全 文 ：苯丙氨酸解氨酶（!"#，$%! "# "$ "%）反应机理研究新进展
杨顺楷，杨亚力，杨维力!
（中国科学院 成都生物研究所，成都 &’(()’）
摘 要：根据有关文献阐述了苯丙氨酸解氨酶（!"#，$%)*+*’*,）反应机理研究新进展，主要内容包括两种反应机理
的提出：其一，米切尔加成反应（-./0123 "44.5.67 821/5.67）；其二，傅氏反应（9:.2423;%:1<5= 821/5.67）。通常认为该两种
反应机理较好地解释了 #;!02的氨消除模式，!"#含有的去氢丙氨酸（>?"）单位是反应活性的关键。随着化学和
分子生物学实验证据的提出，主要基于 !"#和 ?"#（组氨酸解氨酶，$%)*+*’*+）具有高度同源性（’@A B C@A序列分
析），及其对“姐妹”酶 ?"#的 D;射线结构分析，发现催化性的亲电试剂并非 >?"，而是 +，,;二氢;,;次甲基;)?;咪唑;
);酮（-EF）。由此，提出一对非芳香 #;!02异构体作探针，以支持这一机理的实验研究。此外，还列出红酵母 !"#逆
向催化合成非天然芳族氨基酸的相关实验结果。
关键词：酶反应机理；苯丙氨酸解氨酶；组氨酸解氨酶；去氢丙氨酸；+，,;二氢;,;次甲基;)?;咪唑;);酮（-EF）
中图分类号：GH’) 文献标识码：" 文章编号：’&IC J +&IH（C(()）() J (((’ J (,
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! 收稿日期：C(();(@;’)
基金项目：江苏常茂生物化学工程股份有限公司部分资助本课题
作者简介：杨顺楷（’@)+;），四川什邡市，研究员，现是加拿大西安大略大学生物系博士研究生，主要研究方向为生物转化及酶法加工。
第 C卷第 )期
C(()年 ’’月
生 物 加 工 过 程
%0.72=2 ^6O:713 6< S.6W:6/2== $7R.722:.7R
L6V_ C(()
· ’ ·
万方数据
!"# $%&’(：!"#$%&’() *!&)’(+" %!),&"(-%；.,!"$/&/&"("! &%%+"(&0/$&-!（123，45678797:）；,(-’(;("! &%%+0
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苯丙氨酸解氨酶（123，45678797:）是仅存在于
植物和部分微生物体内的酶类，它是催化 30苯丙氨
酸（301,!）经由非氧化脱氨反应，生成反式0肉桂酸
（’052）和氨的关键酶，是苯丙烷代谢的首步反应。
由此进入苯丙烷代谢途径，可以生成香豆酸、阿魏
酸、芥子酸等中间产物；这些化合物进一步可转化为
香豆素、绿原酸，也可以形成苯丙烷酸 5+2酯，再进
一步代谢转化为一系列苯丙素类化合物，如黄酮体、
木质素、生物碱等。总之，’052 是这类苯丙素的前
体物质，在代谢途径上，近年已重新将这一莽草酸代
谢途径更名为 ’052代谢途径，以限定生物合成途径
上仅由 ’052而来的苯丙素类化合物。因而 123是
联系初级代谢和次级代谢的关键酶，它能将芳香化
合物中的碳转向苯丙烷代谢物的合成（图 9）。这类
物质按功能分类为染料、AB0吸收色素或化学信号
传递体。
图 9 植物 123的定位
C(D79 3+)&’(+" +E 123 (" ./&"’-
近年，植物细胞内信号转导因子能有效诱导次
生代谢物合成，因而 123与信号转导因子的关系成
为了人们研究的热点［9］。另外，由于 123在植物苯
丙烷代谢中与植物抗性应激反应密切相关，例如当
植物在逆境胁迫条件下，激活苯丙烷代谢，123活性
迅速上升，它已作为植株抗逆能力的一个重要生理
指标。123受多种环境因素的诱导，如创伤、紫外
线、诱导子等［F］。此外，过去 FG年来，国内外对微生
物（如红酵母，!"#$#%#&’()）123 逆向生物催化 ’052
和氨生产 301,!的生物技术途径的研究与开发，主
要用于满足低能甜味剂阿斯巴甜的生产原料的需
求，以及 123应用于临床医学苯丙酮尿症（1HA）的
治疗需求等［8 I :］，所有这些，都给生命化学在 123
