全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042606206
桔青霉形态分化与核酸酶 P1 产量突变关系研究
梁新乐1 　寿　谦1 　张　虹1 　陈　敏1 　刘　璇2
(11 浙江工商大学生物工程系 ,浙江 杭州　310035 ; 21 北海市环境科学研究所 ,广西 北海　536000)
摘 　要 :桔青霉 ( Penicillium citrinum) CICC 4011 菌株经60 Coγ射线辐照处理以及多菌株连续多轮原生质体
融合后 ,变异株产核酸酶 P1 能力与形态性状出现了较大差异。研究表明黄绿色或灰绿色菌落产酶水平
较高 ,绿色或艾绿色菌株产酶水平较低。选择不同产色特征的变异株 (J1Y6、F213、F2R233) 与 CICC 4011
进行比较 ,表明 4 株桔青霉生长速度没有明显差异。融合子 F2R233 菌落呈深艾绿色 ,产水溶性红色素 ,
核酸酶 P1 低产 (2311UΠml) ;诱变菌株 J1Y6 菌落呈黄绿色 ,产水溶性黄绿色素 ,核酸酶活较高 (16713UΠ
ml) ;融合子 F213 菌落呈灰绿色 ,不产水溶性色素 ,核酸酶活较高 (57816UΠml) 。电镜观察发现 J1Y6、F213
分生孢子梗上帚状分枝减少 ,菌丝生长粗壮 ,产孢能力不及 4011 及 F2R233。核酸酶 P1 和色素虽然都是
次级代谢产物 ,但核酸酶 P1 的合成明显与生长相关 ,而色素的合成则表现出非相关性。诱变株 RAPD
DNA 多态性检测率为 70 %。UPGMA 聚类分析 ,菌株 F2R233 与出发菌株 4011 聚为一类 (相似系数 019) ,
核酸酶 P1 高产菌株 J1Y6 和 F213 聚为一类 ,高产与低产突变株的 DNA 多态性表现出明显差异 (相似系
数 018) 。
关键词 :桔青霉 ;分化 ;RAPD ;DNA 多态性 ;核酸酶 P1
收稿日期 :2008212222 　接受日期 :2009203217
基金项目 :浙江省科技攻关项目 (2008C21011)
作者简介 :梁新乐 (19692) ,男 ,湖北江陵人 ,教授 ,主要研究方向微生物学。E2mail :dbiot @mail . zjgsu. edu. cn
POTENTIAL RELATIONSHIPS BETWEEN MORPHOLOGICAL DIFFERENTIATION AND
MUTANTS WITH HIGH NUCLEASE P1 PRODUCTION OF Penicillium citrinum
LIANG Xin2le1 　SHOU Qian1 　ZHANG Hong1 　CHEN Min1 　LIU Xuan2
(11 Department of Biotechnology , Zhejiang Gongshang University , Hangzhou , Zhejiang 　310035 ;
21Beihai Institute of Environmental Science , Beihai , Guangxi 　536000)
Abstract :Diversification of colony characteristics of mutants derived from Penicillium citrinum CICC 4011 treated with 60 Coγ2
irradiation and protoplast fusion were analyzed. There were distinct differences among mutants with different nuclease P1
activity , especially in pigment productivity. Color of colony was changed from the original green to white , grey2green , or
yellow2green etc. , while the nuclease P1 activity would be fluctuated with the color change. The hypothesis was suggested that
there would be a relationship between pigments and nuclease P1 production. Mutants with grey2green colony would give out
high nuclease P1 outputs in a high probability such as mutant J1Y6 ( nuclease P1 activity , 16713UΠml) and fusant F213
(nuclease P1 activity , 56817UΠml) , while others with deep2green colony observed low nuclease outputs. Four variation strains
didn’t show any significant difference in growth rate. Broom branches of conidiophore stem in J1Y6 and F213 were obviously
reduced , conidiophores productivity reduced , but hyphae growth haled. These suggested that nuclease P1 production was
associated with growth phase , but pigment synthesis course wasn’t . RAPD from 6 randomly selected primers was used to
analyze the polymorphic rich of the four strains , the results showed that there were 70 percent polymorphism detection rate
among those. UPGMA cluster analysis and genetic map constructed by NTSYS2PC software , which showed that J1Y6 and F214
were clustered as one group at similar coefficient 019 , where there was an appear distance from the group of 4011and F2R233
606　 核 农 学 报　2009 ,23 (4) :606～611Journal of Nuclear Agricultural Sciences
strains (similar coefficient 018) .
