全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (1) : 66～ 70
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
促进紫杉醇合成真菌诱导物制备方法的选择及组分的分离Ξ
兰文智　余龙江ΞΞ　李　为　蔡洪喜
(华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉　430074)
关键词: 红豆杉细胞; 真菌诱导子; 诱导子制备; 紫杉醇; 苯丙氨酸解氨酶 (PAL )
中图分类号: Q 944. 6　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0120066205
Selecting Prepara tion M ethods and Isola ting Com ponen ts of
Funga l El ic itor to Enhance Taxol B iosyn thes is
LAN W en2Zh i, YU L ong2J iang3 3 , L IW ei, CA I Hong2X i
(Colleg e of L if e S cience and T echnology , H uaz hong U n iversity of S cience and T echnology , W uhan　430074, Ch ina)
Abstract: Fou r m ethods w ere u sed to p repare fou r crude elicito rs con ta in ing differen t ingredien ts
from m ycelia of fungu s F 5: ( a ) Po lysaccharides A con ta in ing lip ids and p ro tein s; ( b )
M icromo lecu lar po lysaccharides B w ithou t lip ids and p ro tein s; ( c ) M acromo lecu lar
po lysaccharides F w ithou t lip ids and p ro tein s; (d) Po lysaccharides H con ta in ing p ro tein s bu t no
lip ids. T he crude p repara t ion B had the h ighest ab ility to induce taxo l b io syn thesis among o ther
p repara t ion s did. T he crude p repara t ion B w as th rough Sephadex G15 co lum n to separa te tw o
compo sit ion s: B É w ho se mo lecu lar w eigh t w as over 1 500 D and B Ê w ho se mo lecu lar w eigh t
betw een 700～ 1 500 D. T he B Ê act ivity to induce taxo l b io syn thesis w as 2. 3 t im es h igher than
that of the crude p repara t ion B , w h ile B É hadn’t the act ivity to induce taxo l b io syn thesis. By
analysis of PAL act ivity induced by elicito rs, w e conclude that the changes of PAL act ivity cou ld
be regarded as a u sefu l physio logica l ind ica to r to select the effect ive elicito r.