的理论研究上提出了新课题，这就促进了 123反应
机理研究的进展。本文将就 123 反应机理研究新
进展报告如下［J，K，99］。
) 早期的 123生物催化机理研究及其发展
9LJ9年 H+MN+/和 5+""在高等植物，9LJJ年 @0
· F · 生物加工过程 第 F卷第 6期
万方数据
!"#"在微生物首次发现 $%&以来，该酶引起了人们
极大的兴趣。$%&酶学知识告诉人们，它是由 ’ 个
亚基组成的酸性蛋白，多数有均一亚基，()为 ** +
,,-."范围；$%&是诱导酶，稳定性差，很娇嫩等。
/0/ 米切尔加成反应（(123"45 %661#178）
/9:;年 <"8=78和 <">1)提出去氢丙氨酸（.<%）
是 $%&的活性中心，它经由化学和突变研究证据所
支持（图 ?）。现在已经把一个丝氨酸（@4)）残基鉴定
为前体物质，即转译后转换为 .<%。他们也提出了
$%&反应机理方案，关键步骤是 &A$34 的氨基经由
米切尔（(123"45）加成到 .<%的!A位。可以推断，这
增强了氨基的离去能力，/，B C氢位移和由酶碱基脱
除一个苄基质子，然后导致生成 #AD%［E］。
图 ? <"8=78和 <">1)提出的 $%&反应机理
F1!G? (423"81=H 7I #34 $%& J4"2#178 "227)618! #7 <"8=78 "86 <">1)
/0? 傅氏反应（F)14646AD)"I#= J4"2#178）
@23K=#4)和 J4#4L借助在 $%&失活条件下，观察
转化 ’ C硝基 C & C $34提供的实验证据，反驳了前
述机理。失活经由硼氢化钠还原 .<%辅基或由点
突变（@4) ?;? #7 %5" ?;?）进行［9］。他们得出结论：对
位的硝基可以取代亲电性的辅基。由此，@23K=#4)和
J4#4L观察到了 .<%残基在活化 &A$34的!C位质
子，经由酶催化碱基方式有助于除去质子方面的作
用，从而稳定造成的负碳离子。
基于这种考虑，提出了第二种 $%& 的反应机
理，即辅基 .<%以傅氏（F)14646AD)"I#=）反应方式，攻
击 &A$34芳环邻位，造成碳正离子，使!A位质子被酸
化，从而有助于由酶催化碱基的去除作用。在氨的
前A@A质子消除作用去除后，该环再度芳构化，并重
新产生辅基（图 B）。可见，此处的 .<%是一种活化
了的烯烃。据此可以推断在原生酶反应中，间位A酪
氨酸的反应活性高于 $34。但是在 $%&酶法合成反
应体系中，对A氟A&A$34 能被制备，或者说它是一个
良好底物，没有氟的丢失。结合对若干邻位A和间位
A苯环取代基肉桂酸衍生物作为底物的耐受性考察，
结果提示傅氏反应机理是不可操作的。对位取代底
物在利用 $%& 突变体情况下，在取代集团较小，例
如氟、氯代情况下是可耐受的。部分这些研究工作
正致力于增高这种耐受性，虽然这被认为是底物的
空间结构问题。的确，当底物存在芳香基团，且三碳
侧链上有羧基结构，底物化学结构电子影响也是重
要的［E，/?］。
/0B 我们的实验研究证据
近年我们实验室也开展了经由红酵母 $%& 酶
法合成制备 &A$34结构类似物的研究，部分实验结
果如下（表 /）。
?;;’年 //月 杨顺楷等：苯丙氨酸解氨酶（$%&，MD’0B0/0*）反应机理研究新进展 · B ·
万方数据
图 ! "#$%&’()和 *+’(,提出的 -./作用机理
0123! 4(#$561&7 89 5#’186 89 -./ 5& :)8:8&(; <, "#$%&’() 56; *+’(,
表 = 部分经由红酵母 -./酶法合成制备 />-$(类似物实验
结果
?5<@( = -5)’ 89 ’$( (A:()17(6’5@ )(&%@’& 89 <18#86B()&186 89 5),@5>
#,@1# 5#1; ’8 %665’%)5@ />-$(6,@5@5616( ;()1B5’1B(& B15 ’$(
(6C,7( -./ 89 !"#$#%#&’()
底物 产物 产率 D E
邻>氯肉桂酸
8>F$@8)8#166571# 5#1;
邻>氯 />-$(
8>F@>/>-$(
