全 文 ：第 35 卷第 4 期
2015年 2月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.4
Feb.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:科技部科技基础性工作专项(2011FY110300); 山西省自然科学基金资助项目(2012011034鄄 3); 山西省回国留学人员科研资助项目
(20100012)和山西省教改资助项目(J2011088)
收稿日期:2014鄄08鄄05; 摇 摇 修订日期:2014鄄12鄄10
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: fzhang@ sxu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201408051563
武玉珍,冯睿芝,张峰.基于 ISSR分子标记的褐马鸡亲缘关系分析.生态学报,2015,35(4):1059鄄1067.
Wu Y Z, Feng R Z, Zhang F.Analysis on genetic relationship of Brown鄄eared pheasant (Crossoptilon mantchuricum) based on ISSR molecular marker.Acta
Ecologica Sinica,2015,35(4):1059鄄1067.
基于 ISSR分子标记的褐马鸡亲缘关系分析
武玉珍1,冯睿芝2,张摇 峰3,*
1 晋中学院生物科学与技术学院, 晋中摇 030619
2 复旦大学生物医学研究院,上海摇 200032
3 山西大学生命科学院,太原摇 030006
摘要:褐马鸡(Crossoptilon mantchuricum)是中国特有濒危鸟类,国家一级保护动物。 为了保护褐马鸡种质资源,保障驯养繁育种
群和再引入种群的遗传基因结构优化,采用 ISSR分子标记技术,对山西庞泉沟国家自然保护区和太原动物园两个种群 35个褐
马鸡进行了亲缘关系分析。 从 20条 ISSR引物中筛选出 10条扩增条带清晰稳定、重复性好的引物,共扩增出 65条 DNA条带,
其中 77%呈多态性。 两个种群各个体之间的 Nei忆s无偏差遗传距离和遗传相似度分析表明:个体间遗传相似性的平均值分别
为 0.5061与 0.7591,遗传距离的平均值分别为 0.4939与 0.2409。 用组平均法对 35 个褐马鸡个体进行聚类分析,结果显示:大
多数同一种群的个体首先聚在一起,显示出生态地理条件相似的种群亲缘关系较近。
关键词:褐马鸡;ISSR;遗传距离;遗传相似度;聚类分析;亲缘关系
Analysis on genetic relationship of Brown鄄eared pheasant (Crossoptilon
mantchuricum) based on ISSR molecular marker
WU Yuzhen1, FENG Ruizhi2, ZHANG Feng3,*
1 School of Biology Science and Technology, Jinzhong University, Jinzhong 030619, China
2 Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China
3 School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Abstract: The Brown鄄eared pheasant (Corossoptilon mantchuricum) is a critically endangered endemic to China, listed in
the national first鄄class protected bird in China. At present, the distribution area of the Brown鄄eared pheasant was isolated by
Yellow River and Taihang Mountains to form the three regions and the three isolated populations. Those isolated geographic
populations are the middle population located in Lvliang Mountains, Shanxi; the east population in Dongling Mountains,
Beijing and Xiaowutai Mountains, Hebei and the west population in Huanglong Mountains, Shaanxi, among which Shanxi is
the distribution center and abundance center of the Brown鄄eared pheasant. So far the most researches concerning the Brown鄄
eared pheasant mainly focus on biological, ecological, resource investigation and protection. Using molecular biological
method to the research of genetic diversity of the Brown鄄eared pheasant is still at the initial stage. For the protection of
germplasm resources of the Brown鄄eared pheasant and to optimize the genetic structure of captive populations and further
reintroduction, we detected the genetic relationship of 35 individuals in two populations in Shanxi from Pangquangou Nature
Reserve and Taiyuan Zoo were studied by using ISSR markers. Ten pairs of primers with repeatable clear and stable bands
from 20 pairs of ISSR primers for 35 samples of the two populations were selected, and 65 DNA bands were amplified with
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polymerase chain reactions, 77% of which were polymorphic bands. PhylTools software was used to calculate Nei忆s genetic
distance and genetic similarity of each individual from the two populations. The analysis from Nei忆s genetic distance and
genetic similarity of individuals from each other showed that the means of genetic similarity of individuals from the two
populations were 0.5061 and 0.7591, and the means of Nei忆s genetic distance were 0.4939 and 0.2409, respectively. As a
whole, the means of Nei忆s genetic distance and genetic similarity of all 35 individuals are 0.3723 and 0.6310, respectively,
which indicated that the genetic variation of individuals in the two populations were at low level, with relatively close genetic
distance. We also performed cluster analysis using group average clustering method with (0, 1) matrix and Nei忆s genetic
distance of the 35 individuals. The results showed that the samples with close genetic distance had close genetic relationship.
