全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０５􀆰 ００８
收稿日期：２０１３－０５－０４
基金项目：湖南省自然科学省市联合基金（１３ＪＪ９００２）；湖南省研究生科研创新项目（ＣＸ２０１２Ｂ１２４）；湖南省科学技术厅科技计划重点项目
（２０１２ＸＫ４０８１）
作者简介：林福来（１９８７—），男，福建安溪人，硕士研究生，研究方向：生物工程；周洪波（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈｂ＠ ｃｓｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
ＲＴ ＰＣＲ检测毕赤酵母外源 β 甘露聚糖酶
基因拷贝数
林福来１，周洪波１，２，郑　 甲１，郭　 宁１，吴俊子１，吴丽双１
（１􀆰 中南大学 资源加工与生物工程学院，长沙 ４１００８３；
２􀆰 中南大学 生物冶金教育部重点实验室，长沙 ４１００８３）
摘　 要：利用荧光定量 ＰＣＲ方法检测毕赤酵母外源 β 甘露聚糖酶基因（ｍａｎ）拷贝数。 以毕赤酵母中高度保守基
因三磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇａｐ）为内参基因，分别构建含有 ｇａｐ和 ｍａｎ的克隆质粒，进行 ＲＴ ＰＣＲ反应构建 ｇａｐ
和 ｍａｎ双标准曲线；获得的双标准曲线具有良好的重复性，其相关系数（Ｒ２ ）均为 ０􀆰 ９９９，其扩增效率分别为
１０５􀆰 １％和 １０２􀆰 ２％。 提取含有外源 ｍａｎ基因的毕赤酵母基因组进行 ＲＴ ＰＣＲ 检测，通过双标准曲线计算出外源
ｍａｎ基因的拷贝数。 结果显示：预先经过博莱霉素（Ｚｅｏｉｃｎ）抗性筛选得到的 １０株毕赤酵母重组菌株中含有 １、２、３、
４、５和 ７个不等拷贝的 β 甘露聚糖酶基因。 结果表明该方法能够高效快速筛选和鉴定出含有不同外源 β 甘露聚
糖酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株。
关键词：实时荧光定量 ＰＣＲ；毕赤酵母；基因拷贝数；β 甘露聚糖酶
中图分类号：Ｑ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－００４６－０５
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ β⁃ｍａｎｎａｎａｓｅ
ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ
ＬＩＮ Ｆｕｌａｉ１，ＺＨＯＵ Ｈｏｎｇｂｏ１，２， ＺＨＥＮＧ Ｊｉａ１，ＧＵＯ Ｎｉｎｇ１，ＷＵ Ｊｕｎｚｉ１，ＷＵ Ｌｉｓｈｕａｎｇ１
（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８３，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｔａｌｌｕｒｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ β⁃ｍａｎｎａｎａｓｅ ｇｅｎｅ （ｍａｎ） ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ
ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｇａｐ ｇｅｎｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ
ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｇａｐ ａｎｄ Ｍａｎ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇａｐ ａｎｄ ｍａｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂｏｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ （Ｒ２） ｏｆ ０􀆰 ９９９，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｗｅｒｅ １０５􀆰 １％ ａｎｄ １０２􀆰 ２％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍａｎ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ
ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ． Ｔｅｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ Ｚｅｏｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｈａｒｂｏｒｅｄ １，
２，３，４，５ ａｎｄ ７ ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ ｍａｎ． Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｑｕｉｃｋｌｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ⁃ｃｏｐｙ Ｍａｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｍａｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ；ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ；β⁃ｍａｎｎａｎａｓｅ
　 　 外源基因拷贝数的多少对毕赤酵母中外源重
组蛋白的表达有着显著的影响。 研究表明，毕赤酵
母重组菌株中外源基因拷贝数的增加可以有效提
高外源目的蛋白的表达［１－２］。 为了获得高表达重组
菌株和研究外源基因拷贝数对毕赤酵母外源蛋白
表达水平的影响，往往需要进行大量的菌株筛选和
测定外源基因的拷贝数。 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 是运用最多
的检测外源基因拷贝数的传统方法［３］，近年来，多
重扩增探针杂交、比较基因组杂交及芯片杂交技术
也应用于拷贝数的分析［４］，但这些方法都存在费
时、费力、费用昂贵等缺点。 近年来，随着荧光定量
ＰＣＲ技术的成熟，越来越多被应用于外源基因拷贝
数的检测，例如在转基因植物研究领域就已开始应
用［５］。 Ｓｏｎｇ等［６］论证的实时定量 ＰＣＲ 检测数据与
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 的结果一致。 笔者所在课题组的 Ｚｈａｏ
等［７］研究构建了 β 甘露聚糖酶毕赤酵母基因工程
菌，为获得高表达菌株和研究基因拷贝数对该蛋白
表达量的影响。
本研究笔者建立平板筛选法以获得不同 Ｍａｎ
拷贝数菌株和利用荧光定量 ＰＣＲ 方法测定毕赤酵
母重组菌株中外源 β 甘露聚糖酶基因拷贝数，为快
速检测毕赤酵母外源基因拷贝数奠定基础。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种和质粒
带有 β 甘露聚糖酶基因的毕赤酵母转化菌株
及带有 β 甘露聚糖酶基因的标准质粒由笔者所在
实验室构建［７］，ｐＭＤ１９ Ｔ载体及大肠杆菌 ＤＨ ５ａ
购自 ＴａＫａＲａ公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
