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万方数据
·6 · 生物加工过程 第4卷第1期
化反应，但是其催化效率比水溶液中的酶低几个数
量级，其中重要的原因之一就是酶一般不溶于有机
溶剂。而化学修饰法则可以通过给酶分子连接各种
不同的基团以增加其疏水性，从而提高酶在有机溶
剂中的溶解度。常用的修饰方法有：(1)两亲型高分
子对酶进行修饰。例如早在1984年rI钛ahas“矧等
人发现活化的PEG用来修饰的过氧化氢酶可以溶
解于苯中，并且具有非常高的活性。之后，过氧化物
酶、脂肪酶、胰凝乳蛋白酶等通过活化的PEG修饰
均获得了较高的有机溶剂溶解度和活性[31’引。但是
PEG修饰的酶活通常有不同程度的损失b1|。(2)非
离子型两亲化合物聚氧乙烯十二烷醚共价修饰剂用
于过氧化氢酶的修饰，修饰酶在氯仿、三氯乙烷和甲
苯中的溶解度可以达到0．3。0．6rIlg，rnl；和未修饰
的酶相比，在三氯乙烷中的活性也提高了200倍之
多b引。(3)酰氯对酶进行修饰。Distel等人用癸酰
氯对碱性蛋白酶Pmleather进行修饰，使其在氯仿中
的溶解度高达44mg／r11L；修饰酶用于在不同有机溶
剂中催化聚乳酸的合成，活性提高了4～22倍阻]。
(4)其它新型修饰剂，如几丁质接枝的聚2一甲基一2一
唑啉修饰过氧化氢酶，修饰酶在氯仿中的分散性和
溶解度均被显著改善∞J。
wangP．和其合作者注意到对酶化学修饰引入疏
水性基团也可以使酶具有特殊的界面自组装功能，可
以大幅提高油．水两相催化反应体系的效率睇’37]。他
们通过采用活化的聚苯乙烯对天然水溶性酶如|3．半
乳糖苷酶进行修饰，形成的偶合物具有类似于表面活
性剂的性质可以在油水界面进行自组装而形成液膜。
这种界面自组装酶用于催化己基半乳糖苷的合成反
应，比传统的两相反应效率提高了145倍㈨J。这类界
面自组装酶可以用于一系列的涉及亲水和疏水化合
物之间的生物催化反应，比如利用双氧水的氧化反应
生产环氧化合物旧J。最近，D埘ick和其合作者也采
用不同的方法以获得界面自组装酶，例如在表面活性
剂的存在下，吸附在单壁碳纳米管上的大豆过氧化物
酶可以在油一水界面进行自组装，使酶催化的反应速
率提高了3个数量级旧J。
3化学修饰酶调控酶的选择性／特异性
3．1化学修饰改变酶的对应体选择性
酶的化学修饰有时对酶催化反应的对应体选择
性有较大影响。这方面的研究大多针对脂肪酶在有
机溶剂中的酶催化反应。研究结果表明多种不同的
修饰剂对醌蒯池删脂肪酶进行修饰，都显著
地提高了其在有机溶剂中的对应体选择性[6’蚰’41I。
例如用四硝基甲烷对如以池础邵。脂肪酶的酪氨
酸进行修饰，修饰酶对(±)。2．(2，4一二氯苯氧基)．丙
酸甲酯进行水解，对应体比例E值同未修饰酶相
比，由1．5提高到了33№J。聚苯乙烯修饰对氯过氧
化物酶的选择性也显示了值得注意的影响b8|。
3．2化学修饰减小酶对底物的特异性
对于一些用于合成反应的酶，酶过高的底物特
异性时常成为限制其广泛应用的障碍。定点突变化
学修饰技术最近被用于解决这个问题，并且已经非
常成功地将丝氨酸枯草杆菌蛋白酶(subtilisinB缸沮
‰毓瑚，SBL)扩展应用于肽的合成。具体的研究
工作是首先利用定点突变技术在sBL的特定位点
引入半胱氨酸，然后用甲基磺酰硫醇对半胱氨酸进
行硫代烷基化，得到一系列的新型化学修饰突变枯
草杆菌蛋白酶，这种酶具有更广泛的底物选择
性㈨’43o。对sBL的同一位点进行糖苷化修饰，同样
也使酶的底物选择范围得以显著提高，甚至可以接
受D．氨基酸作为底物。可能的原因是糖苷化会引
起酶在立体化学上的错配效应144J。
巨丑佣型匝丑。一》一呱H，0
巨丑R燮匝丑R
l-4aR=SH(Thiolsubtilisin)-3aR=SCOCH3
