全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月 生"物"加"工"过"程 6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4 dDJ>! ,D># 0@A>$%&%
IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$?(5*!>$%&%>%#>%%(
收稿日期"$%% ?&& ?&! 基金项目"国家西部开发重大资助项目#$%%./P%&P&.$)陕西省,&(&&#-资助项目#$%%*ORQ6?%.$作者简介"韩立荣#&*%$&女&新疆塔城人&博士研究生&研究方向"微生物及农药学)张"兴#联系人$&教授&博士生导师& 1^M3CJ":;VCE4&#$f
&$5>LDM 青霉 TCB A 固态发酵植物农药残渣产纤维素酶 韩立荣&祝传书&孙平平&高保卫&张"兴 #西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心&陕西省生物农药工程技术研究中心&杨凌 *&$&%%$摘"要"采用单因素试验观察了不同6(,源(植物提取残渣与麦麸比例(初始 A+和水料比对青霉 )&%$ 菌株产
纤维素酶的影响)在此基础上根据 /DV1NCJGDE 的中心组合试验设计原理&选取蛋白胨(初始 A+和水料比等影响因
素&采用三因素五水平的响应面分析方法&对瓦克青霉 )&% $的固态产纤维素酶条件进行了优化 其优化后的产 酶条件为)#川楝树皮残渣$k)#麦麸$k)#蛋白胨$k)#c+
$<- .$ l!%k$%k&h.k%h.(初始 A+5h$(水料比 $k&($5 i发酵! I&在此条件下纤维素酶比酶活可达5h.* X74&较原始培养条件提高了 .5h(!g
关键词"纤维素酶)瓦克青霉)植物农药残渣)固体发酵
中图分类号"\*&$) Y8$%>5""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$?(5*!#$%&%$%# ?%%&& ?%5 !26.I1F5F0704J0/F5F.2/724942I3:./; :0636510HG 3(1#$#/#0)4*5+)*1#TCBWA HG 31./; 965/F901F:.I0401.I30
+P,ZC12DE4&O+X6;K3E1G;K&0X,#W@G@32L; 3EI R@[@JDAM@EB6@EB@2DF/CD23BCDE3J<@GBCLCI@&Y@L;EDJD4H3EI E^4CE@@2CE46@EB@2DF/CDA@GBCLCI@&
,D2B;N@GBP42CLKJBK2@n)D2@GB2HXEC[@2GCBH&]3E4JCE4*&$&%%&6;CE3$
*H1F45:F"Y;@@F@LBGDFL329DE GDK2L@&ECB2D4@E GDK2L@&2@GCIK@GBDN;@3B923E 23BCD&3EI N3B@2BDM3B@2C3J
23BCDDE L@JKJ3G@A2DIKLBCDE N@2@D9G@2[@I CE B;@GCE4J@1F3LBD2B@GB>/3G@I DE /DV1NCJGDE F3LBD2C3JI@GC4E&
B;2@@F3LBD2GDFECB2D4@E GDK2L@&CECBC3JA+[3JK@&3EI N3B@2BDM3B@2C3J23BCDN@2@G@J@LB@I 3GB;@D9[CDKG
F3LBD2G>Y;@2@GADEG@GK2F3L@M@B;DIJD4HNCB; B;2@@F3LBD2G3EI FC[@J@[@JGN3GKG@I BDDABCMC:@B;@F@21
M@EB3BCDE LDEICBCDEG>Y;@DABCM3JLKJBK2@LDEICBCDEGN@2@3GFDJDNG" )#L;CE39@2H2@GCIK@G$k)#N;@3B 923E$k)#A@ABDE@$k)#c+$
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$5 i FD2! I>XEI@2B;@G@DABCM3JLDEICBCDEG&L@JKJ3G@GA@LC3J3LBC[CBHN3G5h.* X74&B;KGCBN3G .5h(!g ;C4;@2B;3E B;3BDFB;@D2C4CE3JDE@> L0G K24I1"L@JKJ3G@)2(1#$#/#0)3*4+)*1#)AJ3EBA@GBCLCI@2@GCIK@)GDJCI GB3B@F@2M@EB3BCDE
""纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶
系&根据其中各酶功能的差异&可被分为三大类"内
切葡聚糖酶 #&&.19@B31?14JKL3E1.14JKL3ED;HI2DJ3G@&
Q^& 6^(>$>&>.$(外切葡聚糖酶#&&.19@B31?14JK1
L3E1.1L@JD9CD;HI2DJ3G@&6/+& 6^(>$>&>&$ 和
!