Key words : Penicillium citrinum ; differentiation ;RAPD ; DNA polymorphic ;nuclease P1
　　桔青霉 ( Penicillium citrinum) 属于不对称青霉组 ,
桔青霉系 ,常见于腐烂的水果、蔬菜、粮食、肉类、皮革
和食物上 ,是工业、农业生产中的一种主要病害真菌。
桔青霉也是工业生产上的重要菌种 ,如用于核酸酶
P1[1 ] 、醛酮氧合酶[2 ] 、脂肪酶[3 ] 、果糖氧化酶[4 ] 的生产
等。在微生物诱变育种中 ,突变株菌落的直径大小、形
状、孢子数量、所产色素等会呈现不同的特征。Angel
等[5 ]的研究表明菌丝形态分化与抗生素合成存在关联
性 ,万平等[6 ] 发现膨大菌丝转化为节孢子可能更有利
于头孢菌素 C的合成 ,石鹤等[7 ] 发现红曲霉红曲色素
合成与菌丝球大小有关。此类突变除经典形态学比较
外 ,还可通过 RAPD[8～10 ] 手段分析其 DNA 多态性来检
测突变及比较突变株的亲缘远近 ,如王艳娜等[11 ] 利用
RAPD 分析比较了不同来源的 20 株淡紫拟青霉和 4 株
拟青霉菌株种内和种间的遗传差异性。
本试验以 CICC 4011 作为出发菌株进行核酸酶 P1
高产菌种的育种 ,获得了不同形态差异的突变株 ,其产
色性状存在较明显差别。依据核酸酶 P1 产量性能、菌
落颜色从中选择 3 株突变株与原始菌株从形态差异和
DNA多态性等方面进行了较为详细的比较。通过比
较这些差异性 ,试图建立核酸酶 P1 产量突变与产色性
状之间的关联性。
1 　材料与方法
111 　菌种
桔青霉 ( Penicillium citrinum) CICC 4011 ,购自中科
院北京微生物研究所 ,具有核酸酶 P1 低产性状。桔青
霉 J1Y6 ,60 Coγ射线诱变 CICC 4011 所得诱变株 ,具有
核酸酶 P1 较高产性状 (16713UΠml) 。桔青霉 F213 ,以
J1Y6 等为出发菌株进行多轮融合后所得融合子 ,具有
核酸酶 P1 高产性状 (57816UΠml) 。桔青霉 F2R233 ,以
J1Y6 等为出发菌株进行多轮融合后所得融合子 ,具有
核酸酶 P1 低产性状 (2311UΠml) 。菌株谱系如下 :
112 　培养基
培养基包括以下 5 种[11 ] :1) 马铃薯葡萄糖琼脂培
养基 (PDA) :马铃薯 200gΠL ,葡萄糖 20gΠL ,琼脂 20gΠL ,
自然 pH ;2)马铃薯葡萄糖液体培养基 :马铃薯 200gΠL ,
葡萄糖 20gΠL ,自然 pH ;3) 麦芽汁琼脂培养基 (MEA) :
麦芽浸出粉 20gΠL ,葡萄糖 20gΠL ,蛋白胨 1gΠL ,琼脂
20gΠL ,自然 pH ;4)酵母膏蔗糖琼脂培养基 ( YES) :酵母
膏 20gΠL ,蔗糖 150gΠL ,MgSO4 ·7H2O 015gΠL , 琼脂 20gΠ
L ,自然 pH ;5) 察氏酵母膏琼脂培养基 (CYA) : K2 HPO4
1gΠL , NaNO3 3gΠL , MgSO4 ·7H2O 015gΠL , FeSO4 ·7H2O
0101gΠL ,KCl 015gΠL ,蔗糖 30gΠL ,酵母膏 5gΠL ,琼脂 15gΠ
L ,自然 pH。
113 　方法
11311 　菌种活化 　将原始菌种 CICC 4011 转接到活化
培养基平板 ( PDA) ,于 28 ℃恒温培养 ,3d 后用接种环
将孢子转接到另一块平板 ,28 ℃恒温培养 3d 后转接至
试管斜面 (活化培养基) ,28 ℃恒温培养 3d。
11312 　摇瓶培养 　将活化好的菌种接入装有 100ml
发酵培养基 ( PDA) 的 500ml 三角瓶中 ,瓶中放置适量
碎玻璃用于打碎菌丝 ,于 28 ℃280rΠmin 摇床培养 48h
左右 ,以备收集菌丝。
11313 　三点接种培养 　快速将蘸有孢子的接种针尖
垂直地点接至上述 4 种固体培养基表面的标记点处 ,
然后将平皿倒扣 ,于 28 ℃恒温培养 14d ,在第 3、5、7、9
和 14 天观察菌落形态。
11314 　60 Coγ射线诱变 　在浙江大学核农研究所完
