全 文 ：苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用∗
董春娟　 李　 亮　 曹　 宁　 尚庆茂∗∗　 张志刚
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ／农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室， 北京 １０００８１）
摘　 要　 为了探讨苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用，采用喷施特异抑
制剂（ＡＯＰＰ）的方法控制 ＰＡＬ活性，测定幼苗抗寒性的变化．结果表明： 低温可以诱导黄瓜幼
苗叶片中 ＰＡＬ的基因表达和活性升高；喷施 ＡＯＰＰ 显著抑制了叶片中 ＰＡＬ活性，减少了酚类
和类黄酮物质的积累．低温对黄瓜幼苗造成显著伤害，ＡＯＰＰ 预处理加剧了低温对幼苗的损
伤，幼苗抗寒性降低．与对照相比，幼苗叶片中相对电解质渗漏率和丙二醛（ＭＤＡ）含量显著升
高，ＰＳＩＩ最大光化学效率（Ｆｖ ／ Ｆｍ）降低，光化学猝灭参数 Ｙ（ＮＯ）升高，胁迫相关基因（ＰＲ１⁃１ａ、
ＣＯＲ４７、Ｐ５ＣＳ、ＨＳＰ７０）的诱导表达受到抑制．低温导致黄瓜幼苗叶片中 Ｈ２Ｏ２积累，还原型抗坏
血酸（ＡｓＡ）含量降低，脱氢抗坏血酸（ＤＨＡ）含量升高，ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ减小；喷施 ＡＯＰＰ 的幼苗中
抗氧化酶（过氧化氢酶 ＣＡＴ、抗坏血酸过氧化物酶 ＡＰＸ）活性显著低于对照，Ｈ２Ｏ２过量积累，
ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ更低．施用 Ｈ２Ｏ２清除剂可以有效缓解喷施 ＡＯＰＰ 引起的低温损伤加剧，而施用
ＣＡＴ抑制剂的幼苗对低温胁迫更敏感．表明低温诱导了 ＰＡＬ 活性升高，促进了苯丙烷类次生
代谢产物的合成，提高了胞内抗氧化酶活性，可有效清除活性氧分子，维持 ＡｓＡ 氧化还原状
态，缓解低温引起的光损伤和氧化损伤．
关键词　 黄瓜； 苯丙氨酸解氨酶； 抑制剂； 低温胁迫； 抗性
∗国家自然科学基金项目（３１１０１５４８）、现代农业产业技术体系建设专项（ＣＡＲＳ⁃２５）和公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３０１４）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｓｈａｎｇｑｉｎｇｍａｏ＠ ｃａａｓ．ｃｎ
２０１４⁃０７⁃１５收稿，２０１５⁃０５⁃２０接受．
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）０７－２０４１－０９　 中图分类号　 Ｓ１５２．７， Ｓ５１２．１　 文献标识码　 Ａ
Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ ｉｎ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．
ＤＯＮＧ Ｃｈｕｎ⁃ｊｕａｎ， ＬＩ Ｌｉａｎｇ， ＣＡＯ Ｎｉｎｇ， ＳＨＡＮＧ Ｑｉｎｇ⁃ｍａｏ， ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ⁃ｇａｎｇ （ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｇｅ⁃
ｔａｂｌｅｓ ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ／ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｒｏｐｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐ⁃
ｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（７）： ２０４１－２０４９．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ （ＰＡＬ） ｉｎ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＡＬ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＡＯＰＰ） ｗａｓ ｓｐｒａｙｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＡＬ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ＡＯＰＰ ｓｈｏｗｅｄ ｌｏｗｅｒ ＰＡＬ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｌｅｓｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ． Ｌｏｗ ｔｅｍ⁃
