全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
· 17·
丁酸梭菌1，3一丙二醇氧化还原酶基因dhaT
的克隆及在大肠杆菌中的表达
杨登峰1，韦宇拓2，黄日波1’2
(1．广西科学院 工业生物技术中心，南宁530003；
2．广西大学 生命科学与技术学院，南宁530005)
摘要：以丁酸梭茵(Clostridiumbutyricum)基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到l，3一丙二醇氧化还原酶基
因dhaT，将它连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD—dhaT，对此重组质粒进行序列测定，对其DNA序列分析
表明，妣T基因全长为1158bp。将舭T基因插入表达栽体pSE-380中，构建成重组子pSE一讹T，并在大肠杆茵
JMl09中进行诱导表达。研究表明，以l，3一丙二醇为底物时，基因工程茵在37℃下，以1．0mmoVLWTG诱导14
h，酶活力达到16．28U／mL。比原始菌株提高5．6倍。
关键词：克隆；丁酸梭茵；表达；氧化还原酶；l，3一丙二醇
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)01—0017一04
Cloninga dexpressionof1，3-propanedioloxidoreductasegene
fromClostridiumbutyricuminEscherichiacoli
YANGDeng．fen91，WEIYu．tu02，HUANGRi．b01’2
(1．IndustrialBio—technologyResearchCenter，Guan鲥AcademyofS iences，Nanning530003，China；
2．CollegeofLifeScienceandTechnology，GuangxiUnivers ty，Nanning530005，China)
Abstract：The抛Tgen ncodingl，3-propanedioloxidoreductase(DhaT)wasamplifiedromthege—
nomeofClostridiumbutyricumbypolymerasech inr actionandligatedintopMD18--Ttoobtainrecombi·-
nantplasmidpMD—d耽口T．whichweresentosequence．ItwashownfromDNAsequenceanalysisthat
theopenreadingframeof砒口Twas1 158bp．Theg neofa流oTwaginsertedintoexpressionvectorpSE·
380andtherecombinantpl smidpSE—dhaTw sconstructedandhentransformedintoE．coliJMl09．
TheresultsshowedthathenzymaticctivityofDhaTincrudeextractsreached坤t016．28U／mLwhen
using1．3-propanediolassubstrateundertheinducedonditionof1．0mmol／LIPTGat30℃for14
hours．anditw鼬increased5．6foldcomparedwiththatofwildstrain．
Keywords：cloning；Clostridiumbutyricum；expression；oxidoreduetase；1，3-propanediol
19世纪以来，1，3．丙二醇(1，3-PDO)，以其多方
面优越的特性，在化学、酶学、遗传学乃至微生物生
理学中‘1。43成为人们关注的焦点。正因为如此，1，
3-PDO的生产和应用已引起众多世界跨国公司的高
收稿日期：2007-03—14
基金项目：国家863计划课题资助项目(2003AA001039)
作者简介：杨登峰(1979一)，男，江苏无锡人，硕士．研究方向：生物工程及酶工程。
联系人：黄日波，教授，博士生导师，E-mail：pribob@gxu．edu．cn
万方数据
· 18· 生物加工过程 第6卷第1期
度重视。
当前世界上生产l，3-PDO的方法有丙烯醛法、
环氧乙烷法、微生物发酵法、羟甲基法、酸氢化法及
山梨糖醇法等，其中，前2种方法是工业化生产的主
要方法，但他们都需要在高温和贵重金属催化剂作