Key words: T ax us cells; Fungal elicito r; E licito r p repara t ion; T axo l; Phenyla lan ine ammon ia2
lyase (PAL )
　　红豆杉细胞培养被认为是一种解决紫杉醇药源
短缺的潜在有效方法之一[1 ] , 但普遍存在着红豆杉
属植物离体细胞的紫杉醇产量比较低的问题。诱导
子是一种可引起植物细胞过敏反应的特定生化信
号, 能快速、高度专一地诱导植物特定基因的表达,
因此, 利用诱导子刺激以提高红豆杉细胞中紫杉醇
产量是目前国内外研究热点[2 4 ]。但这些研究主要
集中有效诱导子的筛选, 而关于诱导子的制备方法
对诱导紫杉醇生物合成的活性研究则甚少。为了提
高诱导子的诱导活性, 笔者以从中国红豆杉树皮中
筛选出证明有效诱导紫杉醇的真菌 F 5 为菌种[2 ] , 研
究不同制备方法所得到的真菌诱导物对紫杉醇生物
合成的影响。
1　材料与方法
1. 1　植物材料和菌种
红豆杉细胞株为本实验室继代培养 3 年的中国
红 豆 杉 ( T ax us ch inensis ) 胚 性 细 胞 株。 真 菌
A sp erg illus n ig er 由本实验室从红豆杉树皮中分离ΞΞΞ 作者简介: 兰文智 (1973- ) , 男, 博士研究生, 主要从事植物次生代谢途径的分子生物学研究。通讯作者。收稿日期: 2001204227, 修回日期: 2001209221。基金项目: 2000 年高等学校骨干青年教师基金。
纯化而得到[2 ]。在以土豆为主要基质的培养基中培
养, 7 d 后收获菌丝体。
1. 2　几种真菌诱导子粗提物的制备方法[5, 6 ]
(1) 制备方法 1 (酸解法) : 称取 40 g 湿菌体, 匀
浆后, 加入 100 mL 蒸馏水, 用 1 mo löL 的盐酸调
pH 为 2, 高压灭菌 1 h, 减压抽滤, 取滤液, 用蒸馏水
定容至 100 mL , 调 pH 为 518, 得到提取液A , 冷冻
保存。
(2) 制备方法 2 (脱脂脱蛋白酸解法) : 称取
100 g湿菌体, 60～ 80℃下烘干, 研磨破碎, 按 1÷ 3
(w öv)的比例加入 80 % 乙醇 (300 mL ) , 在室温下浸
泡过夜。减压抽滤, 分别收集滤液和滤渣。滤渣按1÷3
(w öv) 加入氯仿和戊醇的混合液 (氯仿÷戊醇= 4÷1,
vöv) , 60℃下回流 6 h, 减压抽滤, 收集滤液。合并乙
醇和混合液的滤液 (含脂质和蛋白) , 标为L P。滤渣
用丙酮和水冲洗, 自然风干, 干物质按 1÷ 6 (w öv) 加
入 1 mo löL 的盐酸, 高压酸解 2 h。水解物过滤, 取滤
液, 用N aOH 中和至pH 为 518。在 4℃下静置一夜,
倾出上清液, 用超滤膜过滤, 取滤液浓缩, 得提取液
B。苯酚2硫酸法测总糖含量, 冷冻保存。
(3) 制备方法 3 (有机溶剂脱脂脱蛋白法) : 称取
100 g湿菌体, 60～ 80℃下烘干, 研磨破碎后, 加入
100 mL 乙酸乙酯浸泡过夜, 以除去表面脂质, 减压
抽滤。滤渣用丙酮、水洗净晾干。然后室温浸泡于
200 mL 019% N aC l 水溶液中, 并用磁力搅拌机搅
拌24 h, 过滤, 得残渣S。滤液离心分离 (4 000 röm in)
后, 浓缩至 25 mL , Sevage 方法[7 ] (氯仿÷戊醇= 4÷1,
混和振荡萃取)除蛋白质 5 次以上, 直至紫外光谱检
测无蛋白质 (280 nm ) 和核酸 (260 nm ) 等杂质峰为
止。浓缩至小体积, 3 倍乙醇沉淀多糖 (加入 3 倍体
积分数为 95% 的乙醇, 置冰箱中醇析 24 h, 离心) ,
沉淀溶于适量水, 得到提取液C, 测总糖含量。
上述残渣 S 加入 100 mL 85% 乙醇, 室温搅拌
24 h, 重复提取 3 次。分离残渣 T , 合并提取液, 离心
分离 (4 000 röm in) 后, 3 倍乙醇沉淀多糖, 离心, 沉
