全 文 ：! 第 " 卷第 # 期
#$$% 年 % 月
生 物 加 工 过 程
&’()*+* ,-./)01 -2 3(-4/-5*++ 6)7()**/()7
809 #$$%
· :%! ·
产 !;聚赖氨酸菌株生物合成条件研究
朱宏阳:，陈玮玮:，徐! 虹:，代书玲#!
（:<南京工业大学! 制药与生命科学学院，南京 #:$$$=；#<上海农林职业技术学院，上海 #$:>$$）
摘! 要：对一株产 !;聚赖氨酸 !"#$%$#&%’&($ +4? @A>;" 菌株进行生理生化特性研究。并通过 %A 发酵罐中 !;@A 的合
成条件的考察，发现在搅拌转速为 "%$ / B C()，4D E? $，初糖浓度为 "F并补糖的操作条件下 !;@A的质量浓度可高达
>? >% 7 B A，产率提高近 :$ 倍。
关键词：!;聚赖氨酸；北里孢菌属；生物合成；发酵控制
中图分类号：G="=? =! ! ! ! 文献标识码：H! ! ! ! 文章编号：:>I# J ">IK（#$$%）$# J $$:% J $E
!"#$%&’&()%&*$ *’ ) !+,*-.-./&$#+,0*"1(&$2 /%0)&$ )$" /%1".
*’ &%/ 3&*/.$%4#%&( (*$"&%&*$/
LDM D-)7;90)7:，&D6N O*(;P*(:，QM D-)7:，RHS T’.;1()7#
（:? &-11*7* -2 A(2* T5(*)5* 0)U @’0/C059，N0)V()7 M)(W*/+(X9 -2 Y*5’)-1-79，N0)V()7 #:$$$=，&’()0；
#< T’0)7’0( Z-50X(-)01 Y*5’)(501 &-11*7* -2 H7/(5.1X./* [ \-/*+X/9，T’0)7’0( #$:>$$，&’()0）
53/%0)(%：T9+X*C0X(501 +X.U9 -) X’* +X/0()，!"#$%$#&%’&($ +4< @A>;"，()51.U()7 C-/4’-1-79，4’9+(-1-7(501 0)U
](-5’*C(501 5’0/05X*/+ P0+ 50//(*U -.X< S)W*+X(70X(-) -) X’* 2*/C*)X0X(-) 5-)U(X(-)+ -2 !;@A P0+ 5-)U.5X*U
P(X’ 0 % A 2*/C*)X*/< M)U*/ X’* -4X(C01 5-)U(X(-)：4D E< $，+X(//()7 +4**U "%$ / B C()，()(X(01 C0++ 5-)5*)X/0;
X(-) -2 71.5-+* 0X "F P(X’ ()X*/C(XX*)X +.441*C*)X，X’* C0++ 5-)X*)X -2 !;@A /*05’*U >< >% 7 B A，0)U X’*
4/-U.5X(W(X9 -2 ";@A P0+ :$;2-1U+ ’(7’*/ X’0) X’0X ]9 X’* +’0^*U 210+^ 5.1X./*<
6#. 7*0"/：!;4-1919+()*；!"#$%$#&%’&($；](-+9)X’*+(+；2*/C*)X0X(-) 5-)X/-11()7
! ! !;聚赖氨酸（!;4-1919+()*，!;@A）是一种由放线
菌大量生产的氨基酸同型聚合物，由人体必需氨基
酸 A;赖氨酸的 !;氨基与另一 A;赖氨酸的 #;羧基形
成的 !;酰胺键连接而成［:］。!;@A 是一种水溶性的
可生物降解的生物高分子，通常由 #% _ "$ 个赖氨酸
单体组成，相对分子量在 " %$$ _ E %$$ 之间。!;@A
具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴
性菌、真菌、一些耐热性芽孢杆菌及病毒等，在中性
和微酸性环境条件有较强的抑菌性。!;@A 热稳定
性好，可用于米饭、面条、糕点等淀粉和快餐食品及
奶油、色拉、罐头、肉制品等［#］。
笔者从土壤中筛选得到一株高产 !;@A 菌株，
!"#$%$#&%’&($ +4? @A>;"。为了考察其生物合成 !;@A