成 ,诱变剂量为 300Gy。
11315 　扫描电镜 (SEM) 样品前处理制备方法 　样品
在 215 %的戊二醛溶液中 4 ℃固定过夜 ;倒掉固定液 ,
用 011molΠL、pH710 的磷酸缓冲液漂洗样品 3 次 ,每次
15min ;用 1 %的锇酸溶液固定样品 115h ;倒掉固定液 ,
同上方法漂洗样品 3 次 ;用梯度浓度为 50 %、70 %、
80 %、90 %和 95 %的乙醇溶液对样品进行脱水处理 ,每
种浓度处理 15min ,再用 100 %的乙醇处理 2 次 ,每次
20min ;用乙醇与醋酸异戊酯的混合液 (V∶V = 1∶1) 处
理样品 30min ,再用纯醋酸异戊酯处理样品 115h ;临界
点干燥。干燥后的样品黏附在样品台上 ,在 EikoIB5 型
706　4 期 桔青霉形态分化与核酸酶 P1 产量突变关系研究
离子溅射仪中喷镀 4～5min ,在荷兰 Phikps 公司的
XL30 型 EMES(环境扫描电镜)中观察。
11316 　DNA 提取 　称取菌丝 200mg (鲜重) 在液氮中
研磨成粉 ,放入 115ml EP 管中 ,加入 015ml 溶液 I 悬浮
菌丝粉 (溶液 I : 011M NaCl ,30mmolΠL Tris2HCl pH718 ,
10mmolΠL EDTA pH810 ,10mmolΠL2巯基乙醇) 。12000rΠ
min 离心 1min 得沉淀 ,弃上清 ,重新加入溶液 I 悬浮 ,
12000rΠmin 离心 1 min 弃上清 ;加入 016ml 溶液 Ⅱ悬浮
后 (溶液 Ⅱ: 011molΠL NaCl , 0101molΠL EDTA ,蛋白酶
K) ,加入 012ml 裂解液 ,剧烈振荡 1min ;将悬浮液于
55 ℃水浴 30min ;加入 2μl RNase 于 37 ℃水浴 1h。将悬
浮液分为 2 管 ,每管加入等体积酚Π氯仿Π异戊醇 (25∶24∶
1) ,12000rΠmin离心 5min ,取上清液 ,重复 1 次。取上清
液加入 1Π10 体积 3molΠL NaAc 混匀 ,再加入 2 倍体积
无水乙醇 (冰浴 ) ,室温沉淀 10min ; 12000rΠmin 离心
5min ,弃上清 ;用 70 %乙醇清洗沉淀 ,真空干燥后溶解
于 30μl TE溶液 ,取模板 DNA 5μl 于 1 %琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA 的有无 ,置于 - 20 ℃冰柜长期保存。
11317 　引物筛选 　随机引物购自上海生工生物工程
技术服务有限公司。选择扩增效能优良的随机引物 ,
对受试 4 个菌株的模板 DNA 进行 PCR 扩增和 DNA 指
纹图谱分析。
表 1 　RAPD 反应中所用引物及核苷酸序列
Table 1 　Primers and their nucleotide sequence
used for RAPD reaction
引物编号
primers
引物序列
sequence
引物编号
primers
引物序列
sequence
S18 CCACAGCAGT S197 TGGGGACCAC
S191 AGTCGGGTGG S93 CTCTCCGCCA
S187 TCCGATGCTG S10 CTGCTGGGAC
S167 CAGCGACAAG S31 CAATCGCCGT
S181 CTACTGCGCT S177 GGTGGTGATG
S199 GAGTCAGCAG S155 ACGCACAACC
S17 AGGGAACGAG S43 GTCGCCGTCA
S7 GGTGACGCAG S178 TGCCCAGCCT
S189 TCCTGGTCCC S104 GGAAGTCGCC
S34 TCTGTGCTGG S56 AGGGCGTAAG
S93 CTCTCCGCCA S183 CAGAGGTCCC
S142 GGTGCGGGAA S156 GGTGACTGTG
11318 　RAPD 检测 　PCR 反应所需 Taq DNA 聚合酶、
dNTP 和引物购自上海生工生物工程技术服务有限公
司。PCR 反应体系 (50μl) :10 ×Taq 缓冲液 5μl , MgCl2