Most individuals from the same population were grouped together; it indicated that those from similar ecological and
geographical environment had the closer relationship. The individuals from Pangquangou Nature Reserve had lower genetic
similarity and further genetic distance with each other than the individuals from Taiyuan Zoo, which indicated that those
from Pangquangou Nature Reserve had further genetic relationship than those from Taiyuan Zoo. This may due to the free鄄
ranging method and the annual supplement of picking up wild eggs and hatching in Pangquangou Nature Reserve. With this
approach, we can easily identify genetic relationship of individuals and select those with relatively far genetic distance for
high quality germplasm resource. This method would serve as a novel tool in the research of endangered birds.
Key Words: Crossoptilon mantchuricum; ISSSR; genetic distances; genetic similarity; cluster analysis; genetic
relationship摇
褐马鸡(Crossoptilon mantchuricum)为中国特有珍稀鸟类,国家一级保护动物,世界濒危物种。 目前褐马
鸡只分布在中国华北的部分地区,由于太行山和黄河的阻隔,褐马鸡的栖息地被分割成三块孤立的自然地理
区域,形成了三个独立的褐马鸡种群,即山西吕梁山的中部种群、河北小五台山与北京东灵山的东部种群、陕
西黄龙山的西部种群。 山西省是褐马鸡分布中心和多度中心。 长期以来,对于褐马鸡的研究主要集中在生物
学、生态学、资源调查及保护等方面[1鄄3],近年来以分子生物学技术进行褐马鸡遗传多样性方面的研究[4鄄7]有
少量报道,表明对褐马鸡的研究开始从宏观进入微观分子水平。 但采用 ISSR 分子标记对褐马鸡亲缘关系的
研究目前尚未见报道。 ISSR (Inter鄄Simple Sequence Repeats)是 Zietkiewicz等[8]于 1994 年创建的一种新的分
子标记技术,它是根据基因组中广泛存在的微卫星序列,设计通用引物对基因组 DNA进行 PCR扩增,从而检
测基因组中微卫星序列的变异。 ISSR结合了 SSR和 RAPD 的优点,操作简单、稳定性好、检测方便,近年来广
泛应用在种群遗传多样性[9鄄10]、种质资源鉴定[11鄄12]、亲缘关系[13鄄14]和系统发育[15]等方面的研究。
本文采用 ISSR分子标记技术,对山西庞泉沟国家自然保护区和太原动物园的两个褐马鸡种群的 35 个个
体进行亲缘关系分析, 旨在了解这两个分别代表山西野生种群和笼养种群褐马鸡的遗传背景和种质潜质,为
保护褐马鸡种质资源和褐马鸡的野外放归与再引入提供科学的理论依据。
1摇 材料与方法
1.1摇 材料
实验材料:庞泉沟褐马鸡样品 18份,其中肌肉样品 3 份,采自庞泉沟保护区繁育场死亡幼雏;血液样品
15份,采自保护区繁育场混养的成年褐马鸡。 太原动物园血液样品 17 份,均采自动物园笼养种鸡,实验样品
共 35份。
1.2摇 方法
1.2.1摇 DNA提取
分别取 0.34g肌肉、10—70 滋L的血液,采用常规的 SDS /蛋白酶 K裂解, 酚 /氯仿法提取基因组总 DNA,
详细操作参照武玉珍[16]文献。
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1.2.2摇 ISSR引物的筛选
依据加拿大不列颠哥伦比亚大学(UBC)公布的第 9套 ISSR引物序列,参照 Abbot[17]与白秀娟[18]的研究
结果,选择其中的 20条引物(表 1),均由北京奥科公司合成。 通过 4 个随机样本的选择,从 20 条 ISSR 引物
中筛选出 10条扩增产物稳定、条带清晰、重复性好的引物,再对全部材料进行 PCR扩增。
1.2.3摇 ISSR鄄PCR扩增
在 25滋L反应体系中含有 10伊PCR Buffer 2.5滋L、25mmol / L Mg2+ 2滋L、1.25 mmol / L dNTP 4滋L、5.0 滋mol / L
引物 5.0滋L、2 U / 滋L Taq酶 0.5滋L、10 ng—150 ng / 滋L DNA模板 1 滋L,余量由 ddH2O补足,在 PTC鄄150 PCR仪
上进行扩增。 PCR反应条件为:94 益预变性 5 min,94 益变性 45 s,退火温度 38—54 益 45 s,72 益延伸1 min,
40个循环,最后 72 益延伸 7min。 每条引物的 PCR反应退火温度见表 1。
表 1摇 ISSR引物序列
Table 1摇 ISSR primer sequences
引物编号
Primer No.