ＹＰＤ液体培养基（ ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 ２０，酵母粉
１０，葡萄糖 ２０。
１􀆰 １􀆰 ３　 引物设计及合成
根据 ＮＣＢＩ数据库公布的毕赤酵母中的三磷酸
甘油醛脱氢酶（ｇａｐｄｈ）基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ 登录号
Ｕ６２６４８）设计引物 Ｇａｐ Ｆ（ＡＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧ⁃
ＴＣＣ）和 Ｇａｐ Ｒ（ＧＧＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＣ），将扩
增出的产物连接到 ｐＭＤ１９ Ｔ载体后转化大肠杆菌
ＤＨ ５ａ构建 ｇａｐ标准质粒，并根据 ｇａｐｄｈ基因序列
设计 ＲＴ ＰＣＲ 的引物 ＲＴｇａｐ Ｆ（ＴＴＧＴＣＧＧＴＧＴＣＡ⁃
ＡＣＧＡＧＧＡＧ）和 ＲＴｇａｐ Ｒ（ＧＧＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧＣＧ⁃
ＧＴＣ）。 根据毕赤酵母重组菌株中 ｍａｎ 基因序列设
计引物 ＲＴｍａｎ Ｆ（ＡＴＧＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＡＣＴ⁃
ＧＡ）和 ＲＴｍａｎ Ｒ（ＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＣＡＴ）
用于 ＲＴ ＰＣＲ。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 不同拷贝数重组毕赤酵母菌株的初步筛选
从保存于－８０ ℃下的重组毕赤酵母克隆文库
中，挑选出 ６４ 株不同酶活水平的重组菌株并在
ＹＰＤ固体平板上进行划线，２８ ℃恒温培养活化。 培
养 ３ ｄ 后用牙签挑取单菌落分别点种到含有不同
Ｚｅｏｃｉｎ浓度（１００、２００、５００、１ ０００ 和 ２ ０００ μｇ ／ ｍＬ）
的 ＹＰＤ固体平板上，２８ ℃恒温培养 ３ ｄ，长出菌落
后分别从每个不同浓度的 ＹＰＤ Ｚｅｏｃｉｎ平板上挑选 ２
株重组毕赤酵母菌株，共计 １０株用于实时荧光定量
ＰＣＲ检测其 β 甘露聚糖酶基因的拷贝数。
１􀆰 ２􀆰 ２　 含有 ＧＡＰＤＨ基因的标准质粒的构建
以毕赤酵母 Ｘ３３ 菌株的基因组为模板，用 Ｇａｐ
Ｆ和 Ｇａｐ Ｒ 为引物进行普通 ＰＣＲ；切胶回收 ｇａｐ 片
段在 １６ ℃下与克隆载体 ｐＭＤ１９ Ｔ Ｓｉｍｐｌｅ 连接，构
建含 ｇａｐ 基因的标准质粒，转化感受态大肠杆菌
ＤＨ ５ａ［８］，涂布含氨苄西林的 ＬＢ 平板，３７ ℃过夜
倒置培养，次日挑取白色菌落进行菌落 ＰＣＲ 鉴定。
１􀆰 ２􀆰 ３　 重组毕赤酵母的培养和基因组提取
Ｚｅｏｃｉｎ抗性平板上筛选到的 １０ 菌株在 ＹＰＤ 液
体培养基中摇瓶培养 ２４ ｈ（３０ ℃、２５０ ｒ ／ ｍｉｎ）后，达
到菌体生长对数期，然后采用 ＯＭＥＧＡ 公司的
Ｅ􀆰 Ｚ􀆰 Ｎ􀆰 Ａ􀆰 ＴＭ酵母 ＤＮＡ提取试剂盒提取重组毕赤酵
母菌株的基因组。 各重组菌株的基因组 ＤＮＡ 作为
实时荧光定量 ＰＣＲ的检测样品。
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＲＴ ＰＣＲ反应体系和反应条件
反应体系：２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｘ １０ μＬ，ＲＴ Ｆ引物
和 ＲＴ Ｒ引物各 １ μＬ，ＤＮＡ 模板 １􀆰 ０ μＬ，加双蒸水
至总体积 ２０ μＬ。
反应条件：预变性 ９４ ℃ ５ ｍｉｎ，变性 ９４ ℃ ３０ ｓ，
退火 ６０ ℃ ３０ ｓ，延伸 ７２ ℃ ４５ ｓ，共 ４０个循环，溶解
曲线的条件：９５ ℃ １ ｍｉｎ，５５ ℃ １ ｍｉｎ，５５ ℃ １０ ｓ ８０