淀溶于适量水, Sevage 方法去蛋白质, 再次浓缩, 得
提取液D , 测总糖含量。
上述残渣 T 加入 500 mL 水, 于 100℃煮 2 h,
重复 3 次, 合并提取液, 浓缩, Sevage 法去蛋白, 加 3
倍乙醇沉淀多糖, 离心, 沉淀溶于适量水, 得提取液
E, 测总糖含量。
合并提取液C、D、E, 得提取液 F。合并 Sevage
方法得到的蛋白质, 标为 P。
( 4) 制备方法 4 (脱脂酸解法) : 称取 40 g 湿菌
体, 在研钵中匀浆, 加入 120 mL 乙酸乙酯, 室温搅
拌 24 h。减压抽滤, 得到乙酸乙酯抽提液及残渣。抽
提液 60℃水浴下减压蒸馏, 去掉乙酸乙酯, 得到油
脂, 加适量 012 mo löL N aOH 溶液, 沸水浴条件下反
应约 015 h, 使其充分皂化, 高速离心机离心, 上层
即为脂质, 标为 G。
残渣加入 100 mL 蒸馏水, 用 1 mo löL 的盐酸
调 pH 为 2, 高压灭菌 1 h, 减压抽滤, 取滤液, 去沉
淀, 得提取液H , 测总糖含量。
1. 3　粗提物B 的分离
实验采用凝胶过滤层析法[8 ]进行诱导物的纯
化。Sephadex G15 凝胶柱层析: Sephadex G15 柱
(110 cm ×35 cm )用蒸馏水平衡后, 沿柱内壁滴加诱
导物B 粗提物, 用蒸馏水洗脱, 流速控制在 0125～
0135 mL öm in, 部分收集器收集。酚2硫酸法检测糖,
绘制洗脱曲线。分别合并洗脱曲线中各峰对应的部
分。
1. 4　分离组分纯度鉴定
按文献[ 9 ], 用硅胶H 薄层板进行鉴定。
1. 5　诱导活性实验
红豆杉细胞采用悬浮培养, 基本培养基为改良
B 5 培养基附加NAA 015 m göL , 62BA 015 m göL ,
谷氨酰胺 50 m göL , 蔗糖 40 göL , pH 518。每500 mL
三角瓶装200 mL 培养基, 接种量为150 g 鲜细胞öL ,
摇床转速为 120 röm in。在细胞培养的第13 d, 分别加
入含糖量为 015 m gömL 的粗提物A , B , F , H , 含蛋
白为 50 m göL 的L P 和 P, 含脂质为5 m göL 的 G, 各
种浓度的分离组分。对照组不加诱导物。诱导物添加
后立即取样开始测 PAL 酶活, 且每隔 12 h 取样测定
PAL 酶活, 直至诱导物添加后的第 72 h。第 20 d 取
样测定紫杉醇产量。
1. 6　苯丙氨酸解氨酶 (PAL )的测定
酶液的提取及酶活测定参照薛应龙等的方
法[10 ]。
1. 7　红豆杉细胞生物量和紫杉醇含量的测定
诱导子加入 50 h 后, 收获细胞。以布氏漏斗抽
滤并用蒸馏水淋洗。所得鲜细胞置于真空干燥器
45℃烘至恒重后, 称细胞干重。细胞中紫杉醇的提取
和含量测定按文献[ 2 ]方法。
2　结果与分析
2. 1　几种多糖提取率的比较
从表 1 可以看出。4 种不同制备方法对糖提取
率是不相同的。方法 1 没有经过有机提取而直接高
76　第 1 期　　　　　　　　兰文智等: 促进紫杉醇合成真菌诱导物制备方法的选择及组分的分离
压酸解, 其提取率最高。方法 4 仅经过一次乙酸乙酯
提取去掉油脂, 再高压酸解, 然后乙醇提取多糖, 其
提取率较高。方法 2 经过两次有机溶剂提取除油脂
和蛋白后酸解, 其提取率有所下降。方法 3 经过多次
除油脂除蛋白和多糖提取, 其提取率大大降低。这可
能是由于用有机溶剂除油脂和蛋白成分的同时, 糖
溶解在有机溶剂中所造成的。
表 1　4 种多糖制备方法的比较
T able 1　Comparison w ith four p reparat ion m ethods fo r po lysaccharide
项目
Item
方法 1
M ethod 1
粗提物A
C rude A
方法 2
M ethod 2
粗提物B
C rude B
方法 3
M ethod 3
粗提物C
C rude C
粗提物D
C rude D
粗提物 E
C rude E