ｐｅｒａｔｕｒｅ ｃａｕｓｅｄ ｄａｍａｇｅｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ａｎｄ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＡＯＰＰ ａｇｇｒａｖａｔｅｄ ｔｈｅｓｅ ｄａｍａ⁃
ｇｅｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡＯＰＰ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｌａ⁃
ｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｌｅａｋａｇｅ ａｎｄ ＭＤＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｌｏｗｅｒ ｍａｘｉｍｕｍ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＰＳＩＩ
（Ｆｖ ／ Ｆｍ） ｂｕｔ ｈｉｇｈｅｒ ｐｈｏｔｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｙ（ＮＯ）， ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ⁃ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｓ （ＰＲ１⁃１ａ， ＣＯＲ４７， Ｐ５ＣＳ ａｎｄ ＨＳＰ７０）． Ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ２Ｏ２， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ａｓｃｏｂａｔｅ （ＡｓＡ） ｂｕｔ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｂａｔｅ （ＤＨＡ）， ａｎｄ ｔｈｕｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＡｓＡ：ＤＨＡ． Ｉｎ
ｔｈｅ ＡＯＰＰ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ （ＣＡＴ ａｎｄ ＡＰＸ） ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉ⁃
ｃａｎｔｌｙ ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ， ａｎｄ ｅｘｃｅｓｓ Ｈ２Ｏ２ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＡｓＡ：ＤＨＡ ｗａｓ ａｌｓｏ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｃｏ⁃ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ ｔｈｅ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄ
ｄａｍａｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＡＯＰＰ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ｗｈｉｌｅ ｃｏ⁃ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＡＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍａｄｅ ｔｈｅ ｓｅｅｄ⁃
ｌｉｎｇｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 ７月　 第 ２６卷　 第 ７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌ． ２０１５， ２６（７）： ２０４１－２０４９
ｓｔｒｅｓｓ， ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＡＬ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｃｏｍ⁃
ｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｓｃａｖｅｎｇｅ ｔｈｅ ｅｘｃｅｓｓ ＲＯＳ ａｎｄ
ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｄｏｘ ｓｔａｔｕｓ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅｂｙ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏ⁃ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｕｃｕｍｂｅｒ； ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ （ＰＡＬ）； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ； ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ；
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．
　 　 低温是限制作物生长和物种分布的一个重要环
境因子．低温可破坏细胞膜结构，导致植物光合作用
受阻、胞内电解质渗漏、产生毒性物质和活性氧（ｒｅ⁃
ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）等，最终导致植物生长停
滞甚至死亡［１］ ．植物通过调节自身一系列的代谢反
应对低温胁迫作出适应性响应，维持细胞膜稳定性
和胞内渗透平衡，激活抗坏血酸过氧化物酶
（ＡＰＸ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）等抗氧化酶类，积累抗
坏血酸（ＡｓＡ）、还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）等抗氧化物
质，清除胞内 ＲＯＳ，保护细胞免受伤害［２］ ．植物为应
对低温逆境还逐渐演化形成了多种次生代谢途径，
并生成相应的次生代谢产物以缓解逆境胁迫．苯丙
烷类代谢途径是植物次生物质代谢的一条重要途
径，其中间产物，如香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等，及其
进一步转化生成的物质，如木质素、花青素及类黄酮
等，在植物的生长发育、着色及对生物和非生物胁迫
逆境的抗性等生理活动中具有重要作用［３－４］ ．
苯丙氨酸解氨酶（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ，
ＰＡＬ）催化 Ｌ⁃苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是苯丙
烷类次生代谢途径的限速酶和关键酶［４］ ．早期对
ＰＡＬ的研究主要集中于其与植物抗病性关系的研
究．小麦、烟草、黄瓜等植物感染病原菌后，ＰＡＬ活性
升高，同时在侵染部位积累酚类、异黄酮类和木质素
等次生代谢产物［３，５］；且对于不同抗病性的小麦和
烟草，在接种病原菌后，抗病品种中 ＰＡＬ 活性峰较
感病品种高，持续时间长，植株中总酚含量和类黄酮
含量显著高于感病品种［３，６］ ．随后的研究发现，ＰＡＬ
与植物的非生物逆境抗性密切相关．植物在遭受机
械伤害［７－８］、干旱［９－１０］、低温［７，１０－１１］、高温［１２］等逆境
时，ＰＡＬ 活性升高，同时体内积累大量酚酸、类黄
酮、木质素等苯丙烷类代谢产物．Ｐｉｅｔｒｉｎｉ等［１３］发现，
低温处理可以显著提高玉米幼苗中 ＰＡＬ的活性，幼
苗向光面的叶片中积累大量的花色素苷． Ｌｅｙｖａ
等［１４］研究表明，拟南芥幼苗经 ４ ℃低温处理后，叶
片中 ＰＡＬ和查尔酮合成酶（ＣＨＳ）活性迅速升高，花
青素大量合成，幼苗表现出耐冷性．类似的结果在红
叶芥中也有报道［１５］ ．
黄瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）是我国主栽蔬菜作物之
一，其生长过程对低温极为敏感．通常 １０ ～ １２ ℃以
下的低温会引起植株生理活动失调，生长缓慢，发育
停止，温度低于 ５ ℃时植株难以生存［１６－１７］ ．研究发
现，黄瓜中存在至少 ７ 个 ＰＡＬ 基因，低温可以诱导
黄瓜幼苗中多个 ＰＡＬ基因的表达［１８］ ．本研究以黄瓜
幼苗为材料，采用 ＰＡＬ 的竞争性抑制剂———Ｌ⁃２⁃氨
基氧⁃３⁃苯基丙酸（ＡＯＰＰ） ［１９－２０］控制幼苗中 ＰＡＬ 的
活性，通过比较低温条件下幼苗膜脂过氧化水平、光
合荧光参数、胁迫相关基因的表达水平以及细胞抗
氧化能力等方面的指标，明确 ＰＡＬ在诱导黄瓜幼苗
抗寒性中的作用，进而探讨 ＰＡＬ在植物低温抗性反
应中的作用机理．
１　 材料与方法
１􀆰 １　 黄瓜材料的培养与处理
供试黄瓜品种为‘中农 ２０３’，购自中国农业科
学院蔬菜花卉研究所，该品种为密刺型、强雌性早熟
品种，是我国北方地区主栽黄瓜品种，为低温较敏感
型［２１］ ．试验于 ２０１３年 ４—５ 月在中国农业科学院蔬
菜花卉研究所玻璃连栋温室进行，挑选籽粒饱满的
黄瓜种子，用 ５％次氯酸钠消毒 １０ ｍｉｎ，清水冲洗 ５
遍后，播种于育苗基质（蛭石 ∶ 珍珠岩＝ １ ∶ １，Ｖ ／ Ｖ）
中．待幼苗子叶平展时，选取长势一致的幼苗移入塑