(25mmolΠL) 3μl ,dNTP(10mmolΠL , 1μl ,引物各 2μl ,DNA
模板 2μl , Taq DNA 聚合酶 1μl ,无菌水 36μl。每一个
EP 管覆以 20μl 的灭菌石蜡油。反应循环参数为 :94 ℃
预变性 4min ; 94 ℃变性 30s , 34 ℃退火 60s , 72 ℃延伸
2min ,40 个循环 ;最后 72 ℃延伸 5min。PCR 产物在含
有 EB 的 1 %琼脂糖凝胶中电泳。电压为 80V ,时间为
1h。在紫外投射仪下检测并照相。采用 NTSYS2PC 软
件进行聚类分析[8～11 ] 。
2 　结果与分析
211 　突变株及融合子形态分化与核酸酶 P1 产量突变
的关系
在以桔青霉 CICC 4011 为出发菌株对核酸酶 P1
的选育中 ,发现突变株菌落形态尤其是产色性状出现
了多样性变化。
经60 Co 诱变处理后 ,共挑取单菌落 287 株 ,经初筛
和复筛后获得 13 株正突变株 ,核酸酶 P1 酶活力由原
来 14219UΠml 提高到 16713UΠml (菌株 J1Y6) 。考察其
菌落特征与酶产量分布关系 (图 1) ,发现酶活力较高
菌株具有白色、黄绿色菌落特征 ,但是具有这种菌落
图 1 　60 Co 诱变处理后突变株形态特征与
核酸酶 P1 的酶活力分布图示
Fig. 1 　Diagram of relationships between nuclease P1
activities with colony characteristics of
mutants derived from 60 Co mutation treatment
■:对照菌株 ; △:白色菌落 ; ○:黄绿色菌落 ; ý :绿色菌落
■:control origin strain ; △:white colony ;
○:yellow2green colony ; ý :green colony
特征的菌株产酶差异也较大。而菌落呈深黄绿色、绿
色的突变株酶活力相对较低 (42～135UΠml) 。5 株白
色、黄绿色菌株经继续传代试验 ,其中有 3 株形态又出
现形态分化 ,出现了黄绿、艾绿菌落 ,其酶活力也有所
下降。菌落的直径大小与产酶分布无明显关联特征。
　　从60 Co 诱变处理后筛选获得的正突变株中选择
P1 酶活较高的 6 株 (J1Y6 , J1Y17 , J1Y83 , J1Y141 ,
J1Y203 ,J1Y272 , P1 酶活在 15110～16713UΠml) 进行连
续 4 轮原生质体融合 ,并筛选高产融合突变株。从融
806 核　农　学　报 23 卷
合再生平板上共挑取各种单菌落 200 株 ,经酶活力分
析获得正突变 59 株 ,其中 F213 酶活力提高最为明显 ,
达 57816UΠml。高产融合子表现出与60 Co 诱变处理后
类似的菌落特征 (尤其是产色、产孢性能) ,即菌落呈灰
白、灰绿 , 少孢 ; 而低产菌株 (如 F2R233 酶活仅为
2311UΠml)的菌落则为黄绿、艾绿 ,多孢 ;无白色菌落。
灰绿色菌落经连续传代菌落无变化 (图 2) 。
212 　突变株与融合子的形态特征
选取60 Co 诱变所得 P1 酶最高产菌株 J1Y6、原生
质体融合所得 P1 酶最高产菌株 F213、原生质体融合
P1 酶低产且产水溶性红色素的菌株 F2R233 与出发菌
株 CICC 4011 进行了详细比较。4 株桔青霉在 PDA、
MEA、YES、CYA 4 种培养基上生长速度无明显差别。
在 PDA 培养基上 ,CICC 4011 的菌落呈绒状 ,生长快 ,
菌丝体初为白色 ,后呈艾绿色 ,微有皱褶 ,表面有水析
出 ,反面呈淡黄色 ,基质颜色不变。
经60 Co 诱变处理后 ,突变株菌落表现出不同的生
长特征 ,在 PDA 培养基上 ,菌落主要以白色、浅黄绿为
主 ,极少数呈现淡绿、灰绿 ,无原始出发菌株的艾绿色
菌落 ;菌落反面无水溶性色素分泌。如突变株 J1Y6 菌
图 2 　原生质体融合株菌落形态特征与
核酸酶 P1 的酶活力分布图示
Fig. 2 　Diagram of relationship between nuclease P1