引物序列(5忆鄄3忆)
Primer sequence
退火温度 / 益
Annealing temperature
引物编号
Primer No.
引物序列(5忆鄄3忆)
Primer sequence
退火温度 / 益
Annealing temperature
802 ATATATATATATATATT 36 815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 54
803 ATATATATATATATATC 38 816 CACACACACACACACAT 52
805 TATATATATATATATAC 38 817 CACACACACACACACAA 52
806 TATATATATATATATAG 38 818 CACACACACACACACAG 54
807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 52 820 GTGTGTGTGTGTGTGTC 54
808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 54 822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 52
809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 54 824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 54
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 54 827 ACACACACACACACAG 54
812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 52 829 TGTGTGTGTGTGTGTGC 54
814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 52 830 TGTGTGTGTGTGTGTGG 54
1.2.4摇 电泳检测
PCR产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,DNA marker 为 DL2000 (购自大连宝生物公司),采用凝胶成
像系统观察拍照,并记录电泳结果。
摇 图 1摇 引物 ISSR 811对太原动物园 1—10号样品扩增的指纹图谱
Fig.1摇 Profile of the Brown鄄eared pheasant from Taiyuan Zoo by
primer 811
1.2.5摇 谱带分析
ISSR扩增谱带以 0、1数据统计,在同一引物,同一位点,根据扩增产物的有(1)无(0)得到二元资料,形
成 ISSR分析的原始数据矩阵(0,1)矩阵。 利用 PhylTools6.0软件计算两个种群各个体之间的 Nei忆s无偏差遗
传距离和遗传相似度,应用组平均法对褐马鸡 35个个体的(0,1)原始矩阵进行聚类分析,得到聚类结果。
2摇 研究结果
2.1摇 ISSR扩增图谱
本实验中共试验了 20 条 ISSR 引物, 其中 10条可
扩增出清晰条带, 将其用于供试 35个样本 PCR扩增,引
物编号分别为 806、807、808、809、811、812、815、816、817和
818,除 806 外,引物的退火温度在 50益以上, 保证了
PCR 反应较高的特异性。 10条引物共扩增出 65条清晰
稳定的条带,扩增片段大小在 300—2000bp 之间,每个引
物扩增的位点从 5到 9不等,平均为 6.5,65个扩增位点
中有 50个位点具有多态性,多态性位点比率为 76.9%。
引物对部分样品的扩增结果见图 1—图 3。
1601摇 4期 摇 摇 摇 武玉珍摇 等:基于 ISSR分子标记的褐马鸡亲缘关系分析 摇
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图 2摇 引物 ISSR 811扩增的太原动物褐马鸡 11—17 号样和庞泉沟
12、13样品的指纹图谱
Fig.2摇 Profile of the Brown鄄eared pheasant from Taiyuan Zoo and
Pangquangou Nature Reserve by primer 811
图 3摇 引物 ISSR811扩增的庞泉沟自然保护区褐马鸡样品的指纹
图谱
Fig. 3 摇 Profile of the Brown鄄eared Pheasant of Pangquangou