料盒（４０ ｃｍ×２５ ｃｍ×１０ ｃｍ）中，在植物培养箱中进
行营养液培养，营养液选用 １ ／ ２ Ｈｏａｇｌａｎｄ 营养液
（ｐＨ ６．５），培养条件为：昼夜温度为 ２８ ℃ ／ １８ ℃，光
周期为 １０ ｈ ／ １４ ｈ，光照强度为 ６００ μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１，
相对湿度为 ８０％～８５％．
当黄瓜幼苗培养至一叶一心时进行如下处理：
１）对照处理（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：对幼苗叶面喷施去离子水
（含 ０．１％ Ｔｗｅｅｎ⁃２０），每株幼苗每次喷施量为 １ ｍＬ，
共喷施 ３ 次，预处理 ２４ ｈ 后进行低温胁迫处理；２）
ＡＯＰＰ 处理（ＡＯＰＰ）：用 １００ μｍｏｌ·Ｌ－１ ＡＯＰＰ 水溶
液代替去离子水，对幼苗进行喷施，其余同对照处
理；３）ＡＯＰＰ 与 ＤＭＴＵ复合处理（ＡＯＰＰ＋ＤＭＴＵ）：对
喷施 ＡＯＰＰ 的幼苗在低温处理前 ２ ｈ，叶面喷施 ＤＭ⁃
２４０２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
ＴＵ（５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１），每株幼苗喷施 １ ｍＬ，２ ｈ 后进行
低温处理；４）３⁃ＡＴ 处理（３⁃ＡＴ）：对照处理的幼苗在
低温处理前 ２ ｈ，叶面喷施 ３⁃ＡＴ（５０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１），每
株幼苗喷施 １ ｍＬ，２ ｈ后进行低温处理；５）ＡＯＰＰ 与
３⁃ＡＴ复合处理（ＡＯＰＰ ＋３⁃ＡＴ）：对喷施 ＡＯＰＰ 的幼
苗在低温处理前 ２ ｈ，叶面喷施 ５０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ３⁃ＡＴ，
其余同处理（４）．低温胁迫处理条件为：温度 １０ ℃，
光照强度 ２００ μｍｏｌ·ｍ－２ ·ｓ－１，相对湿度 ５０％ ～
６０％．于低温处理的不同时间点取样，进行各项指标
的测定．
１􀆰 ２　 生理指标及测定方法
Ｈ２Ｏ２的测定参考 Ｋａｗａｉ⁃Ｙａｍａｄａ 等［２２］的方法．
称取 ０．０５ ｇ黄瓜叶片，加入 ３ ｍＬ 磷酸钠缓冲液（５０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１， ｐＨ ６． ５）在冰浴中研磨成匀浆， ４ ℃
１２０００ ×ｇ离心 １０ ｍｉｎ．取上清液 ２ ｍＬ 与 １ ｍＬ 硫酸
钛溶液（溶于 ２０％硫酸中）混合，震荡混匀后，室温
６０００ ×ｇ离心 １５ ｍｉｎ，将所得的上清液在 ４１０ ｎｍ 比
色．通过制作 Ｈ２Ｏ２标准曲线计算样品中 Ｈ２Ｏ２的含
量（μｍｏｌ·ｇ－１ＦＭ）．
抗坏血酸含量的测定参照张国斌等［２３］的方法．
用还原型抗坏血酸（ＡｓＡ）做标准曲线，通过标准曲
线计算样品中 ＡｓＡ 的含量（μｍｏｌ·ｇ－１ＦＭ）．脱氢抗
坏血酸（ＤＨＡ）的含量为总抗坏血酸含量与 ＡｓＡ 含
量的差值．
叶片中总酚的提取和测定参照 Ｍｅｙｅｒｓ 等［２４］的
方法．以没食子酸（ＧＡ，生工）作总酚含量的标准曲
线，并计算样品中总酚的含量（ｍｇ ＧＡ·ｇ－１ＦＭ）．类
黄酮的含量测定参照 Ｊｉａ 等［２５］的方法，以芦丁（生
工）为标样，类黄酮含量表示为 ｎｍｏｌ ｒｕｔｉｎ·ｇ－１ＦＭ．
电解质渗漏率的测定参照李合生［２６］的方法；丙二醛
（ＭＤＡ）含量采用硫代巴比妥酸比色法［２７］测定．
叶绿素荧光参数采用饱和脉冲分析法（ Ｊｕｎｉｏｒ⁃
ＰＡＭ，Ｗａｌｚ，德国）测定，测定过程和计算方法参照
李亮等［２７］的方法．
１􀆰 ３　 酶活性测定
ＰＡＬ活性测定参照 Ｓｈａｎｇ 等［１８］的方法．抗氧化
酶 ＡＰＸ和 ＣＡＴ 活性测定：称取 ０．３ ｇ 黄瓜叶片，加
入 ５ ｍＬ 提取缓冲液（５０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１磷酸钠缓冲液，
ｐＨ ７．８、０．１ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＥＤＴＡ、５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１抗坏血
酸、１％ ＰＶＰ⁃４０），冰浴研磨，匀浆转移至干净离心管
中，４ ℃下 １００００ ×ｇ 离心 １０ ｍｉｎ，取上清液用于
ＡＰＸ和 ＣＡＴ［２７］活性测定，测定方法参照 Ｘｉａ 等［２８］
的方法．提取液中蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法
（ＢｉｏＲａｄ，美国） ［２９］测定．
１􀆰 ４　 基因转录水平测定
黄瓜叶片中总 ＲＮＡ 采用 ＴＲＩｚｏｌ 试剂（ Ｉｎｖｉｔｒｏ⁃