的性能，对其形态特征和生理生化特性进行了研究，
并在 % A发酵罐中对其生物合成进行了研究。
89 材料与方法
:? :! 材! 料
:? :? :! 试菌株
供试放线菌为 !;@A产生菌株 @A>;" 菌株，由本
! 收稿日期：#$$%;$E;$:
基金项目：国家十五攻关项目资助（#$$E3HI:"3$>;#）
作者简介：朱宏阳（:=I=;），男，硕士研究生，主要从事生物高分子微生物学方面的研究。
联系人：徐! 虹，$#%;K"%KI""#，‘.’a )V.X? *U.? 5)万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 % 期
实验室从南京紫金山周边地区土壤中筛选得到并鉴
定为 !"#$%$#&%’&($ &’( )*#+$。
"( "( %! 培养基
"）! 生理特性等研究所用培养基与试剂参照
《放线菌的分类和鉴定》［$］，《链霉菌鉴定手册》［,］，
《-./0.12& 345647 89 :1&;.<4;=> -4>;./=87801》［?］。
%）! 种子培养基（0 @ *）
葡萄糖 $A，（BC,）% :D, "A，B4% C)D, "( ?，EC%
)D, "( ?，30:D,·FC%D A( ?，G5:D,·FC%D A( A$，H.+
:D,·FC%D A( A"，酵母膏 ?。
$）! 发酵培养基（0 @ *）
葡萄糖 ?A，（BC,）% :D, "A，B4% C)D, "( ?，EC%
)D, "( ?，30:D,·FC%D A( ?，G5:D,·FC%D A( A$，H.+
:D,·FC%D A( A"，酵母膏 ?。
"( %! 试验方法
"( %( "! 形态特征
分别于高氏合成一号琼脂、无机盐淀粉琼脂、淀
粉+酵母提取物琼脂、桑塔斯、-.55.;;2&琼脂上 %I J
插片培养 F K 后观察，记录菌丝形态、孢子丝形态、
孢子排列方式、孢子形态及大小等［,，?］。
"( %( %! 生理生化特征
参照《放线菌的分类和鉴定》、《链霉菌鉴定手
册》、《-./0.12& 345647 89 :1&;.<4;=> -4>;./=87801》的
内容与方法［$+?］。
"( %( $! 拮抗性实验
采用管碟法测定［$］。
"( %( ,! 发酵条件
取一环孢子接入种子培养基内（IA <*培养基 @
?AA <*三角瓶），于 %I J旋转摇床 %AA / @ <=5 下培
养 %, L。将 $AA <* 种子培养液接入到装有 %( F *
发酵培养基的自控式发酵罐（EH+? *，E8 -=8 M.>L
N8( *MO，E8/.45）中，搅拌转速 %AA P ,AA / @ <=5，通风
量 % * @ <=5，%I J发酵 F% L。
"( %( ?! 分析方法
"）! 生物量测定
干重法。
%）! 残糖测定
:-Q+,AN生物传感分析仪测定。
$）! !+)*的测定
参照 R;SL4T=方法［#］。
!" 结" 果
%( "! 菌株的生理性能
%( "( "! 形态特征
插片培养 "A K 后，观察菌株基内菌丝、气生菌
丝和孢子丝的形态特征（结果见表 "），发现 !(
&’( )*#+$ 菌株在高氏合成一号琼脂上生长中度，气
生菌丝生长中度，孢子丝呈波曲状或松螺旋，在电子
显微镜下孢子为长椭圆形或椭圆形，大小差别较大。
基内菌丝和孢子丝的光学显微镜形态见图 "。菌丝
在扫描电镜下的形态见图 %。
表 "! 菌株的形态特征
M4U7. "! ML. <8/’L87801 89 !( &’( )*#+$ &;/4=5
菌株 气生菌丝 基内菌丝 孢子丝
)*#+$ 生长丰富
无横隔，不断裂，
不生孢，无孢囊
直或柔曲或成螺旋状，
孢子 $ P %A 个不等
Q为 !( &’( )*#+$ 菌株基内菌丝，-为 !( &’( )*#+$ 菌株孢子
丝形态
图 "! !( &’( )*#+$ 菌株基内菌丝和孢子丝在光学显微镜下
的形态
H=0( "! ML. <8/’L87801 89 &;/4=5 )*#+$ 65K./ 8’;=> <=>/8&>8’.