1-4bR=Se02H(Selenosubtili)l一3bR=seH
CurrentOpinionmChcmlcaIBiology
图1枯草杆菌蛋白酶活性位点丝氨酸转化为巯基
或硒基氨基酸的化学路线㈨“3
Fig．1Ch伽icalconversion0fmeactivesites谢ne
hydmxylg【Dupinsubtilisintoat11iol叫selenol
3．3化学修饰使无活性蛋白变为活性蛋白
化学修饰最为创造性的工作是可以通过纯粹有
机化学反应的手段，通过对酶蛋白的活性位点氨基
酸进行原子置换，使之成为一种具有全新催化性能
的催化剂。最早的例子是通过如图1所示的化学步
骤旧舶J，将枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸活性位点变为
半胱氨酸残基，从而得到的巯基枯草杆菌蛋白酶失
去了它最初的氨基水解活性，但是仍然保留了催化
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2006年2月 张松平等：化学修饰——提高酶催化性能的重要工具 ·7·
酯化反应的能力，因此可以被用于肽的合成∽J。
wu和Hilven[刮采用类似的路线，在枯草杆菌
蛋白酶上引入硒基半胱氨酸，从而将氨基水解酶转
变为酰基转移酶。随后他们又发现由于氧化还原活
性硒原子的存在，这种硒基枯草杆菌蛋白酶具有和
谷胱甘肽过氧化物酶类似的活性149J。此后，其它研
究人员又将该路线用于胰蛋白酶的修饰，同样使之
具有了氧化还原活性啪1。
最近，更有医学价值的是Ⅱan等人b11通过将甲
状腺病毒单克隆抗体4c5的丝氨酸转化为硒基半胱
氨酸，得到的Se．4c5具有和脱碘酶类似的效果。
4化学修饰酶引入辅因子
I(aiserb21等人首先证明将辅因子与酶进行共价
结合可以产生新的酶活。近些年来，更具创造性的
工作是开发新的辅酶类似物，并将其引入酶的活性
位点，从而实现酶的辅因子重构，这是解决催化反应
体系中受昂贵的辅因子限制的重要进展。使用固相
合成技术，将核糖核酸酶s的c肽链中的第8残基
苯丙氨酸用一种天然氨基酸——磷酸吡多胺(维生
素B6)取代，经过重构的酶催化反应速率提高了7
倍。53|。H锄achi和shinkai旧坝0开发了一系列的具有
非天然功能基的半合成辅因子，通过辅因子重构技
术，可以将其引入酶活性位点的邻近部位，开发新的
酶活。例如一些半合成辅因子包括疏水性烷基链、
聚阴离子、金属复合物、电子受体／供体、肽、人工受
体、光敏剂等被成功引入血红素类蛋白质。光敏剂
的引入则可以通过改变光照条件来调节酶活。
Davis等[551将Cu芦．菲咯啉复合物通过脂结合蛋白半
胱氨酸残基上的二硫键与蛋白结合。修饰的蛋白催
化肽的水解，与天然蛋白相比，反映速率提高了1．6
×104倍，24h内的转换数为7．6。
5化学修饰酶在医药和生物技术中的应用
迄今已有100多种蛋白质(其中许多是酶)被修
饰后用于临床应用，并显示许多优良特性。如稳定
性提高，体内半衰期延长，免疫原性和毒性降低或消
除，提高渗透性，改善在体内生物分步或代谢行为
等惭J。应用最为广泛的修饰剂是PEG或活化的
PEG。Roberts[571等人详细总结了对PEG进行活化以
及同蛋白质结合的各种化学方法。Kodem等人"o则
综述了PEG或活化的PEG修饰的蛋白在医学上的
应用。其中包括抗癌药物(如天东酰氨酶，白介素
2，抗生素，克隆刺激因子和肿瘤坏死因子，色氨酸
酶，精氨酸酶，精氨酸脱氨酶，苯丙氨酸氨解酶)，治
疗遗传缺陷用酶(如腺甘脱氨酶、胆红素氧化酶、嘌
呤核苷磷酸化酶等)，抗炎症药(如超氧化物歧化酶、
过氧化氢酶)，抗血栓蛋白(如链激酶、水蛭素、脲激
酶、纤溶酶原激活剂等)等多种医学用酶的化学修
饰。经过PEG修饰，酶的免疫反应性可以很容易地
降低至O[3川。
6展望