用下进行，副产物多，致使产品分离纯化较困难，生
产成本相应较高。因此，人们已渐渐把目光转移到
生物法生产上，并进行了大量的研究工作。
生物法生产l，3-PDO，无论是使用天然菌株，还
是经过改造的基因工程菌，都必须由3-羟基丙醛(3-
HPA)转化为1，3-PDO，而1，3一丙二醇氧化还原酶正
是起这个作用的。因此，国外，人们较早就开始了
对该酶的研究，而国内，这方面研究相对较少，本文
对最具工业化前景的丁酸梭菌中的1，3一丙二醇氧
化还原酶基因进行了克隆及表达，为进一步研究1，
3-PDO生产过程中各关键酶的关系及提高1，3-PDO
的产量成为可能。
1材料与方法
1．1质粒和菌株
pMD18．T载体购自大连宝生物技术有限公司；
表达质粒pSE一380购自Invitrogen公司；大肠杆菌
JMl09均为本实验室保存。
1．2培养基
LB培养基(酵母浸膏5g／L，胰蛋白胨10∥L，
NaCl10g／L，pH7．0)，培养基中加入的氨苄青霉素
终质量浓度为100p,g／mL。
1．3酶和化学试剂
eft,DNA聚合酶、T4DNA连接酶、kDNA／Hind
HIDNAmarker、蛋白质相对分子质量Marker购自
FermentasMBI公司；dNTP、DL2000NAMarker和
限制性内切酶均购自大连宝生物公司；IPTG等其他
分子生物学试剂购自上海生物工程技术服务有限
公司。
1．4分子克隆技术
DNA的操作、重组、大肠杆菌的转化、诱导表
达、SDS—PAGE分析按文献[5]进行。dhaT基因的
PCR引物是根据GenBank中查到的Clostridiumbu—
tyricum(AYll2989)的dhaT基因全序列设计的。
SensePrimer：5一AT丛墨垒!鱼垦翻【-I．clrI’MrGlfl隗Gc—
CTATAA-3(下划线部分为BamHI位点)；Antisense
Primerj5-ATACCATGGGAATGTATG爿刀么删G
TAc-3(下划线部分为NcoI位点)。以cbutyri-
cumn总DNA为模板，通过PCR方法扩增出dhaT
基因，将他连接于克隆载体pMD18．T上，用于dhaT
基因序列测定；再将测序正确的dhaT基因用NcoI
和BamHI从质粒pMD．dhaT切出，连接于表达质
粒pSE380的NcoI和BamHI位点处。重组表达质
粒命名为pSE—dhaT，并转化到大肠杆菌EcoliJM
109中进行表达。
1．5序列测定
委托大连宝生物技术有限公司测定。
1．6诱导表达及表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳
分析
以空白质粒转入大肠杆菌作为对照，挑取单菌
落工程菌E．coliJM109／pSE—dhaT接种到含Amp
(100p。g／mL)的LB培养液，37℃振荡培养过夜，然
后，按l％接种到新鲜的LB培养液中，37℃培养至
DD鲫约为0．4～0．6时，加入IPTG使终浓度达1
mmoL／L，诱导表达5～15h(220r／rain30℃)。取
lmL菌液，12000r／min离心1min，菌体用1000
斗L重蒸H：O重新洗涤，再离心收集菌体，加入20
斗L重蒸H：0重悬，并加入等量2×上样Buffer，沸水
浴10min立即进行SDS—PAGE凝胶电泳分析。以
10％的凝胶作分离胶，电泳后用考马斯亮蓝R250
染色。
1．7 重组大肠杆菌细胞的破碎处理和抛T酶活测定
按文献[6]进行，以l，3一丙二醇为底物进行酶
活测定。酶活力定义为：pH为7．7时，在25℃条
件下，每分钟催化形成1p。molNADPH所需的酶量
为一个酶活单位(u)。
2结果和分析
2．1 dhaT基因的PCR扩增结果
以C．butyricum基因组DNA为模板，经PCR扩
增得到特异性高的单一条带，大小约1．2kb的DNA
片段，PCR产物在O．8％琼脂糖凝胶上电泳检测扩
增片断，与预期的结果一致(图1)。
2．2重组质粒pMD—dhaT和表达质粒pSE．砒oT的
酶切分析
从重组菌株E．coliJMl09／pMD-dhaT中提取重
组质粒pMD18·T-dhaT，经NcoI和BamHI双酶切
完全后，琼脂糖凝胶电泳分析获得酶切产物为
1．2kb的片段，表明插入片段与PCR扩增产物大小
万方数据
2008年1月杨登峰等：丁酸梭菌1，3一丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆及在大肠杆菌中的表达 ·19·
一致。同样将表达质粒pSE—dhaT用NcoI和BamH