粗提物 F
C rude F
方法 4
M ethod 4
粗提物H
C rude H
糖浓度 (m gömL )
Sucro se con ten t 21. 6 18. 8 16. 4 0. 68 21. 6 13 29. 7
提取率 (gög)
Extraction rate 5. 4 1. 32 0. 16 0. 007 0. 22 0. 39 2. 97
2. 2　4 种方法制备的诱导物对紫杉醇的诱导作用
由图 1 可以看出, 4 种制备方法所得到的提取
物诱导红豆杉悬浮细胞中的紫杉醇产量的作用是各
不相同的。与其它 3 种方法相比, 方法 2 制备的诱导
物B 可以最大程度地促进紫杉醇的合成。诱导物B
诱导紫杉醇的生物量是 F 诱导的 2. 5 倍。诱导物B
的成分与 F 的相比, 不同点在于前者经过高压酸
解, 其粗提物中多糖分子量较由有机溶剂提取的后
注: Con 为对照组; A 为酸解法制备的含脂含蛋白的多糖;
B 为脱脂脱蛋白酸解法制备的小分子多糖; F 为脱脂脱蛋
白但不酸解而制备的大分子多糖; H 为脱脂酸解法制备
的含蛋白多糖; L P 为脂质和蛋白; P 为蛋白; G 为脂质
Sym bo l: Con , the con tro l; A , Po lysaccharides A
contain ing lip ids and p ro teins; B , M icromo lecu lar
po lysaccharides w ithou t lip ids and p ro teins; F ,
M acromo lecu lar po lysaccharides w ithou t lip ids and
p ro teins; H , Po lysaccharides con tain ing p ro teins bu t no
lip ids; L P, lip id and p ro tein; P, p ro tein; G, lip id
图 1　诱导物对紫杉醇和生物量的影响
F ig11　T he effect of elicito rs on taxo l and b iom ass
者的分子量低。诱导物B 诱导合成的紫杉醇产量分
别为诱导物H 和A 的 1. 3 和 1. 6 倍。诱导物B 与H
相比, 不含有蛋白成分, 与A 相比, 不含有脂质和蛋
白成分, 说明蛋白和脂质对多糖诱导紫杉醇活性具
有抑制作用。图 1 同时显示出: 蛋白+ 脂质 (L P) 和
蛋白 (P ) 不具有诱导子活性, 脂质具有一定程度的
诱导子活性, 但其活性比多糖成分的低。因此, 诱导
物的有效成分主要是多糖成分。
2. 3　粗提物 B 的分离
D ixon 认为粗提物诱导子中即含有诱导子活性
成分, 也含有诱导子抑制物和无活性物质[11 ]。因此,
我们对高活性的粗提物B 进一步分离诱导子组分,
以提高实验重复性和诱导子诱导紫杉醇生物合成的
活性。取粗提物B 上 Sephadex G15 层析柱, 分为 2
个洗脱峰, 第一部分B É 出现在外水体积内, 第二部
分B Ê 出现在内水体积内 (图 2) , 因此, B É 的分子
量大于 1 500 D ,B Ê 的分子量小于 1 500 D。
图 2　粗提物 B 在 Sephadex G15 柱层析洗脱曲线
F ig12　E lu tion curve of crude p reparat ion B
from Sephadex G15
将B É 和B Ê 经硅胶H 薄板层析, 展层剂为乙酸乙
酯÷甲醇÷乙酸∶水= 12÷ 3÷ 3÷ 2 (体积比) 以显色剂
(苯胺2二苯胺2磷酸试剂) 染色, 均为单一条带 (图
3) , 说明B É 和B Ê 均为均一性组分。
86 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　　
图 3　粗提物 B 的硅胶 H 薄层板层析
F ig13　Gel H TL C Spectra of crude p reparat ion B
　
2. 4　分离组分对紫杉醇合成的影响
