全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０５􀆰 ００４
收稿日期：２０１３－１０－３０
基金项目：国家自然科学基金（２１３７６１５５）
作者简介：朱　 健（１９８７—），男，江苏常熟人，硕士研究生，研究方向：工业微生物；卫功元（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗｅｉｇｙ＠ ｓｕｄａ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的
营养条件
朱　 健，胥京京，汪成富，卫功元
（苏州大学 基础医学与生物科学学院，苏州 ２１５１２３）
摘　 要：为了进一步提高产朊假丝酵母全细胞转化生物合成谷胱甘肽（ＧＳＨ）的能力，利用响应面分析方法对酵母
培养的发酵培养基进行优化。 在单因素实验的基础上，通过 Ｐｌａｃｋｅｔｔ⁃Ｂｕｒｍａｎ设计筛选出显著影响 ＧＳＨ转化力的 ２
个主要因素：葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４。 采用最陡爬坡试验和响应面设计预测了葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４的最佳质量浓度分别为
５８􀆰 ５ 和 １７􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。 验证实验结果表明，在该优化培养基条件下，酵母细胞的 ＧＳＨ转化力为 １􀆰 ５４ ｍｇ ／ （ｇ·ｈ），比优化
前提高了 １倍。 该结果为类似的采用全细胞转化法高效合成有用化学品的研究与开发提供了可行的优化思路。
关键词：谷胱甘肽；全细胞转化；产朊假丝酵母；响应面分析
中图分类号：Ｑ９３９􀆰 ９７　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－００２３－０６
Ｍｅｄｉａ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ａｓ ｗｈｏｌｅ⁃ｃｅｌｌ ｃａｔａｌｙｓｔ
ＺＨＵ Ｊｉａｎ，ＸＵ Ｊｉｎｇｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇｆｕ，ＷＥＩ Ｇｏｎｇｙｕａｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｏｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ ２１５１２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＳＺＵ ０７⁃０１ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｗｈｏｌｅ⁃ｃｅｌｌ ｃａｔａｌｙｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
（ＧＳＨ） ｂｙ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｏｎ ＧＳＨ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｄｉａ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ⁃
ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐｌａｃｋｅｔｔ⁃Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ，ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ＫＨ２ ＰＯ４ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ
ｐｒｉｍａｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ＧＳＨ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
５８􀆰 ５ ａｎｄ １７􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ ｆｏｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ＫＨ２ ＰＯ４ ｗｅｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｆｌａｓｋｓ，ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ
ＧＳＨ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ １􀆰 ５４ ｍｇ ／ （ ｇ·ｈ） ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １００％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｍｅｄｉａ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｆｅａｓｉｂｌｅ ａｐｐｒｏａｃｈ
ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｌｏｇｉｃａｌ ｕｓｅｆｕｌ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ⁃ｃｅｌｌ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ｗｈｏｌｅ⁃ｃｅｌｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ；Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
　 　 谷胱甘肽（ＧＳＨ）是 １种广泛存在于生物体内的
活性三肽化合物，分子中的活性巯基赋予了 ＧＳＨ多
种重要的生理功能，特别是对于维持体内适宜的氧
化还原环境起着至关重要的作用［１］。 ＧＳＨ 具有较
强的抗氧化、解毒、提高免疫力等功能，可广泛应用
于临床医药、食品加工和化妆品等诸多领域中，因
此市场需求正日益飞涨［２］。
常采用微生物发酵法以及酶法进行合成和生
产 ＧＳＨ［３］。 发酵法生产 ＧＳＨ 从原料成本上来说是
最经济的，但产物浓度偏低增加了 ＧＳＨ分离提取过
程的难度和费用［４］。 酶法合成 ＧＳＨ 可以获得较高
浓度的产物，但 ＧＳＨ 的合成是 １ 个系统工程，包括
γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的催
化和 ＡＴＰ 的供给，任何一步都有可能限制最终产
物［５］，而单纯提高某一酶活的水平并不一定能提高
最终 ＧＳＨ的合成量，因此需要考虑各因素的综合影
响［６－７］。 同时，如何将游离酶的活性一直保持在较
高的水平也是需要突破的技术难题［８］。
鉴于此，科学家们提出了全细胞催化 ／转化的
概念，其实质是充分利用细胞内的相关酶和辅因
子，结合适量的底物和前体的供给，高效地合成目
标产物［５，９］。 在全细胞转化过程中，获得具有高转
化能力活细胞是实现目标产物高效合成的前
提［１０－１１］，而合适的细胞培养条件尤其是营养物的浓
度及其组合对于提高细胞的转化能力具有非常重
要的作用［１２－１３］。
本文中笔者利用产朊假丝酵母全细胞转化合
成 ＧＳＨ，并结合响应面分析法对显著影响细胞转化
能力的培养基成分进行筛选和优化，以期在此基础
上实现 ＧＳＨ生物合成的高效运行。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
产朊假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ） ＳＺＵ ０７ ０１，苏
州大学微生物工程实验室保藏。
１􀆰 ２　 培养基
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、蛋白胨 ２０、酵母
粉 １０；ｐＨ ６􀆰 ０。
初始发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、蛋白胨 ２０、
酵母粉 １０、ＫＨ２ＰＯ４ １０、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５；ｐＨ ６􀆰 ０。
１􀆰 ３　 培养方法
种子液制备：将－７０ ℃冰箱中冻存的菌种接
种到种子培养基中，并于 ３０ ℃ 、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 下摇
床培养 ２４ ｈ，然后按体积分数 １０％的接种量将培
养液接种至发酵培养基中，同样条件下摇床培养
２０ ｈ。
ＧＳＨ生物转化： ５ ｍＬ 发酵液于 ４ ℃、 ３ ５００
ｒ ／ ｍｉｎ离心去上清，生理盐水洗涤 ２ 次后，向湿菌体
中加入 ５ ｍＬ前体反应液，于 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床
中转化 ６ ｈ。
前体反应液 （ｍｍｏｌ ／ Ｌ）：谷氨酸 ４０、半胱氨酸
４０、甘氨酸 ４０、ＡＴＰ ５０，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ５０，用 ｐＨ ７􀆰 ０
的磷酸缓冲液 ０􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ溶解［６］。
１􀆰 ４　 分析方法
生物量（ＤＣＷ）、ＧＳＨ的提取与测定方法参照文
献［１４］。 γ 谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ ＧＣＳ）的酶
活测定按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说
明书进行。
ＧＳＨ转化力定义：
转化力＝ ρ（转化后总 ＧＳＨ）