葡萄糖苷酶 # 9@B31?14JKLDGCID1.14JKLD;HI2DJ3G@& 6^
(>$>&>$&$*& ?$+
纤维素酶可将纤维素降解为葡萄
糖&在生物质转化及生物能源开发等方面有着巨大
潜力&受到国内外学者的高度重视
产纤维素酶的生物种群相当广泛&细菌(真菌(
动物体等都能产生纤维素酶*(+ 但目前对纤维素
酶的研究大多集中在木霉属真菌#!"#$%&(")*$&尤
其对里氏木霉#!>"((+(#$的研究已经非常细致*.+ 相对于木霉属微生物而言&青霉属#2(1#$#/#0)$一 些微生物能够合成更平衡的纤维素降解酶系&并可 以弥补木霉产葡萄糖苷酶不足的缺陷*# ?5+ 因此& 选择青霉属中高产纤维素酶菌株&强化其产酶能 力&对于解决目前纤维素酶工业化应用中酶成本 高(产率低的瓶颈问题具有重要的意义 ""青霉 )&%$#2(1#$#/#0)3*4+)*1#$是由西北
农林科技大学无公害农药研究服务中心筛选出的
纤维素酶产生菌&该菌可利用农作物秸秆(植物农
药残渣等多种纤维类废弃物产生高活性的纤维素
酶和半纤维素酶** ?!+ 随着微生物酶技术的发展&
多种纤维类工(农业废弃物已被成功地应用于微生
物固态发酵产纤维素酶的研究* ?&&+ 目前已有烟
碱(苦参碱(楝素(茴蒿素和茶皂素等 (. 种植物源农
药登记注册&年产量约! %%% B&年产植物农药残渣约
&# %%% B左右 随着植物农药的研究和生产&植物农
药残渣逐渐成为一种潜在的污染源 因此&研究植
物农药残渣处理对减少环境污染(资源再利用都具
有重要意义 本文以植物农药残渣为发酵基质&利
用固态发酵方法对青霉 )&% $产纤维素酶进行研 究&采用单因素和响应面试验方法对青霉)&%$ 产
纤维素酶条件进行优化&为其进一步应用提供理论
依据
C?材料与方法
C=C?供试菌株
""青霉)&% $#2>3*4+)*1#$是以植物农药残渣
为唯一6源筛选得到的纤维素酶产生菌&保藏于西
北农林科技大学无公害农药研究服务中心
C=A?试验材料
""选取巴东醉鱼草全株(马齿苋全株(小果博落
回茎叶(大花金挖耳全株(川楝树皮(雷公藤根皮和
砂地柏果实等 * 种植物作为供试材料 将以上植物
药用部分粉碎&用 *%g#体积分数&下同$乙醇提取$ ;&重复浸提 . 次&过滤后的滤渣即为植物农药
残渣
C=Q?培养基
"" 斜面培养基" 麦麸 &%% 4& 琼脂 &# 4& 蒸馏
水 & %%% MZ
""基础固体发酵培养基"川楝残渣 ! 4&麦麸 $4& #,+ .$
$0- . %h&# 4&c+$
<-
.
%h%. 4&水料比为 $k& #MZ74$&$#% MZ三角瓶装料量为&% 4 C=R?方法 &>.>&"酶液的制备 ""称取发酵培养物& 4&加入%h%# MDJ7Z+PL1 ,3PL#A+#h%$缓冲液&% MZ&.% i振荡提取$;&离 心&上清液即为粗酶液 &>.>$"酶活力测定
""酶活性测定参照文献*&$+&还原糖测定采用 R,0法*&(+ ""纤维素酶活性以滤纸酶活#)<3G@$表示 酶活
定义&每克干曲每分钟水解底物生成相当于&
#
MDJ
葡萄糖的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位
#X$&>.>("响应面试验设计 ""采用响应面分析法中的/DV1NCJGDE 中心组合设 计*&.+ 以 )<3G@活性为响应值 #B$&蛋白胨含量
#C
&
$(初始 A+#C$
$和水料比#C ($分别为变量&优
化青霉)&% $的发酵产酶条件 发酵条件优化试 验的因素水平设计见表 & 表 C?发酵条件试验的因素水平表 D5H60C?#O904.J0/F5675:F245/I60N06127F-0 ./I090/I0/FN54.5H601 因素 编码水平 ?&h5!$ ?& % &" &h5!$蛋白胨 #C &$7g
%h&5 " %h# & &h# &h!.