ｇｅｎ）提取，以 Ｏｌｉｇｏ ｄＴ 为引物，使用 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ⁃
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，美国）进行反转录和ｃＤＮＡ
第一链的合成．所得 ｃＤＮＡ 用于 Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ 定量
分析，试剂盒为 Ｔｒａｎｓｓｔａｒｔ Ｔｏｐ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（全式
金），仪器为 ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱＴＭ５（ＢｉｏＲａｄ，美国）．以持家基
因 Ａｃｔｉｎ作为 Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ 反应的内参，ＰＣＲ 反应
所需的引物如表 １ 所示．待测基因的相对表达水平
采用 ΔΔＣＴ法计算［２７］ ．每组样品做 ３次重复．
１􀆰 ５　 数据处理
试验结果用 ３次重复的平均值±标准误（ｍｅａｎ±
ＳＤ）表示，采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ 软件处理数据和作
图，用 ＤＰＳ ２０００ 软件对数据进行方差分析，运用
Ｄｕｎｃａｎ新复极差法进行差异显著性（Ｐ＜０．０５）检验．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 低温胁迫下黄瓜幼苗中 ＰＡＬ活性和基因表达
水平的变化
由图 １可知，１０ ℃低温可以诱导黄瓜幼苗叶片
表 １　 Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ反应引物序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ＰＣＲ
基因
Ｇｅｎｅ
ＩＣｕＧＩ 基因序列号∗
ＩＣｕＧＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．∗
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
苯丙氨酸解氨酶
Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ （ＰＡＬ）
Ｃｓａ６Ｍ４４６２９０ ＰＡＬ⁃Ｆ： ５′⁃ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧ⁃３′
ＰＡＬ⁃Ｒ： ５′⁃ＡＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧ⁃３′
病程相关蛋白 １⁃１ａ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ⁃ｒｅｌａｔｅｄ １⁃１ａ （ＰＲ１⁃１ａ）
ＤＱ６４１１２２ ∗∗ ＰＲ⁃Ｆ： ５′⁃ＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＡＣ⁃３′
ＰＲ⁃Ｒ： ５′⁃ＴＣＡＡＴＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧ⁃３′
冷相关基因 ４７
Ｃｏｌｄ⁃ｒｅｌａｔｅｄ ４７ （ＣＯＲ４７）
Ｃｓａ６Ｍ３５８７１０ ＣＯＲ⁃Ｆ： ５′⁃ＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＡ⁃３′
ＣＯＲ⁃Ｒ： ５′⁃ＧＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＡＧＧ⁃３′
吡咯啉⁃５⁃羧酸合成酶
Ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ⁃５⁃ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ （Ｐ５ＣＳ）
Ｃｓａ３Ｍ７３３９２０ Ｐ５ＣＳ⁃Ｆ： ５′⁃ＣＴＣＣＡＴＡＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧ⁃３′
Ｐ５ＣＳ⁃Ｒ： ５′⁃ＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＣＡＧＣ⁃３′
热激蛋白 ７０
Ｈｅａｔ⁃ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （ＨＳＰ７０）
Ｃｓａ５Ｍ１４９３３０ ＨＳＰ⁃Ｆ： ５′⁃ＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣ⁃３′
ＨＳＰ⁃Ｒ： ５′⁃ＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧ⁃３′