个循环每循环升高 ０􀆰 ５ ℃。
１􀆰 ２􀆰 ５　 ＲＴ ＰＣＲ双标准曲线的建立
用微量核算定量仪测定提取到的含 ｇａｐ 和 ｍａｎ
基因的质粒质量浓度，根据拷贝数换算公式：拷贝
数＝ ６􀆰 ０２３×１０１４×质粒质量浓度 ／ （６６０×Ｍ），其中：Ｍ
指基因的长度 （ ｂｐ ），将测得的质粒质量浓度
（ｎｇ ／ μＬ）。 用该公式换算成每微升溶液中质粒的拷
贝数。 然后将质粒溶液用双蒸水梯度稀释成 １０４、
７４　 第 ５期 林福来等：ＲＴ ＰＣＲ检测毕赤酵母外源 β 甘露聚糖酶基因拷贝数
１０５、１０６、１０７和 １０８个拷贝 ／ μＬ 的质粒溶液，分别以
１μＬ 各浓度质粒溶液作为模板，分别以 ＲＴｇａｐ
Ｆ ／ ＲＴｇａｐ Ｒ和 ＲＴｍａｎ Ｆ ／ ＲＴｍａｎ Ｒ 为引物进行荧光
定量 ＰＣＲ检测。 进行 ３次独立的质粒提取、浓度检
测和 ＲＴ ＰＣＲ。 以实时荧光定量 ＰＣＲ 仪自带软件
给出的 Ｃ ｔ 值作为纵坐标，起始模板中质粒拷贝数作
为横坐标，建立含 ｇａｐ 和 ｍａｎ 基因质粒的双标准曲
线，用于检测 β 甘露聚糖酶基因的拷贝数。
１􀆰 ２􀆰 ６　 重组毕赤酵母中 ｍａｎ拷贝数的测定
取 １０株不同博莱霉素（Ｚｅｏｃｉｎ）抗性的重组毕
赤酵母菌株基因组 ＤＮＡ １ μＬ为模板，分别以 ＲＴｇａｐ
Ｆ ／ ＲＴｇａｐ Ｒ和 ＲＴｍａｎ Ｆ ／ ＲＴｍａｎ Ｒ 为引物进行实时
荧光定量 ＰＣＲ，每个样品做 ３ 个平行。 将得到的 Ｃ ｔ
值分别代入两条标准曲线中，求出样品中 ｇａｐ 基因
和 ｍａｎ基因的起始模板拷贝数，由于 ｇａｐ 基因在毕
赤酵母中是单拷贝存在［９］，因此 ｍａｎ 基因在毕赤酵
母基因组中的拷贝数 ＝ｍａｎ 基因起始模板拷贝数 ／
ｇａｐ基因起始模板拷贝数。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ｇａｐ和 ｍａｎ基因双标准曲线的建立
使用荧光定量 ＰＣＲ 仪，以 ｇａｐｄｈ 基因作为内参
基因，梯度稀释含 ｇａｐ 和 ｍａｎ 的质粒为模板，建立
ｇａｐ和 ｍａｎ基因的标准曲线。 图 １ 是以基因初始拷
贝数为横坐标，Ｃｔ 值为纵坐标绘制的 ｇａｐ 和 ｍａｎ 基
因的双标准曲线，其相关系数（Ｒ２）均是 ０􀆰 ９９９，其扩
增效率分别为 １０５􀆰 １％和 １０２􀆰 ２％，两者的扩增效率相
近。 ３次重复实验的结果如表 １，２ 条标准曲线的 Ｃｔ
值的标准偏差为 ０􀆰 ０２ ～ ０􀆰 ２３，变异系数为 ０􀆰 ０８％ ～
１􀆰 ９４％，表明建立的双标准曲线具有良好的重复性。
图 １　 ｇａｐ和 ｍａｎ基因的标准曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｇａｐ ａｎｄ ｍａｎ ｇｅｎｅｓ
表 １　 双标准曲线的重复性
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ
ＤＮＡ量
（拷贝数 ／
μＬ）
Ｃｔ 值平均值
１次 ２次 ３次
ｇａｐ ｍａｎ ｇａｐ ｍａｎ ｇａｐ ｍａｎ
标准偏差（ＳＤ） 变异系数（ＣＶ） ／ ％
ｇａｐ ｍａｎ ｇａｐ ｍａｎ
１０４ ２４􀆰 ９３ ２４􀆰 ５４ ２４􀆰 ７２ ２４􀆰 ２３ ２４􀆰 ９９ ２４􀆰 ５６ ０􀆰 １４ ０􀆰 １９ ０􀆰 ５７ ０􀆰 ７６
１０５ ２２􀆰 ０３ ２２􀆰 ２３ ２１􀆰 ９７ ２２􀆰 ２３ ２２􀆰 ３０ ２２􀆰 ２６ ０􀆰 ０４ ０􀆰 ０２ ０􀆰 １９ ０􀆰 ０８
１０６ １７􀆰 ５２ １９􀆰 ６０ １７􀆰 ４４ １９􀆰 ６６ １７􀆰 ２３ １９􀆰 ７８ ０􀆰 １５ ０􀆰 ０８ ０􀆰 ８６ ０􀆰 ４３
１０７ １４􀆰 ４５ １５􀆰 ８９ １４􀆰 ２０ １５􀆰 ７８ １４􀆰 １２ １５􀆰 ９０ ０􀆰 ２３ ０􀆰 ０８ １􀆰 ６３ ０􀆰 ４９
１０８ １０􀆰 ２１ １２􀆰 ２１ ９􀆰 ８７ １２􀆰 ２１ １０􀆰 ２１ １２􀆰 ２４ ０􀆰 ２０ ０􀆰 ０２ １􀆰 ９４ ０􀆰 １４