－ρ（转化前胞内 ＧＳＨ）
ρ（ＤＣＷ）·时间
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 单因素实验
保持其他成分不变，改变初始培养基中的某一
组分，分别考察各营养要素的不同水平对酵母细胞
生长及 ＧＳＨ转化力的影响，结果见图 １。 由图 １ 可
以看出，各因素合适的水平均在考察范围之内，酵
母细胞的生物量也大多保持在 １０ ｇ ／ Ｌ 左右。 但
ＧＳＨ转化力随着培养基的成分及其质量浓度的变
化而有较大的改变，当各因素的水平分别为葡萄糖
５０ ｇ ／ Ｌ，蛋白胨 ２５ ｇ ／ Ｌ，酵母粉 １０ ｇ ／ Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １５
ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５ ｇ ／ Ｌ和 ｐＨ ６􀆰 ０时，产朊假丝
酵母具有相对较高的 ＧＳＨ转化力。
２􀆰 ２　 Ｐｌａｃｋｅｔｔ⁃Ｂｕｒｍａｎ（Ｐ Ｂ）试验设计
在单因素实验的基础上进行 Ｐ Ｂ 试验设计，
每个因素取高（＋１）和低（－１）２个水平，高低水平的
设置依据图 １的实验结果进行。 Ｐ Ｂ 试验设计及
响应值、各因素效应及显著性分析见表 １。
在变量分析中，当参数的置信度大于 ９０％（即
Ｐ＜０􀆰 １），则可认为该因素具有显著的作用［１５］。 因
此，根据表 １ 结果发现，葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４是影响产
朊假丝酵母 ＧＳＨ转化力的显著因素，其余各因素对
响应值的影响均不显著。
４２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
图 １　 各因素对 ＧＳＨ转化力的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｏｎ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＧＳＨ
表 １　 Ｐ Ｂ实验设计及结果分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｐ⁃Ｂ
编号
ρ（因素） ／ （ｇ·Ｌ－１）
葡萄糖 蛋白胨 酵母粉 ＫＨ２ＰＯ４ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）
ｐＨ ＧＳＨ转化力 ／（ｍｇ·ｇ－１·ｈ－１）
１ １（３０） １（２５） －１（６􀆰 ５） １（１０） １（０􀆰 ０５） １（６） １􀆰 １５±０􀆰 ０５
２ －１（２０） １ １（１０） －１（６􀆰 ５） １ １ ０􀆰 ５４±０􀆰 ０３
３ １ －１（１６􀆰 ５） １ １ －１（０􀆰 ０３） １ １􀆰 ２０±０􀆰 ０６
４ －１ １ －１ １ １ －１（５􀆰 ５） ０􀆰 ７９±０􀆰 ０３
５ －１ －１ １ －１ １ １ ０􀆰 ５２±０􀆰 ０２
６ －１ －１ －１ １ －１ １ ０􀆰 ８４±０􀆰 ０２
７ １ －１ －１ －１ １ －１ ０􀆰 ６４±０􀆰 ０３
８ １ １ －１ －１ －１ １ ０􀆰 ７０±０􀆰 ０３
９ １ １ １ －１ －１ －１ １􀆰 １４±０􀆰 ０７
１０ －１ １ １ １ －１ －１ ０􀆰 ６６±０􀆰 ０２
１１ １ －１ １ １ １ －１ １􀆰 ００±０􀆰 ０３
１２ －１ －１ －１ －１ －１ －１ ０􀆰 ７３±０􀆰 ０１
Ｆ值 １１􀆰 １９ ０􀆰 ０１５ ０􀆰 １５ ６􀆰 ７８ １􀆰 ３９ １􀆰 ６２４×１０－４ ３􀆰 ２５ （模型）
Ｐ值 ０􀆰 ００８ ６ ０􀆰 ９０４ ０ ０􀆰 ７１１ ７ ０􀆰 ０２８ ６ ０􀆰 ２６８ ４ ０􀆰 ９９０ １ ０􀆰 ０４９ ８（模型）
显著性 ∗ ∗ ∗（模型）
５２　 第 ５期 朱　 健等：产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的营养条件
２􀆰 ３　 最陡爬坡试验结果
根据 Ｐ Ｂ 试验结果，设计显著因素葡萄糖和
ＫＨ２ＰＯ４的最陡爬坡路径和步长，并进行试验，结果
见表 ２。 由表 ２可知：具有最大 ＧＳＨ 转化力的酵母
细胞的培养条件以在试验 ５ 和 ７ 之间为宜，故选择
试验 ６的条件为响应面试验的中心点。
表 ２　 最陡爬坡试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｔｅｓｔ
编号 ρ（葡萄糖） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＫＨ２ＰＯ４） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ＧＳＨ转化力 ／
（ｍｇ·ｇ－１·ｈ－１）
１ ３０ １０ ０􀆰 ５３±０􀆰 ０２
２ ３５ １１􀆰 ３５ ０􀆰 ７８±０􀆰 ０３
３ ４０ １２􀆰 ７ ０􀆰 ８１±０􀆰 ０３
４ ４５ １４􀆰 ０５ １􀆰 ０２±０􀆰 ０２
５ ５０ １５􀆰 ４ １􀆰 ２６±０􀆰 ０６
６ ５５ １６􀆰 ７５ １􀆰 ３８±０􀆰 ０２