Natural Reserve using primer 811
2.2摇 遗传距离与遗传相似系数
利用 PhylTools软件计算出了褐马鸡两个种群各个体之间的 Nei忆s遗传距离(表 2和表 3)、遗传相似系数
(表 4和表 5)。
从表 2可以看出:太原动物园 17 个个体间的遗传距离为 0.0000—0.5348,平均值为 0.2409。 其中,dwy8
与 dwy6之间遗传距离最大为 0.5348,其次是 dwy1 与 dwy10 间为 0.5000,而 dwy7 与 dwy2,dwy9 与 dwy5,
dwy12分别与 dwy5、dwy9,dwy13与 dwy3,dwy14分别与 dwy3、dwy13,dwy16与 dwy15,dwy17与 dwy4间遗传距
离为 0.0000。
表 2摇 太原动物园 17只褐马鸡之间的 Nei忆s 遗传距离
Table 2摇 Nei忆s Genetic distance of the 17 individuals of Brown鄄eared pheasant from Taiyuan Zoo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1
2 0.2000
3 0.3333 0.3846
4 0.0909 0.1111 0.4286
5 0.0909 0.1111 0.2857 0.2000
6 0.3333 0.3846 0.1111 0.2857 0.4286
7 0.2000 0.0000 0.3846 0.1111 0.1111 0.3846
8 0.2000 0.2500 0.3846 0.3333 0.1111 0.5384 0.2500
9 0.0909 0.1111 0.2857 0.2000 0.0000 0.4286 0.1111 0.1111
10 0.5000 0.4000 0.2000 0.4545 0.4545 0.2000 0.4000 0.4000 0.4545
11 0.2308 0.2727 0.1250 0.3333 0.1667 0.2500 0.2727 0.2727 0.1667 0.2308
12 0.0909 0.1111 0.2857 0.2000 0.0000 0.4286 0.1111 0.1111 0.0000 0.4545 0.1667
13 0.3333 0.3846 0.0000 0.4286 0.2857 0.1111 0.3846 0.3846 0.2857 0.2000 0.1250 0.2857
14 0.3333 0.3846 0.0000 0.4286 0.2857 0.1111 0.3846 0.3846 0.2857 0.2000 0.1250 0.2857 0.0000
15 0.2857 0.3333 0.0588 0.3846 0.2308 0.1765 0.3333 0.3333 0.2308 0.1429 0.0667 0.2308 0.0588 0.0588
16 0.2857 0.3333 0.0588 0.3846 0.2308 0.1765 0.3333 0.3333 0.2308 0.1429 0.0667 0.2308 0.0588 0.0588 0.0000
17 0.0909 0.1111 0.4286 0.0000 0.2000 0.2857 0.1111 0.3333 0.2000 0.4546 0.3333 0.2000 0.4286 0.4286 0.3846 0.3846
摇 摇 1—17 分别为:dwy 1—17 号个体
从表 3可以看出:庞泉沟保护区 18个个体间的遗传距离在 0.000—1.000 之间,平均值为 0.4939。 其中,
pqg2与 pqg5、pqg 8、pqg14—18,pqg3 与 pqg5,pqg4 与 pqg5、pqg 8、pqg14—18,pqg5 与 pqg8、pqg12,pqg7 与
pqg11,pqg8与 pqg11,pqg11与 pqg16遗传距离最远为 1.0000;其次是 pqg10 与 pqg2、pqg4 以及 pqg9 与 pqg11
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间遗传距离为 0.8182;而 pqg4与 pqg2、pqg12与 pqg3、pqg15与 pqg14遗传距离最近为 0.0000。
表 3摇 庞泉沟自然保护区 18只褐马鸡之间的 Nei忆s 遗传距离