初始 A+#C

$h5. . 5 !" h(5 水料比 #C ($7#MZ!4
?&
$%h($ & $(" (h5!$
&>.>."统计分析
""响应面方法的设计(建模和分析通过 R<0 软件
#[!h#%$进行 A?结果与分析 A=C?培养时间对菌株TCB A 产纤维素酶的影响 ""给基础发酵培养基中接入青霉孢子悬浮液 ( MZ#&% 5个7MZ$&混匀后于$5 i条件下持续培养 &. I&每隔$ I取样&测其相对产孢量及比酶活&以确
定后续试验中的培养时间&结果如图 & 所示 由图
& 可知"在接种后的最初$I菌株相对产孢量较低&$& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
为真菌生长迟缓期& 产酶比酶活很低& 仅为
%h!! X74)之后 $j5 I&菌株在固体培养基上迅速繁 殖&进入对数生长期&相应酶活性也有较大提高) 5 I之后菌株)&%$ 产孢量相对稳定&在培养! I后
纤维素酶比酶活达到最高#.h.5 X74$&之后酶活逐 渐下降 因此后续试验中选取培养! I作为菌株发 酵产酶的较佳时间 图 C?培养时间对菌株TCB A 产纤维素酶和 相对产孢量的影响 T.;=C?#70:F127./:3H5F.2/904.2I2/TE510 942I3:F.2/5/I19242;0/01.1271F45./TCBWA A=A?,源对菌株TCB A 产纤维素酶的影响 ""一般认为纤维素酶是一种诱导酶&大多采用含 有纤维素的原料作为 6源*&#+ 为了考察不同植物 纤维原料对菌株)&%$ 产酶的诱导作用&试验选取
* 种植物农药残渣进行 6源筛选&结果见图 $由 图$ 可知"菌株)&% $能够利用各类植物农药残渣 诱导产生纤维素酶&其中以川楝树皮残渣为 6源时 产生的比酶活最高#.h$( X74$因此&以川楝树皮 残渣作为后续试验的6源 3%4分别为巴东醉鱼草(马齿苋(小果博落回( 大花金挖耳(川楝树皮(雷公藤和砂地柏 图 A?不同,源对菌株TCB A 产纤维素酶的影响 T.;=A?#70:F127I.7040/F:54H2/12/ TE510942I3:F.2/271F45./TCBWA A=Q?$源对菌株TCB A 产纤维素酶的影响
$>(>&"不同 ,源对菌株 )&%$ 产纤维素酶的
影响
""以川楝树皮残渣为 6源&分别采用蛋白胨(大
豆胨(牛肉膏(尿素(#,+
.

0-
.
(c,-
(
(,3,-
(
和
,+
.