图 %! )*#+$ 菌株基内菌丝在扫描电镜下的形态
H=0( %! 38/’L87801 89 &;/4=5 )*#+$
%( "( %! 生理生化特征
部分生理生化特征见表%，拮抗性实验结果见表$。
万方数据
! "##$ 年 $ 月 朱宏阳等：产 !%聚赖氨酸菌株生物合成条件研究 · &’! ·
表 "! ()*%+ 菌株的生理生化特性
,-./0 "! ,10 213456/6758-/ 81-9-8:0954:584 6; 4:9-5< ()*%+
特征 ()*%+ 特征 ()*%+ 特征 ()*%+
明胶水解酶 = >? @-A/ % 葡萄糖 =
牛奶凝固 % &#? @-A/ % 木糖 =
牛奶胨化 = (1"B # = 阿拉伯糖 =
淀粉水解酶 = 2C+B # = 半乳糖 =
纤维素分解 = % 2CDB # = 棉籽糖 =
C"E产生 % 2C$B # = 甘油 =
几丁质酶 % 2C*B # = 蔗糖 =
#? @-A/ = F % 2C’B # = 甘露糖 %
&? @-A/ = 2CGB # = 果糖 =
+? @-A/ = 2C>B # % 肌醇 %
$? @-A/ = F % 2C&#B # % 麦芽糖 =
’? @-A/ %
注：=表生长，%表不生长，= F %表生长可疑。
"B "! !%()生物合成条件的研究
"B "B &! 搅拌转速对 !"#$%$#&%’&($ 42B ()*%+ 产 !%()
的影响
在 $ ) 发酵罐中进行 !%() 生物合成条件实验
考察，首先考察了搅拌转速 "## H D## 9 F I5< 的变化
对 ()*%+ 菌株产 !%()的影响，结果如图 +。
表 +! ()*%+ 菌株的拮抗性实验结果
,-./0 +! ,10 -<:-76<54I 6; ()*%+ 4:9-5<
供试菌株 ()*%+
枯草芽孢杆菌 = =
大肠杆菌 =
粪产碱菌 = =
注：= =表抑制良好；=表抑制；%表不抑制
从图 + 中可以看出，随着搅拌转速的提高，菌体
生长程度也随着提高，生物量从 "B G+ 7 F )（"## 9 F
I5<）提高到 DB ’D 7 F )（+$# 9 F I5<），!%() 产量也从
#B +># 7 F )（"## 9 F I5<）提高到 #B **& 7 F )（+$# 9 F
I5<），说明提高搅拌转速能够提高溶氧传质，有利
于菌体生长。同时从表 D 中可知，虽然在 D## 9 F I5<
下菌体得率最高为 #B &>& 7 80// F 7 4J.，但其 !%()的
产物得率仅为#B # ""’ 7 !%() F 7 4J.。搅拌转速为
+$# 9 F I5<时 !%()的得率最高，得率为 #B #"$ G 7 !%
() F 7 4J.，因此以后研究选择 +$# 9 F I5< 为搅拌转
速。
—"—2C；—#—生物量；—$—残糖；—%—!%()
K："## 9 F I5<；L：+## 9 F I5<；A：+$# 9 F I5<；M：D## 9 F I5<
图 +! 搅拌转速对 !"#$%$#&%’&($ 42B ()*%+ 发酵的影响
N57B +! ,10 0;;08:4 6; 4:59909 4200O 6< :10 !"#$%$#&%’&($ 42B ()*%+ ;09I0<:-:56<
万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 % 期
表 &! 不同搅拌转速下 !"#$%$#&%’&($’() *+,-$发酵动力学参数
./012 & ! .32 4256278/89:7 ;97289< (/5/62825’ =7>25 >94425278
’895597? ’(22>
转速 @
（ 5 @ 697）
) @
（? @ +）
* @
（? @ +）
+ @
（? @ +）
,A@ B @
（? <211 @ ? ’=0）
,* @ B @