２􀆰 ２　 荧光定量 ＰＣＲ检测基因拷贝数
２􀆰 ２􀆰 １　 Ｚｅｏｃｉｎ抗性初步筛选不同拷贝数菌株
通常整合到毕赤酵母基因组中重组质粒的拷
贝数越多，重组菌株 Ｚｅｏｃｉｎ 抗性浓度越高，往往利
用不同 Ｚｅｏｃｉｎ 抗性浓度平板筛选不同拷贝数重组
菌株。 考察不同 Ｚｅｏｃｉｎ 抗性质量浓度 （１００、２００、
５００、１ ０００和 ２ ０００ μｇ ／ ｍＬ）的平板初步筛选含不同
ｍａｎ拷贝数的重组菌株，结果如表 ２ 所示。 由表 ２
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
可知：低拷贝菌株在高 Ｚｅｏｃｉｎ 浓度下菌落小甚至不
长出菌落；Ｚｅｏｃｉｎ 浓度越高，长出的菌落越少，说明
高拷贝菌株越少。 以上结果也表明 Ｚｅｏｃｉｎ 平板筛
选是初步筛选不同拷贝数重组菌株的有效手段［１０］。
表 ２　 Ｚｅｏｃｉｎ抗性平板筛选结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
Ｚｅｏｃｉｎ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ρ（Ｚｅｏｃｉｎ） ／
（μｇ·ｍＬ－１） 大菌落数目 小菌落数目 未长出菌落数目
１００ ５０ １４ ０
２００ ４５ １９ ０
５００ １６ ３３ １５
１ ０００ ４ ７ ５３
２ ０００ ２ ２ ６０
２􀆰 ２􀆰 ２　 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测 ｍａｎ拷贝数
ＲＴ ＰＣＲ的原理是利用 ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染料或
者 Ｔａｑｍａｎ探针，实时监测荧光信号的变化，样品的
荧光信号值达到阈值时所用的循环数（Ｃ ｔ 值）与
ＰＣＲ起始模板拷贝数的对数具有线性关系，因此可
以利用构建好的质粒作为标准样品建立标准曲线，
来检测未知样品的起始拷贝数［５］。
图 ２为利用 ＲＴ ＰＣＲ技术检测基因 ｍａｎ 拷贝
数的结果。 由图 ２可知：１０株重组菌的 ｍａｎ 拷贝数
从 １至 ７个不等。 从低 Ｚｅｏｃｉｎ抗性浓度筛选出来的
重组菌其 ｍａｎ的拷贝数较低，从高浓度 Ｚｅｏｃｉｎ 抗性
平板上筛选出来的重组菌其 ｍａｎ 的拷贝数较高，即
高 ｍａｎ拷贝的重组菌株具有高的 Ｚｅｏｃｉｎ 抗性，表明
Ｚｅｏｃｉｎ抗性平板可以初步筛选含不同拷贝数外源基
因的重组菌株。 但是从 ２ ０００ μｇ ／ ｍＬ的抗性平板中
亦筛选到了一株 ３ 拷贝 ｍａｎ 的菌株，也表明 Ｚｅｏｃｉｎ
抗性平板并不能绝对精确地筛选到含相应拷贝数
外源基因的重组菌株［１１］。
图 ２　 ＲＴ ＰＣＲ检测 ｍａｎ拷贝数
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ
本研究中所有样品中的 Ｃ ｔ 值的标准偏差都不
超过 ０􀆰 ３，且从这 １０株菌样品的熔解曲线（图 ３）都
呈现单一的融解峰可以看出这 １０ 个样品中都不存
在非特异性扩增，表明这两对引物特异性好，结果
准确可靠。
图 ３　 样品中 ｍａｎ和 ｇａｐ的融解曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｍａｎ ａｎｄ ｇａｐ
２􀆰 ３　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析基因拷贝数对目的蛋白表
达量的影响
　 　 通过 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 可以直接分析目的蛋白的量
来说明基因剂量对外源重组蛋白表达的影响，结果
如图 ４。 由图 ４ 可知：通过 ＢａｎｄＳｃａｎ ５􀆰 ０ 软件分析
以 ３号泳道的目的蛋白条带为定量的基准，得到 １、