GH
间>氯肉桂酸
7>F$@8)8#166571# 5#1;
间>氯 />-$(
7>F@>/>-$(
IJ
对>氯肉桂酸
:>F$@8)8#166571# 5#1;
对>氯 />-$(
:>F@>/>-$(
JK
邻>硝基>肉桂酸
8>L1’)8#166571# 5#1;
邻>硝基>/>-$(
8>L1’)8>/>-$(
JM
间>硝基>肉桂酸
7>L1’)8#166571# 5#1;
间>硝基>/>-$(
7>L1’)8>/>-$(
=K
对>硝基>肉桂酸
:>L1’)8#166571# 5#1;
对>硝基>/>-$(
:>L1’)8>/>-$(
=K
邻>羟基>肉桂酸
8>N,;)8A,#166571# 5#1;
邻>羟基>/>-$(
8>N,;)8A,>/>-$(
MO
间>羟基>肉桂酸
7>N,;)8A,#166571# 5#1;
间>羟基>/>-$(
7>N,;)8A,>/>-$(
J=
对>羟基>肉桂酸
:>N,;)8A,#166571# 5#1;
对>羟基>/>-$(
:>N,;)8A,>/>-$(
J=
可以看出，底物 ’>F.的邻位>、间位>和对位>在
以氯代、硝基取代、羟基取代时，均能合成制备 />-$(
相应的结构类似物，其中以邻位取代物的产率最高，
间位>和对位>取代次之，例如邻>氯>/>-$(可达 GHE，
邻>羟基>/>-$( 为 MOE，邻>硝基>/>-$( 为 JME。这
些实验数据资料显然对 -./反应机理理论研究和
建立 -./酶法手性合成非天然 />-$(结构类似物技
术体系具有重要学术和应用价值［=J P =O］。
! -./和 N./（组氨酸酶 QF "#$#$#%）的生
物化学［$&］和分子生物学研究推动该酶反应
机理研究的新进展
-./和 N./具有高度同源性（=RE P JKE部分
序列测定），但以前仅知，从动物发现的 N./，同 -./
一样仍存在有罕见 SN.。迄今为止，仅了解到 SN.
存在于这两种酶中。这样可以得出结论：两种酶的
活性中心的核心部分具有相同的结构。通过 -./
的“姐妹”酶 N./的 T>射线结构分析，发现催化性的
亲电试剂并非 SN.，而是 !，O>二氢>O>次甲基>IN>咪
唑>I>酮（4UV），它是经由内三肽 .@5>"()>W@, 借助环
化作用和消除两分子水而生成的（图 I）［H，R］。这种
修饰作用可解释为借助阻止氮的孤电子对离域作用
进入 J，!>不饱和羰基体系，从而增高辅基的亲电性。
图 I N./中去氢丙氨酸的修饰作用：!，O>二氢>O>次甲基>
IN>咪唑>I>酮（4UV）
012X I 48;191#5’186 89 ;($,;)85@5616( 16 N./：!，O>;1$,;)8>O>
7(’$,@1;(6(>IN>171;5C8@>I>86(
· I · 生物加工过程 第 J卷第 I期
万方数据
为了进一步提供支持这一机理的证据，设计了两
个不同的非芳香 !"#$%相关衍生物作为有用的探针。
其一，&，’"二氢"!"#$%［("（)，*"环己二烯酰）"!"丙氨酸］；
另一个则是 )，*"二氢"!"#$%［("（&，’"环己二烯酰）"!"丙
氨酸］。拟将这种 &，’"二氢异构体作为底物，亲电攻击
则产生一个靠近侧链的碳正离子；这样，!"位质子比较
易于变成酸性，可由酶促碱基除去（图 ’）［+］。
图 ’ &，’"二氢"!"苯丙氨酸的 #,!反应过程
-./0’ 12345% 26 7$% #,! 4%897.2: ;.7$ &，’"<.$=<42"!">$%:=?8?8"
:.:%
如果在 )，*"二氢异构体情况下，也可能发生一
种亲电攻击。但是产生的正电荷并不靠近侧链定
位，!"位质子仍保持非酸性；那么则不触发裂合酶反
应（图 @）［+］。如果这种预测结果是正确的，将会对
新近提出的机理提供进一步的证据。
图 @ )，*"二氢"!"苯丙氨酸的 #,!反应过程
-./0@ 12345% 26 7$% #,! 4%897.2: ;.7$ )，*"<.$=<42"!">$%:=?8?8"
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