（? !-*+ @ ? ’=0）
%CC %) #$ C) $DC %C) " C) "&, C) C"D &
$CC &) $% C) EE, %&) C C) "#C C) C%$ %
$EC &) F& C) ,," %E) , C) "#E C) C%E #
&CC &) $C C) E"C %%) E C) "D" C) C%% F
注：)为菌体质量浓度，* 为产物质量浓度，+ 为底物消耗质
量浓度，,A@ B为菌体得率，,* @ B为产物得率。
%) %) %! (G 值对 !"#$%$#&%’&($ ’() *+,-$ 产 !-*+ 的
影响
文献报道［F］，产 !-*+菌体细胞膜结构中并存着
!-聚赖氨酸合成酶和 !-聚赖氨酸降解酶。并且有人
通过实验证明，在发酵体系 (G值为 E) C H F) C 时，!-
*+不会累积，其中原因是 !-聚赖氨酸降解酶活力远
远高于 !-聚赖氨酸合成酶的活力，合成的 !-*+很快
被降解为赖氨酸；而当发酵体系为 (G&) C H &) % 时，
!-聚赖氨酸降解酶活力急剧下降，但对 !-聚赖氨酸
合成酶活力的影响却很小，因此在此条件下合成的
!-*+累积在体系中；当发酵体系中的 (G 值降为
$) C 时，!-聚赖氨酸降解酶活力基本接近于零，同时
!-聚赖氨酸合成酶活力也急剧下降，而且此条件下
菌体生长不良，因此 !-*+产物产率也很低。借鉴文
献报道的经验，作者在实验中采用控制发酵中后期
体系 (G值的策略来提高 !-*+产率。
由图 & 可知，(G值控制在 (G &) C 时，发酵中前
期菌体增长迅速，到了 &C 3时菌体增长趋势稍有下
降，过度到平稳增长阶段，到发酵终了时，菌体浓度
达到了 E) DF ? @ +（干重）。而产物在发酵中后期有
很大的累积，!-*+ 产率达到了 C) D, ? @ +，比没有调
控发酵中后期 (G值的增长将近 ECI。但从图中可
以看出，葡萄糖的利用率却不高，到发酵终了时，残
糖质量分数依然为 %) $EI。糖的利用率低成了产
物产率提高的最重要的影响因素。为此考虑降低葡
萄糖起始质量分数为 $I，采用中期补料的方式来
调控发酵，每次补糖 "E ?，体积 $C 6+。当葡萄糖质
量分数降至 ") EI左右时，开始补加葡萄糖。
从图 E 中可知，当葡萄糖起始质量分数为 $I
时，菌体生长迅速，并且在补糖后也保持着很好的生
长势头，并且 !-*+ 的合成速率一直保持较高的水
平。到发酵终了时，菌体浓度达到 ,) EC ? @ +（干
重），而产物的产率则达到了 ") ED ? @ +。与葡萄糖
起始质量分数为 EI的相比，葡萄糖总消耗量大致
相同（葡萄糖起始质量分数为 EI时，葡萄糖实际利
用为 %,) E ? @ +；而起始质量分数为 $I补料方式的
葡萄糖实际利用为 %F) E ? @ +），这种低起始质量分
数补糖操作过程菌体质量分数增长 EI，产率却增
长了 ,EI。由此可见，采取低糖补料方式培养有利
于菌体生长和产率的提高。
—"—(G；—#—生物量；—$—残糖；—%—!-*+
图 &! 搅拌速率 $EC 5 @ 697、(G&) C 和葡萄糖起始质量分数
EI时 !-*+发酵曲线
J9?) &! !-*+ 4256278/89:7 <=5K2 =7>25 (G &) C <:785:112>，$EC
5 @ 697 /7> L983 EI 97989/1 ?1=<:’2 <:7<2785/89:7 <:7>9-
89:7’
—"—(G；—#—生物量；—$—残糖；—%—!-*+
图 E! 搅拌速率 $EC 5 @ 697、(G &) C、葡萄糖起始质量分数 $I
及补料时 !-*+发酵曲线
J9?) E! !-*+ 4256278/89:7 <=5K2 =7>25 (G &) C <:785:112>，$EC
5 @ 697，L983 $I 97989/1 ?1=<:’2 <:7<2785/89:7 /7> 422>97?