３、４、５和 ７个拷贝重组菌株的 β ｍａｎｎａｎａｓｅ蛋白相
对表达量分别为 ２􀆰 ０１、 ５３􀆰 ２３、 １００􀆰 ００、 １０６􀆰 ５６ 和
１０７􀆰 ８７。 从结果可以看出：当拷贝数≤４ 时，发酵上
清液中的重组目的蛋白的表达量随着基因拷贝数
的增加而显著增加，相对表达量从 １ 个拷贝重组菌
株的 ２􀆰 ０１增加到 ４个拷贝的 １００􀆰 ００；但当拷贝数＞
４之后，发酵上清液中的重组目的蛋白的表达量不
再随着基因拷贝数的增加而增加，而是达到了瓶
颈，大约维持在相对表达量 １００左右的水平。
Ｍ泳道为蛋白 ｍａｋｅｒ；
１～５号泳道分别代表 １，３，４，５，７个拷贝数菌株
图 ４　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析基因剂量对目的蛋白表达的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
９４　 第 ５期 林福来等：ＲＴ ＰＣＲ检测毕赤酵母外源 β 甘露聚糖酶基因拷贝数
３　 结　 论
采用双标准曲线的方法分别构建了内参基因
ｇａｐ和目的基因 ｍａｎ 的标准曲线，在线性范围为
１０４ ～１０８个拷贝 ／ μＬ，其标准曲线的相关系数 Ｒ２ 均
为 ０􀆰 ９９９，具有良好的重复性，而且 ２ 个基因的扩增
效率非常相近，每个样品的 Ｃ ｔ 值的标准偏差均不超
过 ０􀆰 ３，表明标准曲线的结果可靠稳定。 检测的未
知样品通过各自的标准曲线计算得到起始模板量，
目的基因 ｍａｎ 通过内参基因 ｇａｐ 归一化处理得到
目的基因的相对含量。 由于 ｇａｐ基因在毕赤酵母基
因组中以单拷贝形式存在，所以计算得到的 ｍａｎ 基
因拷贝数是在重组毕赤酵母基因组中的绝对拷贝
数。 研究发现外源基因 ｍａｎ 的拷贝数与 Ｚｅｏｃｉｎ 抗
性存在着正相关关系。 本研究利用 ＲＴ ＰＣＲ 技术
对毕赤酵母重组细胞株关于外源 β 甘露聚糖酶基
因拷贝数进行检测，并分析基因拷贝数对目的蛋白
表达量的影响。 该方法稳定灵敏，且相对于传统的
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等方法操作简便，为获得高表达外源蛋
白的毕赤酵母重组菌株提供重要依据。
参考文献：
［ １ ］　 Ｓｕｎｇａ， Ａ Ｊ， Ｃｒｅｇｇ Ｊ Ｍ． Ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ （ ＦＬＤ１ ） ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ［ Ｊ］ ．Ｇｅｎｅ，２００４，３３０：
３９⁃４７．
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８８：ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ
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ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｃ］∥Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．
２０１０．Ｄｏｉ：１０．１００２ ／ ９７８０４７００８９９４１．
［１１］ 　 Ｍａｃａｕｌｅｙ⁃Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓ，Ｆａｚｅｎｄａ Ｍ Ｌ，ＭｃＮｅｉｌ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
［Ｊ］ ．Ｙｅａｓｔ，２００５，２２ （４）：２４９⁃２７０．
（责任编辑　 荀志金）
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