７ ６０ １８􀆰 １ １􀆰 ３１±０􀆰 ０６
８ ６５ １９􀆰 ４５ １􀆰 ２３±０􀆰 ０４
９ ７０ ２０􀆰 ８ ０􀆰 ９６±０􀆰 ０１
２􀆰 ４　 响应面设计及结果
２􀆰 ４􀆰 １　 中心组合设计（ＣＣＤ）
结合表 １和表 ２确定的主要影响因素及响应面
试验的中心点，利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ７􀆰 ０ 软件进行二
因素五水平的 ＣＣＤ 设计试验，实验结果见表 ３。 针
对 ＧＳＨ转化力的显著性检验及方差分析结果见
表 ４。
表 ３　 中心组合设计及实验结果
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＣＣＤ
编号 ρ（葡萄糖） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＫＨ２ＰＯ４） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ＧＳＨ转化力 ／
（ｍｇ·ｇ－１·ｈ－１）
１ －１（４５）　 　 　 －１（１４􀆰 ０５）　 １􀆰 １３±０􀆰 ０２
２ －１ －１ １􀆰 ０１±０􀆰 ０３
３ －１ －１ １􀆰 ０７±０􀆰 ０６
４ １（６５） －１ １􀆰 ３１±０􀆰 ０７
５ １ －１ １􀆰 ２６±０􀆰 ０１
６ １ －１ １􀆰 ３６±０􀆰 ０２
７ －１ １（１９􀆰 ４５） １􀆰 ２２±０􀆰 ０５
８ －１ １ １􀆰 ０８±０􀆰 ０３
９ －１ １ ０􀆰 ８７±０􀆰 ０３
１０ １ １ １􀆰 ３４±０􀆰 ０６
１１ １ １ １􀆰 ４０±０􀆰 ０３
１２ １ １ １􀆰 ３６±０􀆰 ０７
１３ －１􀆰 ４１４（４０􀆰 ８６） ０（１６􀆰 ７５） １􀆰 ３４±０􀆰 ０２
１４ －１􀆰 ４１４ ０ ０􀆰 ６８±０􀆰 ０３
１５ －１􀆰 ４１４ ０ １􀆰 １９±０􀆰 ０１
１６ １􀆰 ４１４（６９􀆰 １４） ０ １􀆰 ４９±０􀆰 ０５
１７ １􀆰 ４１４ ０ １􀆰 ２３±０􀆰 ０７
１８ １􀆰 ４１４ ０ １􀆰 ２３±０􀆰 ０４
１９ ０（５５） －１􀆰 ４１４（１２􀆰 ９３） ０􀆰 ８４±０􀆰 ０６
２０ ０ －１􀆰 ４１４ １􀆰 ０７±０􀆰 ０３
２１ ０ －１􀆰 ４１４ １􀆰 １２±０􀆰 ０２
２２ ０ １􀆰 ４１４（２０􀆰 ５７） １􀆰 ２３±０􀆰 ０４
２３ ０ １􀆰 ４１４ １􀆰 ２９±０􀆰 ０２
２４ ０ １􀆰 ４１４ １􀆰 ３３±０􀆰 ０６
２５ ０ ０ １􀆰 ４９±０􀆰 ０２
２６ ０ ０ １􀆰 ４２±０􀆰 ０１
２７ ０ ０ １􀆰 ４４±０􀆰 ０５
２８ ０ ０ １􀆰 ５６±０􀆰 ０３
２９ ０ ０ １􀆰 ５１±０􀆰 ０４
表 ４　 ＧＳＨ转化力的显著性检验及方差分析
Ｔａｂｌｅ ４　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ＧＳＨ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
因素 ＳＳ ｄｆ ＭＳ Ｆ值 Ｐ值 显著性
模型 ０􀆰 ４６ ５ ０􀆰 ０９３ １６􀆰 ４１ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
葡萄糖（Ｘ１） ０􀆰 １４ １ ０􀆰 １４ ２４􀆰 ６８ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
ＫＨ２ＰＯ４（Ｘ２） ０􀆰 ０５ １ ０􀆰 ０５ ８􀆰 ９５ ０􀆰 ００７ ５ ∗
Ｘ１Ｘ２ １􀆰 ０５８×１０－３ １ １􀆰 ０５８×１０－３ ０􀆰 １９ ０􀆰 ６６９ ９
Ｘ２１ ０􀆰 １７ １ ０􀆰 １７ ２９􀆰 ２５ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗∗
Ｘ２２ ０􀆰 ２２ １ ０􀆰 ２２ ３８􀆰 ２０ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
残差 ０􀆰 １１ １９ ５􀆰 ６３３×１０－３
失拟项 ０􀆰 ０２ ３ ６􀆰 ６３０×１０－３ １􀆰 ２１ ０􀆰 ３３６ ６
纯误差 ０􀆰 ０８７ １６ ５􀆰 ４５９×１０－３
总值 ０􀆰 ５７ ２４
６２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
　 　 显著性检验与方差分析能较为直观地了解实
验设计是否合理。 由表 ４ 结果可以看出，模型的显
著性小于 ０􀆰 ０００ １，说明模型非常显著；Ｘ１ 的显著性
小于 ０􀆰 ０００ １，Ｘ２ 的显著性等于 ０􀆰 ００７ ５（＜０􀆰 ０５），说
明 Ｘ１ 和 Ｘ２ 对 ＧＳＨ 转化力影响显著，且 Ｘ１ 的影响
非常显著；Ｘ１Ｘ２ 的显著性大于 ０􀆰 ０５，说明 Ｘ１ 和 Ｘ２
的交互作用不显著。 此外，失拟误差的显著性等于
０􀆰 ３３６ ６（＞０􀆰 ０５），说明所有实验数据都可以很好地
用模型来进行解释。
２􀆰 ４􀆰 ２　 响应面建模和图形分析
以 ＧＳＨ 转化力（Ｙ）为响应值，葡萄糖（Ｘ１）和