?1=<:’2 <:7>989:7’
由图 , 可见，综合考虑以上各种因素进行多尺
度调控，还延长了发酵周期，有利于提高 !-*+产率。
由图 ,可知，当发酵条件为 $EC 5 @ 697，葡萄糖起
始质量分数为$I，调控发酵中后期 (G &) C并且补加
葡萄糖时，发酵体系中最终菌体质量分数达到 ,) D&
? @ +，而 !-*+的产率则高达 ,) ,E ? @ +，比最初不
（下转第 &C 页）万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 % 期
蜜 &’，工业蛋白胨 () *++’，,-%./" #) (*’，012/"
#) (*’，032/" #) ### (’，432/" #) ### (’，562/"
#) ##(’。
参考文献：
［(］! 王亚军，姚善泾7 响应面法优化 2899:8;<=>96? 96;6@A?A86 5BC(
培养基［D］7化学反应工程与工艺，%###$，(+（"）：(C*7
［%］! 宫 ! 衡，李小明，伦世仪7 响应面法优化赖氨酸发酵培养基
［D］7生物技术，(++*，*（"）：($C(*7
［$］! 涂国全，于! 静7一株分解羽毛角蛋白的弗氏链霉菌变种的初
步鉴定［D］7江西农业大学学报，(++"，(E（"）：$++C"#$7
［"］! 陈冠群7纳他霉素高产菌株的选育及发酵条件的研究［F］7 天
津：天津科技大学，%##$7
［*］! 胡运权，张宗浩7实验设计方法［0］7 哈尔滨：哈尔滨工业大学
出版社，(++G7
［E］! 惠大丰7统计分析系统 2H2 软件教程［0］7 北京：北京航空航
天大学出版社，
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
(++E7
（上接第 (& 页）
采用调控时，产率提高将近 (# 倍。由此说明，在 !C
.B发酵中通过外部环境的调控可以提高 !C.B 的产
率。
—#—I-；—$—生物量；
—%—残糖；—&—!C.B
图 E! I-调控和补料时 !C.B发酵曲线
5A1) E! JA=6 I;
!" 结" 论
$7 (! 对 !C.B 产生菌株 !"#$%$#&%’&($ ?I) .BEC$ 的形
态特征和生理生化特性进行了系统研究。
$7 %! 当搅拌转速为 $*# ; P =A3、控制 I- ") # 并采用
初糖质量分数为 $’及补糖时可获得最大的 !C.B
产量 E) E* 1 P B，菌体量为 E) +" 1 P B。
参考文献：
［(］! DN3 -，J8Q8KN=A R，2:A3CA9:A S，6O 8L7 T?6
［%］! 2:A=8 2，28Q8A -7 .
!7 Z:6=A98L ?ONMA6?［D］7 H1;A9 [A
［$］! 阎逊初7放线菌的分离与鉴定［0］7北京：科学出版社，(++%7
［"］! 中国科学院微生物研究所放线菌分类组7 链霉菌鉴定手册
［0］7北京：科学出版社，(+G*7
［*］! -
(++"7
［E］! RO_:8QA W57 Z
［G］! 0AO?N8QA ,J，WAQ8 J,，J<>
BCL>?A36CI;