Table 3摇 Nei忆s Genetic distance of the 18 individuals of Brown鄄eared pheasant from Pangquangou Nature Reserve
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1
2 0.5556
3 0.4545 0.6667
4 0.5556 0.0000 0.6667
5 0.5000 1.0000 1.0000 1.0000
6 0.4286 0.5556 0.2727 0.5556 0.6667
7 0.5000 0.7143 0.5556 0.7143 0.6000 0.1667
8 0.5556 1.0000 0.3333 1.0000 1.0000 0.5556 0.4286
9 0.3846 0.5000 0.4000 0.5000 0.6364 0.0769 0.0909 0.5000
10 0.2500 0.8182 0.3846 0.8182 0.2857 0.2500 0.4286 0.6364 0.3333
11 0.3333 0.7143 0.5556 0.7143 0.4000 0.6667 1.0000 1.0000 0.8182 0.2857
12 0.4545 0.6667 0.0000 0.6667 1.0000 0.2727 0.5556 0.3333 0.4000 0.3846 0.5556
13 0.2000 0.8000 0.3333 0.8000 0.3846 0.3333 0.5385 0.6000 0.4286 0.0588 0.2308 0.3333
14 0.2857 1.0000 0.4545 1.0000 0.3333 0.4286 0.5000 0.5556 0.5385 0.1250 0.3333 0.4545 0.0667
15 0.2857 1.0000 0.4545 1.0000 0.3333 0.4286 0.5000 0.5556 0.5385 0.1250 0.3333 0.4545 0.0667 0.0000
16 0.6364 1.0000 0.5000 1.0000 0.5556 0.2727 0.1111 0.3333 0.2000 0.3846 1.0000 0.5000 0.5000 0.4545 0.4545
17 0.3333 1.0000 0.5000 1.0000 0.2308 0.3333 0.3846 0.6000 0.4286 0.0588 0.3846 0.5000 0.1250 0.0667 0.0667 0.3333
18 0.1667 1.0000 0.5556 1.0000 0.4000 0.6667 0.6000 0.4286 0.6364 0.2857 0.4000 0.5556 0.2308 0.1667 0.1667 0.5556 0.2308
摇 摇 1—18 分别为:pqg 1—18 号个体
从表 4可以看出:太原动物园种群中,dwy7 与 dwy2,dwy9 与 dwy5,dwy12 分别与 dwy5、dwy9,dwy13 与
dwy3,dwy14分别与 dwy1、dwy4,dwy16 与 dwy15,dwy17 与 dwy4 之间遗传相似度最高为 1.0000,遗传距离最
近;而 dwy8与 dwy6之间遗传相似度最低为 0.4615,遗传距离最远。
表 4摇 太原动物园 17只褐马鸡之间的 Nei忆s 遗传相似系数
Table 4摇 Nei忆s Genetic similarities of 17 individuals of Brown鄄eared pheasant of Taiyuan Zoo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1
2 0.8000
3 0.6667 0.6154
4 0.9091 0.8889 0.5714
5 0.9091 0.8889 0.7143 0.8000
6 0.6667 0.6154 0.8889 0.7143 0.5714
7 0.8000 1.0000 0.6154 0.8889 0.8889 0.6154
8 0.8000 0.7500 0.6154 0.6667 0.8889 0.4615 0.7500
9 0.9091 0.8889 0.7143 0.8000 1.0000 0.5714 0.8889 0.8889
10 0.5000 0.6000 0.8000 0.5455 0.5455 0.8000 0.6000 0.6000 0.5455