肌动蛋白 Ａｃｔｉｎ Ｃｓａ６Ｍ４８４６００ Ａｃｔ⁃Ｆ： ５′⁃ＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴ⁃３′
Ａｃｔ⁃Ｒ： ５′⁃ＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡＧＴＣＴＣＧＡＧ⁃３′
∗ＩＣｕＧＩ： 葫芦科植物基因组数据库 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｕｃｕｒｂｉｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ， ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｉｃｕｇｉ．ｏｒｇ ／ ∗∗该基因序列号来自 ＮＣＢＩ数据库 Ｎａｔｉｏｎ⁃
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ／
３４０２７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 董春娟等： 苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用　 　 　 　 　
图 １　 低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中 ＰＡＬ 活性和 ＰＡＬ 基因表
达水平的变化
Ｆｉｇ． １ 　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ
ＰＡＬ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ．
不同小写字母表示不同处理间差异显著（Ｐ＜０．０５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ⁃
ｄｉｃａｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｔ ０． ０５ ｌｅｖｅｌ． 下同 Ｔｈｅ
ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
中 ＰＡＬ活性升高，而在常温（２８ ℃ ／ １８ ℃）培养条件
下，ＰＡＬ活性没有显著差异．与对照相比，在低温处
理 ２４和 ４８ ｈ时，ＰＡＬ活性分别升高了 ３．１７ 和 ３．６２
倍，之后随着低温处理时间的延长，ＰＡＬ 活性有所
降低，至 １２０ ｈ 时，ＰＡＬ 活性为对照的 ２．９２ 倍．低温
可以显著诱导黄瓜幼苗叶片中 ＰＡＬ 基因的表达．随
着低温处理时间的延长，ＰＡＬ 表达水平逐渐升高，至
４８ ｈ时，表达水平最高，是未经低温处理幼苗的 ５．１０
倍，之后，ＰＡＬ表达水平略有降低，ＰＡＬ 基因表达水平
的变化趋势与 ＰＡＬ活性基本一致．表明低温可以诱导
黄瓜幼苗中 ＰＡＬ基因的表达，从而提高 ＰＡＬ活性．
２􀆰 ２　 抑制剂预处理对黄瓜幼苗 ＰＡＬ活性及总酚和
类黄酮含量的影响
由图 ２ 可知，喷施 ＡＯＰＰ 的黄瓜幼苗叶片中
ＰＡＬ活性在常温（２８ ℃ ／ １８ ℃）和低温（１０ ℃）条件
下均被显著抑制，仅为对照 ＰＡＬ 活性的 ３５％．表明
喷施抑制剂 ＡＯＰＰ 可以显著抑制 ＰＡＬ 的活性．低温
可以促进黄瓜幼苗叶片中总酚和类黄酮的积累，
ＡＯＰＰ 预处理后，幼苗叶片中总酚和类黄酮的积累
受到抑制．常温条件下，总酚和类黄酮含量分别为对
照的 ８０．６％和 ７９．７％；低温处理 ７２ ｈ时，总酚和类黄
酮含量只有对照的 ７０．６％和 ６５．８％．
２􀆰 ３　 ＰＡＬ抑制剂预处理对黄瓜幼苗抗寒性的影响
１０ ℃低温处理 ７２ ｈ会对黄瓜幼苗造成损伤，表
现为幼苗叶片中电解质渗漏率和 ＭＤＡ 含量显著升
高，Ｆｖ ／ Ｆｍ显著降低，光损伤参数 Ｙ（ＮＯ）显著升高
（图 ３）．与对照相比，喷施 ＡＯＰＰ 黄瓜幼苗的受损伤
程度加剧，电解质渗漏率和 ＭＤＡ 含量显著大于对
照幼苗， Ｆｖ ／ Ｆｍ的降低幅度更大，为对照植株的
８６􀆰 ２％，Ｙ（ＮＯ）显著高于对照植株（图 ３），这些结果
表明，ＡＯＰＰ 预处理的黄瓜幼苗对低温胁迫的抗性
降低，对低温更加敏感．
２􀆰 ４　 ＰＡＬ抑制剂预处理对低温胁迫下黄瓜幼苗相
关基因表达的影响
如图 ４所示，低温可以诱导胁迫相关基因（如
ＰＲ１⁃１ａ、ＣＯＲ４７、Ｐ５ＣＳ、ＨＳＰ７０ 等）的表达，对照植株
中这些基因的表达水平分别提高了 ６． ０５、１３． ６４、
５􀆰 ９３和 ４．３５倍．喷施 ＡＯＰＰ 的黄瓜幼苗中，常温条
件下，与对照相比，ＣＯＲ４７ 和 Ｐ５ＣＳ 的表达水平没有
明显差异，ＰＲ１⁃１ａ 和 ＨＳＰ７０ 的表达分别略有下降
和上调；而在低温胁迫下，这些基因的表达水平显著
低于对照植株，分别只有对照的 ４２． ０％、５４． ８％、
６０􀆰 ２％和６４．７％．这些结果表明，ＡＯＰＰ预处理可以