I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析获得双酶切产物
1。2kb和4．4kb片段(图2)。由于表达载体pSE一
380约4．4kb，说明dhaT基因已连接到表达载体
pSE-380上。
Lanel--PCRproduct；LaneMarker—DNAMarkerDL2000
图1 1。3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)PCR扩增产物
Hg．1PCRproductofdhaTgene
IAineMl—DNAMarker入／HindI
lamel—pSE-dhaT／NcoI+BamHI
LaneM2一DNAMarkerDL姗
图2 阳性克隆pSE-dhaT双酶切
Fig．2NcolandBamHIdigestofpositiveclonepSE—dhaT
2．3 dhaT基因DNA序列分析
对重组质粒pMD-dhaT上的dhaT基因进行全
序列测定分析，结果表明，从起始密码子ATG至终
止密码子TAA整个开放阅读框为1158bp，编码386
个氨基酸。Blast结果表明，其序列与GenBank上公
布的17．butyricum(AYl12989)的dhaT基因核苷酸
序列同源性为99％，说明克隆到的是dhaT基因。
2．4 dhaT基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳分析
重组菌株Eco／iJM109／pSE—dhaT，按步骤1．6
进行诱导14h后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果
显示，和对照菌株相比，重组菌株在大约4．1×104
处出现明显的蛋白质特征带(图3)，表达条带位置
相对偏小，主要是由于表达蛋白中小相对分子质量
氨基酸较多。蛋白质相对分子质量与其DNA大小
推测结果相一致，与文献[7—8]报道的相符，表明
dhaT基因在trc启动子带动下得到了表达。
Lane1---recombinantstrainof最coliJM109／pSE-dhaT
Lane2--recombinantstrainofEcoliJM1091pSE-380
LaneM～PIoteinMarker 一
图3 表达产物的SDS．PAGE分析
Fi昏3SDS-PAGEanalysisofthexpressionproducts
2．5 dhaT酶活测定
将重组菌EcoliJMlOg／pSEdhaT置于含Amp
(100I．Lg／mL)的LB培养基中进行培养，以终浓度
为1mmoL／L的IPTG诱导表达4～15h(220r／min．
300C)，结果发现，在不含有表达质粒pSE380一dhaT
的对照菌株E coliJMl09中同样检测到微弱的酶
活力，这是由于最coliJMl09是属于E．coliK一12系
列的，而在EcoliK一12基因组中含有YqhD基因，这
是一个氧化还原酶的同工酶，因此，在计算酶活力
时，需使用对照菌株EcoliJMl09／pSE-380。研究
表明，已得到具有1，3一丙二醇氧化还原酶活性的表
达产物，重组菌EcoliJMl09／pSE-d施T的酶活力为
16．28U／mL，比对照菌株C．butyricumn的酶活力提
高5．6倍。可见，Cbutyricum的dhaT基因已经成
功地在大肠杆菌中进行了表达。尽管c．butyricum
万方数据
生物加工过程 第6卷第1期
的d玩r基因在密码子偏好性上并没有进行优化，但
该酶的表达较好，粗酶液较之其他菌中的1，3一丙二
醇氧化还原酶具有相对较高的酶活‘9-10】。其原因：
[3]
一方面可能在于表达元件的不同，另一方面可能在
于各菌种密码子与大肠杆菌密码子偏好性的不同。
3讨论
在微生物代谢甘油生成1，3-PDO的过程中，通
常情况下，发酵法生产1，3-PDO是以甘油作为唯一
碳源和能源，进行厌氧1，3-PDO发酵。其中包括2
步反应，由甘油脱水酶将甘油脱水生成3-HPA，再由
1，3-PDO氧化还原酶将3-HPA还原为1，3-PDO，产
生的1，3-PDO是细胞代谢终产物，可在发酵液中高
度聚集。1，3．丙二醇氧化还原酶基因dhaT编码l，
3一丙二醇氧化还原酶(EC1．1．1．202)，该酶是将3．
HPA催化生成l，3-PDO的酶。因此，对产l，3一PD
的不同微生物中dhaT基因功能的研究较为详尽，
如克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乳酸菌属
(Lactobacillusbrevi )、弗氏柠檬菌(Citrobacterfieun-