11 0.7692 0.7273 0.8750 0.6667 0.8333 0.7500 0.7273 0.7273 0.8333 0.7692
12 0.9091 0.8889 0.7143 0.8000 1.0000 0.5714 0.8889 0.8889 1.0000 0.5455 0.8333
13 0.6667 0.6154 1.0000 0.5714 0.7143 0.8889 0.6154 0.6154 0.7143 0.8000 0.8750 0.7143
14 1.0000 0.6667 0.6154 1.0000 0.5714 0.7143 0.8889 0.6154 0.6154 0.7143 0.8000 0.8750 0.7143
15 0.7143 0.6667 0.9412 0.6154 0.7692 0.8235 0.6667 0.6667 0.7692 0.8571 0.9333 0.7692 0.9412 0.9412
16 0.7143 0.6667 0.9412 0.6154 0.7692 0.8235 0.6667 0.6667 0.7692 0.8571 0.9333 0.7692 0.9412 0.9412 1.0000
17 0.9091 0.8889 0.5714 1.0000 0.8000 0.7143 0.8889 0.6667 0.8000 0.5455 0.6667 0.8000 0.5714 0.5714 0.6154 0.6154
摇 摇 1—17 分别为:dwy 1—17 号个体
3601摇 4期 摇 摇 摇 武玉珍摇 等:基于 ISSR分子标记的褐马鸡亲缘关系分析 摇
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从表 5可以看出:庞泉沟自然保护区种群中,pqg4 与 pqg2,pqg12 与 pqg3,pqg15 与 pqg14 遗传相似度最
高为 1.0000,遗传距离最近;而 pqg2、pqg4分别与 pqg5、pqg8、pqg14、pqg15、pqg16、pqg17、pqg18, pqg5 分别与
pqg3、pqg8、 pqg12,pqg11与 pqp8、pqg7,遗传一致度最低为 0.0000,遗传距离最远。
表 5摇 庞泉沟自然保护区 18只褐马鸡之间的 Nei忆s 遗传相似系数
Table 5摇 Nei忆s Genetic similarities of 18 individuals of Brown鄄eared pheasant of Pangquangou Nature Reserve
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1
2 0.4444
3 0.5455 0.3333
4 0.4444 1.0000 0.3333
5 0.5000 0.0000 0.0000 0.0000
6 0.5714 0.4444 0.7273 0.4444 0.3333
7 0.5000 0.2857 0.4444 0.2857 0.4000 0.8333
8 0.4444 0.0000 0.6667 0.0000 0.0000 0.4444 0.5714
9 0.6154 0.5000 0.6000 0.5000 0.3636 0.9231 0.9091 0.5000
10 0.7500 0.1818 0.6154 0.1818 0.7143 0.7500 0.5714 0.3636 0.6667
11 0.6667 0.2857 0.4444 0.2857 0.6000 0.3333 0.0000 0.0000 0.1818 0.7143
12 0.5455 0.3333 1.0000 0.3333 0.0000 0.7273 0.4444 0.6667 0.6000 0.6154 0.4444
13 0.8000 0.2000 0.6667 0.2000 0.6154 0.6667 0.4615 0.4000 0.5714 0.9412 0.7692 0.6667
14 0.7143 0.0000 0.5455 0.0000 0.6667 0.5714 0.5000 0.4444 0.4615 0.8750 0.6667 0.5455 0.9333
15 0.7143 0.0000 0.5455 0.0000 0.6667 0.5714 0.5000 0.4444 0.4615 0.8750 0.6667 0.5455 0.9333 1.0000
16 0.3636 0.0000 0.5000 0.0000 0.4444 0.7273 0.8889 0.6667 0.8000 0.6154 0.0000 0.5000 0.5000 0.5455 0.5455