activities and colony characteristics of
fusants derived from protoplasma fusion
■:对照菌株 ; △:灰绿色菌落 ; ○:黄绿色菌落 ; ý :绿色菌落
■:Control origin strain ; △:grey2green colony ;
○:yellow2green colony ; ý :green colony
落干燥 ,大而致密 ,不透明 ,与培养基较牢固结合 ,菌落
正面呈白色 ,后边缘和中心呈淡绿色 ,反面呈黄绿色 ,
在 PDA、CYA 上产黄色素 ,在其他两种培养基上产色
不明显 (图 3) 。
图 3 　突变菌株在不同培养基上的菌落形态 (25 ℃培养)
Fig. 3 　Colony characteristics of original strain (A :CICC 4011) , mutants (B :J1Y6) , and fusants (C :F213 ;D :F2R233)
on different media (Cultivated at 25 ℃)
　　融合子菌落以灰白、灰绿、黄绿为主 ;部分菌落产黄
绿色素 ;菌株 F2R233 在四种培养基上都明显产水溶性
红色素 ,其他菌落无色素分泌。融合株 F213 菌落呈绒 状 ,生长快 ,菌丝体初为白色 ,微有皱褶 ,菌落会产生黄色的色素 ,菌落正面灰色 ,有放射状条纹并且有同心圆。从显微镜观察 ,原始菌株 CICC 4011、融合株 F2R2
906　4 期 桔青霉形态分化与核酸酶 P1 产量突变关系研究
33 的菌丝比较浓密、菌丝顶端分生孢子梗有大量的孢
子 ,产孢量大 ,且菌丝颜色较深。相比之下 ,突变株
J1Y6、融合株 F213 菌丝短粗 ,产孢量下降 ,菌丝颜色较
淡 (图 4) 。
图 4 　突变株的扫描电子显微镜图片
Fig. 4 　Diagram of SEM of four mutants
PDA 培养基 ,25 ℃生长 5d 后进行电镜观察
cultivated in PDA at 25 ℃for 5 days
213 　突变株 DNA 多态性分析
对基因组 DNA 进行差异分析时 RAPD 是经常被
采用的方法之一。从 24 条 RAPD 随机引物中筛选出
扩增多态性丰富的 6 条引物 S10、S104、S155、S156、
S197 和 S199 ,对四株桔青霉进行基因组 DNA 遗传变
异分析。单一引物扩增所得片段丰度最大为产生 10
条 RAPD 条带 (图 5) 。多态检测率为 70 %。采用
NTSYS2PC软件进行聚类分析 ,从所得遗传相似聚类图
(图 6)可看出 ,J1Y6 和 F213 聚为一类 ,相似系数在 019
以上 ;F2R233 与 CICC 4011 聚为一类 ,相似系数为 019。
高产菌株与低产菌株之间的相似系数在 018 ,这表明
此二类之间遗传多态性有明显差异。
图 5 　桔青霉 J1Y6、CICC4011、F213 和 F2R233 菌株 RAPD 扩增电泳图谱
Fig. 5 　RAPD patterns of Pennicilium citrinum strains mutants J1Y6 , CICC4011 , F213 and F2R233
泳道 1 :DL2000 (A 2000bp , B 1000bp , C 750bp , D 500bp , E 250bp , F 100bp) ; 2～5 :引物 S199 对 J1Y6、CICC4011、F2R233 和 F213 的扩增结果 ;6～9 :引
物 S197 对 J1Y6、CICC4011、F2R233 和 F213 的扩增结果 ;10～13 :引物 S10 对 J1Y6、CICC4011、F2R233 和 F213 的扩增结果 ;14～17 :引物 S155 对 J1Y6、
CICC4011、F2R233 和 F213 的扩增结果 ;18～21 :引物 S104 对 J1Y6、CICC4011、F2R233 和 F213 的扩增结果 ;22～25 :引物 S156 对 J1Y6、CICC4011、F2R233
和 F213 的扩增结果