dii)、梭菌属的丁酸梭状芽孢杆菌(Clotridiabutyri—
cum)等，这些产1，3-PDO的天然菌株中含有的1。
3一丙二醇氧化还原酶都是以NAD+为辅酶，其相关
基因的克隆和表达也有较多报道【s，11-13]。从另一
个角度，也说明了1，3-PDO氧化还原酶酶在生产1，
3-PDO过程中的重要性。
参考文献：
[1]DeckwerWD．Microbialconversionofglycerolto1，3-propanediol
[J]．FEMSMicrobiologyReviews，1995(16)：143—149．
[2]CameronDC，AltarasNE，HoffmanML，eta1．Metabolice蟛一
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
neeringofpropanediolpathways[J]．BiotechnologyProgress，
1998，14(1)：116—125．
TomyaT．RadicalcatalysisofB12e脚可m∞：structure，mecha-
nism，inactivation，andreactivationofd landglyceroldehydrata-
№[J]．CellularandMolecularLifeSciences，2000，57(1)：
106．127． 、
ZengAP．BieblH．Bulkchemicalsfrombiotechnology：the㈣of
l，3-propanediolproductionandthenewtrends[J]．Advancesin
BiochemicalEngineering／Biotechnology，2002，74：239-259．
奥斯伯FM，金斯顿RE．塞德曼JG，等．精编分子生物学实验
指南[M】．第4版．北京：科学出版社，2005．
SulzenbacherG，AlvarezK。VanDenHeuvelRH，eta1．Crystal
structureotE．colialcoholdehydrogenaseYqhD：Evidenceofa睁
valentlymodifiedNADPcoenzyme[J】．MolBid，2004，342：
489-502．
WangW，SunJB，HartlepM，eta1．Combinedu∞ofproteomic
analysisandenzymeactivityassaysformetabolicpathwayanalysis
ofglycerolfermentationbyKlebsiellapneumoniae[J]．Biotechnolo-
gYandBioengineering，2003，83：525-536．
RaynaudC，SarcabalP，Meynial—SaUesI，ela1．Molecularhar-
acterizationof he1，3-propanediol(1，3-PD)operonofClostridi-
mbutyricum[J]．ProeNatlAcadSci，2003，100：5010-5015．
韦旭钦，韦宇拓，黄日波．大肠杆菌yqhD基因的克隆与表达
[J]．广西农业生物科学，2005(24)：299-303．
迟乃玉，刘长江，刘英吴，等．编码1，3-丙二醇氧化还原酶基因
的克隆和表达[J]．微生物学报，2003，43(6)：717-721．
JohnsonEA，IAnECC．Klebsiellapneumoniae1，3-propanediol：
NAD+oxidoreductase[J]JBa teriol，1987，169：2050-2054．
Veiga·Da—CunhaM。FosterMA．1。3-Propanediol：NAD+oxi—
doreductasesofLactobacillusbrevisandLactobacillusbuchneri[J]．
ApplEnvironMicrobiol，1992，58：2005-2010．
DanielR，BcenigkR，GottschalkG．Purificationofl，3-propane-
dioldehydrogenasefromCitrobacterfieundiiandclo ing，∞quen—
cing，andoverexprossionofthec rrespondinggeneinEscherichia
coli[J]．JBacteriol，1995，177：2151-2156．
万方数据