17 0.6667 0.0000 0.5000 0.0000 0.7692 0.6667 0.6154 0.4000 0.5714 0.9412 0.6154 0.5000 0.8750 0.9333 0.9333 0.6667
18 0.8333 0.0000 0.4444 0.0000 0.6000 0.3333 0.4000 0.5714 0.3636 0.7143 0.6000 0.4444 0.7692 0.8333 0.8333 0.4444 0.7692
摇 摇 1—18 分别为:pqg 1—18号个体
2.3摇 亲缘关系聚类图
应用组平均法对褐马鸡 35 个个体的(0,1)原始矩阵进行聚类分析,结果见图 4。 从图 4 看出:35 个个体
聚为 3类,其中 24(pqg7)为单独一类;太原动物园除 dwy7 外,其它个体聚为一类;庞泉沟自然保护区的个体
聚为一类。 大多数同一种群的不同个体首先聚在一起,显示出明确的生态地理条件相似的种群优先相聚,也
就是说生态地理条件相似的种群亲缘关系较近。 pqg7 显示出与两个种群的其他个体亲缘关系相对较远;
dwy6与动物园种群的其他个体亲缘关系相对较远;dwy7显示出与庞泉沟种群具有较近的亲缘关系。
3摇 分析与讨论
3.1摇 ISSR实验的稳定性
要获得一个物种不同种群的遗传背景信息,必需检测大量的样本,检测方法的稳定性也是非常重要的。
ISSR引物一般是由 17bp的碱基组成,对基因组 DNA 具有快速、高效、灵敏的检测特性,而且可重复性好,操
作简便、成本较低,实验的稳定性较高[19]。 由于 ISSR的稳定性受 Mg2+浓度、引物浓度、退火温度等因素的影
响,因此,进行 ISSR大量样本的扩增前,先对 ISSR反应的条件进行了优化,采用统一的 PCR反应条件。 对 20
条 ISSR引物进行了筛选,其中有 10条引物能扩增出条带清晰且具多态性的带型。 在这 10 条引物中(AG) n
与(CA) n 各有 3条,(GA) n 有 2条,说明褐马鸡基因组中存在大量的(CA)、(AG)二核苷酸重复序列。 在引
物筛选的过程中,退火温度较高的引物扩增效果均较退火温度低的好,筛选出所选用的 10条引物只有 1 条退
火温度较低,其它 9条引物退火温度均较高。 在 ISSR图谱中出现某种群的特征条带,引物 815的扩增图谱只
有庞泉沟种群的个体出现大于 1000 bp 的片段,引物 811、812、809 对庞泉沟自然保护区种群的扩增有特异
性。 引物 811可以将这 35个个体区分开。 因此,只要引物选择合适,扩增出种群的特征性谱带,有助于种群
的遗传结构分析,为进一步克隆、测序,寻找种群特有的分子标记提供了可能。
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图 4摇 用 Between鄄groups linkage法构建的褐马鸡两个种群 35个个体的 ISSR聚类图
Fig.4摇 ISSR dendrogram of 35 individuals from two populations of Brown鄄eared pheasant using Between鄄groups linkage
应用 mtDNA标记和 ISSR标记两种方法,对这两个褐马鸡种群进行了遗传多样性的研究[5,7],二者的结果
基本一致,这表明无论用线粒体 DNA标记(mtDNA),还是细胞核 DNA标记(ISSR),研究的结果基本相同,可
以互为印证。 这说明 ISSR 标记是一种研究种群遗传多样性、遗传结构、种质资源及亲缘关系的稳定有效
工具。
3.2摇 亲缘关系分析
山西庞泉沟国家自然保护区与太原动物园两个褐马鸡种群个体间遗传相似性的平均值分别为 0.5061 与
0.7591,遗传距离的平均值分别为:0.4939 与 0.2409,35 只褐马鸡个体总的 Nei忆s遗传距离和相似性系数平均
值分别为:0.3723和 0.6310。 分析表明两个种群的遗传变异有差异,但差异未达到统计学显著性水平,两个种
群个体之间亲缘关系较近。 聚类分析结果表明:遗传距离较近的个体聚在一起,然后与遗传距离较远的个体
再聚。 遗传距离较近的个体亲缘关系近,而遗传距离较远的个体,亲缘关系较远。 大多数同一种群的不同个
体首先聚在一起,显示出生态地理条件相似的种群优先相聚,但也存在不同种群聚在一起的情况。 如图 4 中
pqg7单独聚为一类,显示出与两个种群亲缘关系较远,推测可能是来自保护区分布较远的不同种群的后代。