Lane 1 :DL2000 (A 2000bp , B 1000bp , C 750bp , D 500bp , E 250bp , F 100bp) ; 2～5 :The application results of Primer S199 from DNA of J1Y6 , CICC4011 , F2
R233 and F213 ; 6～9 :The application results of Primer S197 from DNA of J1Y6 , CICC4011 , F2R233 and F213 ; 10～13 :The application results of Primer S10 from
DNA of J1Y6 , CICC4011 , F2R233 and F213 ; 14～17 : The application results of Primer S155 from DNA of J1Y6 , CICC4011 , F2R233 and F213 ; 18～21 : The
application results of Primer S156 from DNA of J1Y6 , CICC4011 , F2R233 and F213
Annotate 1 :Marker :2000bp , A 2000bp , B 1000bp , C 750bp , D 500bp , E 250bp , F 100bp225 :J1Y6 , CICC4011 , F2R233 , F213 , Primer S199 ; 629 :J1Y6 ,
CICC4011 , F2R233 , F213 , Primer S197 ; 10213 :J1Y6 , CICC4011 , F2R233 , F213 , Primer S10 ; 14217 : J1Y6 , CICC4011 , F2R233 , F213 , Primer S155 ; 18221 :
J1Y6 , CICC4011 , F2R233 , F213 , Primer S104 ; 22225 :J1Y6 , CICC4011 , F2R233 , F213 , Primer S156
016 核　农　学　报 23 卷
图 6 　桔青霉 J1Y6、CICC 4011、F213、F2R233
菌株 RAPD 标记聚类分析树状图
Fig. 6 　Cluster analysis of RAPD from Penicillium
citrinum strains J1Y6 , CICC 4011 , F213 and F2R233
3 　讨论
在微生物的遗传育种中 ,如果能建立或创造微生
物的形态、生理突变与目标产物产量突变的关联性 ,对
于提高筛选的效率具有重要意义。在以桔青霉为出发
菌株选育核酸酶 P1 的育种工作中 ,本实验室发现菌落
形态尤其是产色性状出现了多样性变化 ,从试验结果
推测桔青霉形态变异尤其是产色素的差异性与其核酸
酶 P1 的产量之间存在着关联性 ,虽然这种关联性还有
待试验的进一步证实。绿色或深绿色桔青霉菌落产孢
丰富 ,但核酸酶 P1 产量低 ;而灰白、灰绿等菌落产孢能
力较弱 ,而菌丝生长健壮快速 ,核酸酶 P1 产量较高。
这反映在培养方式中 ,液体培养所得酶活力要高于固
体培养所得酶活力。而在一般的生产过程中 ,产酶水
平高低往往与产孢能力呈正相关 ,如在酱油米曲霉种
曲生产过程 ,其中蛋白酶产量高低与产孢能力呈正相
关 ,而本试验中桔青霉核酸酶 P1 的生产与产孢能力表
现出不一致性 ,因此我们认为桔青霉核酸酶 P1 是一种
生长关联性次级代谢产物 ,在液体培养中菌丝的高生
长速率可能带来高效的产酶。RAPD 聚类分析能从
DNA 多态性方面对变异株的核型做出差异性分析 ,突
出了突变体之间的差异。
　　色素也是桔青霉的次级代谢产物 ,但其合成的启动
明显与核酸酶 P1 的合成不同步 ,与菌体的生长不存在
关联性。本文仅依据试验现象分析提出了初步假设 ,要
确证产色差异性与产酶性状二者间的关联性 ,还需要进
一步从代谢组与蛋白组学方面进行深入研究探讨。
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