图 4 显示, 两种不同分子量的分离组分B É 和
B Ê 诱导紫杉醇生物合成的活性是不相同的。与粗
提物B 相比 (图 1) , 组分B É 不具有诱导子活性, 而
且高浓度时抑制紫杉醇的合成。组分 B Ê 在
015 m göL 的浓度下显著地促进紫杉醇合成, 其诱导
活性是粗提物B 的 213 倍, 说明粗提物B 的有效诱
导活性成分是B Ê。
图 4　不同浓度的分离组分BÉ 和 BÊ 对紫杉醇合成的影响
F ig14　Effect of differen t concen tra t ions of separato rs
B É and B Ê on taxo l b io syn thesis
2. 5　粗提物B分离组分BÉ、BÊ 对PAL活性的影响
由图 5 可以看出, 与对照组相比, 015 m göL 粗
提物B 和 0. 5 m göL 分离组分B Ê 均激活细胞中的
PAL , 其中B Ê 的诱导活性更强, 其峰值出现在 60 h
左右。红豆杉细胞培养物在加入这 2 种诱导物后的
图 5　诱导物对 PAL 活性影响的动力学
F ig15　D ynam ics of PAL activity induced by elicito rs
2～ 3 d, 细胞在外观上出现不同程度的褐化现象, 这
可能是 PAL 被激活后, 由苯丙烷途径产生了一些酚
类物质, 这些物质进一步氧化的缘故。 015 m göL
B É 则无促进 PAL 活性的作用, 细胞亦无明显的褐
化现象。
3　讨论
酸解法是目前普遍采用的制备诱导子的方
法[2 ] , 我们的结果也证明该方法制备的粗提物具有
一定诱导紫杉醇合成的活性。但该方法制备的诱导
物含有多糖、糖蛋白、蛋白和脂质等多种成分, 这可
能是造成实验重复差的主要原因之一, 从而增大了
诱导子调节次生代谢物的分子水平研究的困难。一
般认为, 提高植物次生代谢物的诱导子的有效诱导
成分为多糖[12 ] , 糖蛋白、蛋白不具有诱导活性且对
诱导子的活性具有抑制作用。与对照组相比,L P 和
P 不具有诱导紫杉醇合成的活性 (图 1)。但是, 并不
是所有的多糖成分的诱导物就具有良好的诱导活
性。例如, 大分子的多糖 F 仅略提高细胞中的紫杉
醇含量, 而脱脂脱蛋白酸解法制备的小分子多糖B
则具有较好的诱导活性。一般认为只有特定结构的
诱导子与植物细胞膜上特定受体蛋白结合, 才能快
速地、选择性地诱导特定基因的表达[11 ]。因此, 为了
充分发挥诱导子的诱导活性, 选择合适的诱导子制
备方法是必要的。
宁文等人认为促进紫草色素合成的米曲霉诱导
子是有一些结构相似的组分所组成的[12 ]。为了进一
步提高粗提物B 诱导活性, 我们利用 Sephadex G15
凝胶柱对B 进行组分分离, 发现粗提物B 由 2 种分
子量大小不同的组分组成 (B É 和B Ê ) (图 2)。组分
B É 和B Ê 具有不同程度的诱导紫杉醇合成活性, 而
且组分B Ê 与粗提物B 相比, 进一步提高细胞中紫
杉醇产量 (图 4)。因此, 组分B É 和B Ê 的不同程度
诱导子活性, 可能是由于它们分子大小和结构的差
异使得它们与受体蛋白结合程度不同的缘故。从而
进一步证明只有一定分子量范围内的多糖诱导物才
具有良好的诱导活性。
苯丙烷途径是植物抗病原侵染的重要代谢途
径, 该途径可形成植保素、木质素和酚类等抗病次生
物质, PAL 是苯丙烷途径的第一个酶和关键酶[10 ]。
将 PAL 活性和紫杉醇产量相联系分析, 发现具有诱
导紫杉醇合成活性的粗提物B 和分离B Ê 可提高红
豆杉细胞中 PAL 的活性, 而无诱导活性的分离组分
B É 则不能提高 PAL 活性。因此, PAL 活性变化可
96　第 1 期　　　　　　　　兰文智等: 促进紫杉醇合成真菌诱导物制备方法的选择及组分的分离
作为选择有效诱导子的一个有用生理指标。
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07 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