,-
(
! 种 ,源为供试 ,源&研究其对产酶的影
响&结果见图 ( 由图 ( 可知"菌株 )&% $以有机 氮中的蛋白胨为最佳,源&此时纤维素酶比酶活最 高为.h!! X74&其次为牛肉膏#.h5* X74$和大豆胨
#(h!5 X74$&而利用无机氮时产酶活性相对较低 因此&选择蛋白胨作为后续试验的,源 图 Q?不同$源对菌株TCB A 产纤维素酶的影响
T.;=Q?#70:F127I.7040/F/.F42;0/12/TE510
942I3:F.2/271F45./TCBWA
$>(>$"蛋白胨添加量对菌株)&% $产纤维素酶的 影响 ""在上述6(,源筛选的基础上&进一步对蛋白胨 的用量进行选择&结果见图 . 由图 .可知"随着蛋白 胨含量的逐渐增加&其纤维素酶活性逐渐升高&当蛋 白胨添加量为 &g#质量分数&下同$时纤维素酶比酶
活达到最高#.h. X74$当蛋白胨含量大于$g时&
酶活性逐渐下降&可能是由于,源的浓度过大&促进
了菌丝体生长和养分过早耗尽&以至菌丝体过早衰老
和自溶&而导致酶活性下降 因此&结合产酶活性及
经济原因&选择 &g蛋白胨为较佳浓度
A=R?麦麸添加量对菌株TCB A 产纤维素酶的影响
""麦麸中含有丰富的适合菌株产酶的营养成
分&常被作为生长因子添加于培养基中 因此&考
察麦麸在培养基中的添加比例十分必要#图 #$由图 # 可知"培养基中适量添加麦麸能够促进菌 株 )&%$ 合成纤维素酶&当残渣与麦麸比例为
(k$时&菌株产酶比酶活最高为#h$$X74&但与残 渣麦麸比例 .k&时的产酶活性#.h!! X74$差异性
(&"第 # 期 韩立荣等"青霉)&% $固态发酵植物农药残渣产纤维素酶 图 R?蛋白胨含量对菌株TCB A 产纤维素酶的影响 T.;=R?#70:F127909F2/0:2/F0/F2/TE510 942I3:F.2/271F45./TCBWA 不显著&说明基础培养基中麦麸添加量已足够菌 株的生长和诱导产酶)随着麦麸比例逐渐增加&菌 株产酶活性迅速下降&这可能是由于麦麸比例过 大&造成培养基结块&影响通气和传热&不利于菌 株的生长&从而导致产酶活性下降 因此&在后续 试验培养基中麦麸含量仍维持基础培养基的添加 量&即残渣与麦麸质量比为.k&时&较适合菌株 )&%$产酶
图 @?添加麦麸对菌株TCB A 产纤维素酶的影响
T.;=@?#70:F127K-05FH45/2/TE510
942I3:F.2/271F45./TCBWA
A=@?初始9"对菌株TCB A 产纤维素酶的影响
""将培养基调节为不同初始 A+进行实验&结果见
图 5 由图 5可知"培养基初始 A+在 #h% j*h% 之间
时较适合菌株合成纤维素酶&其中&A+为 5h% 时比酶
活力最高##h(* X74$因此&选择培养基较佳初始 A+为 5h% A=V?培养基含水量对菌株TCB A产纤维素酶的影响 ""基质的含水量是决定固态发酵成功与否的关 键之一 高的含水量可导致多孔性降低(氧扩散受 限制&并增加细菌污染的机会 低含水量则使基质 膨胀程度降低(水张力增高&从而使生长受抑制 图 V?初始9"对菌株TCB A 纤维素酶活性的影响 T.;=V?#70:F127./.F.569"2/TE5105:F.N.FG 27TCBWA 因此&应考虑选择适当的起始含水量#图 *$ 由图
* 可知"当水料比在#$k&$ j#(k&$之间时&酶活力 较高&此时培养基湿润&蓬松分散&基本上无游离 水&因而可以获得较高的酶活性 当水料比大于(k& 时&随着含水量的增加产酶量迅速降低&此时水分 过多&固体培养基聚集成块状&或部分淹没在多余 的游离水中&使得培养基透气性下降&菌丝体生长 不良&因而酶产量也降低 由以上原因&初步确定 较佳的水料比为$k&
图 [?水料比对菌株TCB A 纤维素酶活性的影响
T.;=[?#70:F12745F.2 27126.IF2 6.P3.I2/TE510
5:F.N.FG 27TCBWA
A=[?响应面法优化菌株TCB A 产酶发酵条件
""在单因素试验的基础上&利用二次正交旋转
组合设计&以蛋白胨含量(初始 A+和水料比 ( 个
因素为自变量&以酶活性为响应值设计了三因素
五水平的响应面分析试验&试验设计及结果见
表 $""采用 R<0统计软件对试验结果分析可得如下 回归方程及方差分析表#表 ($
""Bl5h.% o%h&C
&
o%h%!C
$o%h&C ( ?%h&#C$
&
?
%h(C

?&h$&C$
(
o%h&!C
&
C
$?%h%! C & C ( ?%h%.C$
C
(
.& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 A?响应面设计及试验结果
D5H60A?#904.J0/F56I01.;/5/I40136F127F-040192/10
13475:0J0F-2I262;G
试验
编号
因素
C
&
C
$C ( 比酶活7 #X!4 ?&$
& & & & .h(5
$& & ?& .h#* ( & ?& & .h$.
. & ?& ?& (h.
