林木木质素方面 o应从两方面入手 }一方面是调节控制阔叶树种木质素单体的比
例 oƒx‹k阿魏酸 x p脱氢酶l在 ŠΠ≥单体比例中起着重要的作用 o缺乏 ƒx‹的 φαη1 突变体只累积 Š −木质素
(‹∏°³«µ¨¼¶ ετ αλ. , 2002 ;薛永常等 , 2003) ;在降低木质素含量或不改变其含量的同时 ,通过增加 ƒ 5‹ 的表
达 ,使木质素 Š单体更多地向 ≥单体转化 ,有利于在造纸中木质素的去除 ∀另一方面从整体上降低木质素
含量 ,如对 4≤!≤≤• (肉桂酰 ≤²„还原酶) !≤„⁄(肉桂醇脱氢酶)的降低调节 ,在调低木质素含量的同时 ,增
加纤维素的含量 ,以满足我国造纸工业的需要 ∀
随着木质素合成途径的进一步修正和完善(‹∏°³«µ¨¼¶ ετ αλ. , 2002 ;薛永常等 , 2003) ,对木质素合成酶调
节有了进一步的认识 ,木质素生物合成酶基因调节是许多酶相互作用共同调节的结果 ∀这对于今后目的基
因的选定 !载体的构建有重要的指导意义 ∀
参 考 文 献
陈 颖 ,韩一凡 ,田颖川等 .苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因转化美洲黑杨的研究 .林业科学 , 1995 , 31(2) : 97 − 103
李太元 ,田颖川 ,秦晓峰等 .高效抗虫转基因烟草的研究 .中国科学(…辑) , 1994 , 24(3) : 276 − 282
薛永常 ,李金花 ,卢孟柱等 . 木质素单体生物合成途径及其修订 .林业科学 , 2003 , 39(6) : 146 − 153
„·¤±¤¶¶²√¤• , ƒ¤√ ·¨‘, ¤µ·½ ƒ ετ αλ. „¯ ·¨µ¨§ ¬¯ª±¬± ¦²°³²¶¬·¬²± ¬± ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦² ¬¨³µ¨¶¶¬²± ’2° ·¨«¼¯·µ¤±¶©¨µ¤¶¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶¬± ¶¨±¶¨ ¤±§ ¤±·¬¶¨±¶¨
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…¤·¨ ‘, ’µµ, ‘¬ • ετ αλ. ±∏¤±·¬·¤·¬√¨µ¨ ¤¯·¬²±¶«¬³ ¥¨·º¨¨ ± ³«¨ ±¼¯ ¤¯¤±¬±¨ ¤°°²±¬¤−¯ ¼¤¶¨ ¯¨ √¨ ¯ ¤±§ ³«¨ ±¼¯ ³µ²³¤±²¬§¤¦¦∏°∏¯¤·¬²± ¬± ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²
¬§¨±·¬©¬¨¶¤µ¤·¨−§¨·¨µ°¬±¬±ª¶·¨³¬± ±¤·∏µ¤¯ ³µ²§∏¦·¶¼±·«¨¶¬¶. °µ²¦‘¤·¯ „¦¤§≥¦¬˜≥„ , 1994 , 91 : 7608 − 7612
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y|t 林 业 科 学 ws卷
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¤ª¨¯ ∞ , ‹∏¥±¨ µ… . ⁄¬¶·µ¬¥∏·¬²± ²©³«¨ ±¼¯ ¤¯¤±¬±¨ ¤°°²±¬¤2¯ ¼¤¶¨ ¤±§¶¼±·«¤¶¨ º¬·«¬±·µ∏±®¶²© Ροβινια πσευδοαχαχια . …²·„¦·¤, 1997 , 110 : 314 − 322
’¶¤®¤¥¨ ≠ , ’«·¶∏¥² ≠ , Ž¤º¤¬≥ ετ αλ. ≥·µ∏¦·∏µ¨ ¤±§·¬¶¶∏¨2¶³¨¦¬©¬¦ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© ª¨ ±¨ ¶©²µ³«¨ ±¼¯ ¤¯¤±¬±¨ ¤°°²±¬¤2¯ ¼¤¶¨ ©µ²° ¤ «¼¥µ¬§ ¤¶³¨ ± , Ποπυλυσ
κιτακαµιενσισ . °¯ ¤±·≥¦¬¨±¦¨ , 1995 , 105(2) : 217 − 226
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°¯ ¤±·²∏µ±¤¯ , 1998 , 13(1) : 71 − 83
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≤¨¯¯ °«¼¶¬²¯ , 1997 , 38(7) : 792 − 803
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