图 4中 dwy7与庞泉沟种群聚为一类,显示出与庞泉沟种群有较近的亲缘关系,推测这两个褐马鸡种群可能具
有共同的亲源。 这一结论与太原动物园饲养褐马鸡的历史相符合。 太原动物园 1959 年由芦芽山(宁武县)
提供褐马鸡种源,开始试验人工饲养,曾经 4 次较大数量补充野生种源,1979—1983 年从芦芽山补充 60 余
只,1992年和 2014年分别从庞泉沟自然保护区补充野生种源 8 只、6 只,2011 年从芦芽山补充野生卵孵化 9
只。 到 2000年建成了全国最大的褐马鸡人工饲养繁育基地,为全国各地动物园提供褐马鸡种源和观赏鸡。
两个种群遗传相似性和遗传距离的差异(表 2—表 5),反应出两个种群饲养方式的不同。 庞泉沟自然保
护区的个体间遗传相似性的平均值低于太原动物园,遗传距离的平均值高于太原动物园,说明庞泉沟种群个
5601摇 4期 摇 摇 摇 武玉珍摇 等:基于 ISSR分子标记的褐马鸡亲缘关系分析 摇
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体间的亲缘关系较远,动物园种群个体之间的亲缘关系较近。 这种状况与两个种群不同的饲养方式有关。 庞
泉沟自然保护区繁育场采取仿野生的散养、混养方式,并且每年从保护区野外捡拾褐马鸡卵进行孵化补充种
群,繁育场的种群虽然有可能近亲繁殖,但因为不断有新种源补充,群体的亲缘关系仍较远。 太原动物园从
1996年起选配 12对成年褐马鸡实行“一夫一妻冶的分笼配对繁殖饲养,这种方式有效避免了近交繁殖,但是
种源有限,更新也较慢,群体的亲缘关系仍比较近。 因为饲养的用途不同,所采取的饲养方式也不同。
本试验对褐马鸡两个种群 35个个体进行遗传距离聚类及亲缘关系分析,可作为优质种源和再引入亲本
选择时的理论依据。 作为亲本应尽量选择遗传距离大于 0.5 的组合,同时避免遗传距离小于 0.25 的亲本组
合。 可重点选择庞泉沟自然保护区野生种群的 pqg2、pqg4 分别与 pqg5、pqg8、pqg14、pqg15、pqg16、pqg17、
pqg18,pqg5与 pqg3、pqg8、 pqg12,pqg11与 pqp7、pqg8等,这些个体之间遗传相似性最低(0.0000),遗传距离
最远(1.0000),亲缘关系最远,可以作为优质亲本种源。
3.3摇 ISSR标记在野生动物研究中的应用前景
ISSR标记常用作一种植物(农作物、药材等)多个品种、品系之间亲缘关系的区分和鉴定。 但野生动物个
体之间外部形态差异不大,亲缘关系主要与生态地理环境有关,特别是像褐马鸡这种飞行能力较差的地栖鸟
类。 应用 ISSR标记技术可以有效分辨动物个体之间的亲缘关系,同时可以筛选出亲缘关系较远的个体,如独
自聚为一类的 pqg7个体(图 4),作为人工饲养繁育的优质种源和褐马鸡再引入的原始种源。 栖息地的破碎
化致使我国的褐马鸡被分割为 3个孤立种群(山西、河北、陕西),各种群之间因地理阻隔难有基因交流,遗传
多样性较低[5,7]。 以 ISSR标记研究褐马鸡亲缘关系、寻找发现优质种源,对褐马鸡的种群发展和科学保护具
有重要的学术价值和现实意义。
ISSR标记作为以 PCR为基础的分子标记,除具有操作简单、成本低、快速、灵敏的优点外,还有所需 DNA
模板量少、稳定和多态条带丰富等优点,是研究物种遗传背景的有效工具。 ISSR标记已广泛应用于植物的遗
传连锁图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、植物分类、进化和遗传多样性等研究[20],而在动物研究中应用较
少[21],仅有少数家禽与水产鱼虾蟹的研究。 ISSR 标记用于濒危野生动物的研究则更少,仅见东北虎[18]
(Panthera tigris altaica)、金钱豹[22](Panthera pardus)和北海狮[23](Eumetopias jubatus)、獐(Hydropotes inermis)
[24]等研究,而用于珍稀野生鸟类的研究鲜见报道。 本研究将 ISSR标记技术用于中国特有的濒危鸟类———褐
马鸡的亲缘关系研究,扩展了鸟类遗传背景和系统进化等方面的研究手段,是有意义的尝试和探索,对其他野
生动物的遗传分析也不失为一种便捷稳定的方法。 由于采样数量及引物数量较少,检测到的位点有限,对褐
马鸡圈养和野生种群亲缘关系的全面评价,有待于进一步深入研究。
致谢:山西省自然保护区管理站张龙胜教授、山西庞泉沟国家自然保护区管理站武建勇高级工程师及太原动
物园卫泽珍副主任、孟庆珍兽医师等对样品采集中给予帮助,特此致谢。
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