# ?& & & .h%.
5 ?& & ?& (h#*
* ?& ?& & .h$5 ! ?& ?& ?& .h%$
?&h5!& ! % % #h#.
&% &h5!& ! % % 5h(*
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&$% &h5!& ! % .h%$
&( % % ?&h5!& ! $h.& &. % % &h5!& ! (h.# &# % % % 5h#* &5 % % % 5h($
&* % % % 5h&.
&! % % % 5h((
& % % % 5h#% % % % 5h#
""由表 ( 可以看出&回归方程的D值为 *5h#$# 大 于D %h%& #.h.$&说明回归方程在 g的水平上显
著&目标函数#B$与实际情况拟合较好 该模型的 决定系数5$ l%h!# *&说明模型能解释 !h#*g纤
维素酶活力的变化 因此回归方程给菌株 )&% $发酵生产纤维素酶提供了一个合适的模型 从表 ( 还可以看出&该模型的一次项 C & (C ( &二次项 C$
&
(C

和C$( 在 g的概率水平上显著&表明培养基中蛋 白胨含量和水料比的变化与菌株 )&%$ 的纤维素
酶活力有直接关系&蛋白胨和水料比是影响酶活力
的主要限制因子 交互项 C
&
C
$在 #g的概率水平 上显著&说明蛋白胨含量与初始 A+之间的相互作 用对纤维素酶活性有显著性影响 ""响应指标对应于因素 C & (C$
(C
(
水平构成的三
维空间图#图 *$&可以直观地反映各因素对响应值 的影响&从所得响应分析图上可以分析出它们之间 的相互作用 由图 * 可以看出各响应值相对应的因 素水平 本研究通过对各变量与响应值的模拟优 化&得到了最佳的综合因素水平是"蛋白胨 &h.g& 初始 A+5h$ 和水料比为 $k&&此时&可获得最大纤 维素酶比酶活为 5h.* X74 通过青霉 )&%$ 以植
物提取残渣为基质的产酶研究&不仅缓解了环境污
染问题&也证明了植物农药残渣的资源化利用是可
行的
表 Q?模型的回归系数及显著性检验
D5H60Q?U2I06:207.:.0/F101F.J5F0IHG J36F.96016./05440;4011.2/5/I1.;/.7.:5/:02740;4011.2/:207.:.0/F1
误差来源 自由度 平方和 均方 D值 -值
C
&
& %h!!5 * %h!!5 * &!h5% ( %h%%& .
C
$& %h&( ! %h&( !$h! % %h&&. #
C
(
& %h!.$% %h!.$ % &!h%%. % %h%%& *
C
$& & %h#(! ! %h#(! ! &&h#$& . %h%%5 !
C

& $$h%5 ($$ h%5 ( .*&h%& ! %h%%% &
C
$( & (*h5( # (*h5( # !%.h!(# ( %h%%% & C & C$
& %h..5 % %h..5 % h#(* * %h%&& #
C
&
C
(
& %h%!# % %h%!# % &h!&! $%h$%* (
C
$C ( & %h%&* ( %h%&* ( %h(*% ! %h##5 & 回归项 ($h$% # (h#*! ! *5h#$# %h%%% &
剩余项 &% %h.5* * %h%.5 !
失拟项 # %h((# # %h%5* & %h%! .
误差 # %h&($& %h%$5 .
总和 & ($h5**$
"""注"相关系数5l%h$!) 决定系数5$ l%h!# *
#&"第 # 期 韩立荣等"青霉)&% $固态发酵植物农药残渣产纤维素酶 图 [?纤维素酶比酶活响应面图 T.;=[?S0192/1013475:0962F27,U,5105:F.N.FG 27324*5+)*1# Q?结?论 ""本研究通过单因子和响应面试验法获得了菌 株)&%$ 固态发酵产纤维素酶的较佳条件为)#川
楝树皮残渣$")#麦麸$")#蛋白胨$")#c+$
<-
.
$l !%k$%k&h.k%h.(初始 A+5h$(水料比$k&&在此条件
下纤维素酶活力可达5h.* X74&较原始培养条件提
高了 .5h(!g
参考文献"
*&+"+DE4S&Y3M3aC+&PaC930&@B3J>6JDECE4DF34@E@@ELDICE43
;C4;JHGB39J@(1&1
!
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**+"韩立荣&张双玺&祝传书&等>高效纤维素降解菌的筛选和鉴定
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