综述了近年来化学修饰技术在改善酶的生物活
性方面的研究进展。酶的化学修饰法与基因工程技
术相结合，可以实现对现有生物催化剂进行几乎无
限的改造，甚至开发全新的催化剂。同时，酶化学修
饰也存在一定的局限性，例如修饰剂对某一氨基酸
侧链进行化学修饰的特异性通常是相对的，这种非
特异性的多位点修饰产生非均一的混合物。因此为
了更精确的控制生物催化剂的性能，仍然需要开发
更加特异性的修饰方法。另外，更加准确地了解蛋
白质 结构和功能之间的关系对于开发新的修饰剂
和修饰方法也日益重要。
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GrimthsA妻；蠹肇塞忸i萝謇·蠢驴i量Pi{；出霹目萎{；羹善妻垂羔{
}《孽毹g；妻；壬i}-瞑?耋《裴i其他技术
寡核苷酸设计型装配重组技术(AsserIlblvof
desi目nedoli90ncleotides，ADO)，zha等人¨纠为了在两
个不同亲本间得到较高的重组率，设计合成了所有
可能重组的寡核苷酸区域，用不同亲本间相同的部
分作为接头，重新进行组装拼接，筛选得到 的嵌合体
对底物的对映体选择性有较大提高。该技术的特点
是可重组距离较近的突变位点，但成本较高 ，属于合
成型改组。还有一类改组属于体内重组技术 ，如酵
母细胞重组增强组合文库技术(C伽lbinatoriallib珀Jies
enhaJlcedbvrecombinationi veast，cLERY)u6|，该技术
将体外重组和酵母体内重组相结合，最适合不能在
细菌中表达的真核基因重组。
1．3 区域性选择突变
如果某些蛋白质工程的目的是对酶的选择性或
作用区域作较大的改变，那么可能需要在酶的活性
区域做多位点的突变。这种多突变位点的组合很难
通过全基因随机突变的方法来达到，因为包含较少
突变位点的突 变体可能有一些相应性质会发生提
高，而包含大量突变的突变体库中，绝大多数都是无
活性的蛋白。 此外，由于氨基酸的简并性，单核苷酸
的改变并不都能导致氨基酸的替换。对于这个问题
可以通过区域性选择突变来解决，即仅仅对可能影
响所需功能的小部分氨基酸残基进行突变，这种策
略需要以蛋白的结构和生化数据作为选择突变区域
的依据，因为产生的序列会随着突变碱基数量的增
加而相应的成指数增长Ll7|。
Kazlausks等人¨副比较了区域性选择突变和全
基因随机突变在提高一个酯酶对映体选择性上的差
别。他们发现 ，有益突变既可以在活性区域出现，也
可以在远离活性区域的地方出现，但是在活性区域
出现的突变显得更加有效。
已经有很多酶采用区域性选择突变进行了改
造，例如对青霉素酰化酶活性区域的3个残基进行
突变，有6个突变体的活性得到提高，其中有5个突
变体是3个碱基同时发生了突变[19|。通过分析高
分辨率晶体结构，HiⅡ等人伽。对磷酸丙糖酯酶进行
区域性选择突变，得到的突变体对底物的降解速率
提高了3个数量级。用区域性选择突变得到的优秀
突变体，通常都包含多个突变位点，虽然有时多位点
突变的结果与单位点突变的结果相同，但越来越多
的证据表明，至少有一些性质的提高必须通过多点
突变的组合才能达到，这种协同作用的原因可能是
多位点的改变更容易导致活性区域的结构发生变
化。
2 突变库的高通量筛选
创建基因突变库的方法目前已有很多怛1|，但是
建立起来的突变库的容积普遍比我们有能力筛选的
蛋白数量要高出几个数量级。此外，创建基因突变
库的方法比较通用，但是对于酶活性筛选却必须针
对不同的酶和反应制定不同的筛选方法。定向进化
的最大瓶颈是缺乏通用的高通量的筛选方法，或比
较通用的针对目标活性的选择方法。所以高通量筛
选日益受到人们的重视。
目前，传统的有效筛选方法大多是采用琼脂平
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