ＫＨ２ＰＯ４（Ｘ２）为自变量，利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 软件进
行二次多元回归拟合，得二次回归方程：
Ｙ＝ １􀆰 ４８＋０􀆰 ０９１Ｘ１ ＋０􀆰 ０５０Ｘ２ －９􀆰 ８９５Ｅ－００３Ｘ１Ｘ２－
０􀆰 １３Ｘ２１－０􀆰 １４Ｘ２２ （１）
图 ２　 葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４对 ＧＳＨ转化力影响
的响应面分析图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌｏｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ
ａｎｄ ＫＨ２ＰＯ４ ｏｎ ＧＳＨ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
图 ２给出了方程（１）的立体曲面图，该图直观
地反映出 ＧＳＨ转化力随葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４质量浓度
的变化规律。 由图 ２ 可知：随着葡萄糖质量浓度的
提高，ＧＳＨ 转化力快速增加，达到极大值后迅速下
降，在 ５５～６０ ｇ ／ Ｌ范围内存在最适合 ＧＳＨ转化的葡
萄糖质量浓度；ＫＨ２ＰＯ４也有与葡萄糖类似的现象，
但整体上其对 ＧＳＨ转化力的影响不如葡萄糖大，在
１６􀆰 ７５～１８􀆰 １ ｇ ／ Ｌ 范围内可以获得 ＧＳＨ 转化力最大
时的 ＫＨ２ＰＯ４质量浓度。 在 ＧＳＨ合成过程中适当的
Ｋ＋浓度已经被证实有利于细胞内部分酶活的提高，
并进而对 ＧＳＨ合成起到了一定的促进作用［１４］。 从
图 ２ 还可以看出：针对葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４的响应面
曲面上存在极大值点。 对方程（１）进行求导，通过
换算获得葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４的最佳质量浓度分别为
５８􀆰 ５和 １７􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ。 将此浓度代入方程（１）中，预测
得到 ＧＳＨ转化力的最大值为 １􀆰 ５０ ｍｇ ／ （ｇ·ｈ）。
２􀆰 ５　 模型的验证
综上，优化后的营养条件为葡萄糖 ５８􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、
蛋白胨 ２５ ｇ ／ Ｌ、酵母粉 １０ ｇ ／ Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １７􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５ ｇ ／ Ｌ和 ｐＨ ６􀆰 ０。 以初始培养基
为对照，在摇瓶中进行 ３ 次平行实验验证，结果发
现该优化营养条件下产朊假丝酵母的 ＧＳＨ 转化力
平均为 １􀆰 ５４ ｍｇ ／ （ ｇ·ｈ）（图 ３），与理论预测值非常
接近，这表明响应面分析方法是可靠的，能较好地
反映实际情况。 与对照的结果（０􀆰 ７７ ｍｇ ／ （ ｇ·ｈ））
相比，优化后的营养条件下 ＧＳＨ 转化力提高了
１ 倍。
图 ３　 响应面分析试验结果验证
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
３　 结　 论
在采用全细胞转化法合成 ＧＳＨ 的过程中，培
养出具有高 ＧＳＨ转化力的产朊假丝酵母对于 ＧＳＨ
的高效合成至关重要，而对酵母细胞的营养条件
进行优化则是需要重点关注的因素。 本文在单因
素实验的基础上，采用 Ｐ Ｂ 试验筛选出显著影响
ＧＳＨ转化力的培养基组分葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４。 采
用响应面分析方法对葡萄糖和 ＫＨ２ＰＯ４的最佳浓
度进行优化，预测在葡萄糖为 ５８􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ和 ＫＨ２ＰＯ４
为 １７􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ时， ＧＳＨ 转化力具有最大值 １􀆰 ５０
ｍｇ ／ （ ｇ·ｈ）。 验证实验结果表明，实际的 ＧＳＨ 转化
力平均为 １􀆰 ５４ ｍｇ ／ （ ｇ·ｈ），与预测值十分接近，比
营养条件优化前的 ＧＳＨ 转化力提高了 １ 倍。 因
７２　 第 ５期 朱　 健等：产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的营养条件
此，本文的研究结果可为进一步提高全细胞转化
ＧＳＨ的合成效率奠定基础。
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Ｉｎｃ．，２００９．
（责任编辑　 周晓薇）
８２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