图 ２　 ＡＯＰＰ 预处理对黄瓜幼苗叶片中 ＰＡＬ活性、总酚和类黄酮含量的影响
Ｆｉｇ．２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＯＰＰ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ＰＡＬ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ．
４４０２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
图 ３　 ＡＯＰＰ 预处理对黄瓜幼苗抗寒性的影响
Ｆｉｇ．３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＯＰＰ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．
表 ２　 ＡＯＰＰ预处理对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中 Ｈ２Ｏ２和抗坏血酸含量及 ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＯＰＰ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ Ｈ２Ｏ２ ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＡｓＡ ｔｏ ＤＨＡ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｕｎ⁃
ｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
Ｈ２Ｏ２
（μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ）
总抗坏血酸
Ｔｏｔａｌ ａｓｃｏｒｂａｔｅ
（μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ）
ＡｓＡ
（μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ）
ＤＨＡ
（μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ）
ＡｓＡ：ＤＨＡ
对照 ２８ ／ １８ ０．１６±０．００２ｃ １．５８±０．０４３ａ １．４３±０．０３２ａ ０．１５±０．０１１ｃ ９．５３±０．６５８ａ
Ｃｏｎｔｒｏｌ １０ ０．２６±０．０１１ｂ １．５７±０．０５１ａ １．３１±０．０２４ｂ ０．２６±０．０２７ｂ ５．０４±０．４６９ｃ
ＡＯＰＰ ２８ ／ １８ ０．１９±０．０１４ｃ １．４９±０．０６９ａ １．２９±０．０３３ｂ ０．２０±０．０３６ｂ ６．４５±０．３３７ｂ
１０ ０．３２±０．０１６ａ １．４７±０．０６２ａ １．１４±０．０３６ｃ ０．３３±０．０２６ａ ３．４５±０．３１７ｄ
不同小写字母表示不同处理间差异显著（Ｐ＜０．０５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｔ ０．０５ ｌｅｖｅｌ．
图 ４　 ＡＯＰＰ 预处理对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中 ＰＲ１⁃１ａ、ＣＯＲ４７、Ｐ５ＣＳ和 ＨＳＰ７０基因表达水平的影响
Ｆｉｇ．４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＯＰＰ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＰＲ１⁃１ａ， ＣＯＲ４７， Ｐ５ＣＳ ａｎｄ ＨＳＰ７０ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｕｎｄｅｒ
ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ．
５４０２７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 董春娟等： 苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用　 　 　 　 　
抑制低温下胁迫相关基因的诱导表达．
２􀆰 ５　 ＰＡＬ 抑制剂预处理对低温胁迫下黄瓜幼苗
Ｈ２Ｏ２ 和抗坏血酸含量及抗氧化酶活性的影响
由表 ２可知，常温下，喷施 ＡＯＰＰ 对黄瓜幼苗叶
片中 Ｈ２Ｏ２含量没有显著影响；低温胁迫 ７２ ｈ 后，叶
片中 Ｈ２Ｏ２含量显著升高，且喷施 ＡＯＰＰ 的叶片中
Ｈ２Ｏ２含量显著高于对照．
低温胁迫对黄瓜幼苗叶片中总抗坏血酸含量没
有显著影响；喷施 ＡＯＰＰ 后，总抗坏血酸含量略有降
低，但差异不显著（表 ２）．进一步分析还原型抗坏血酸
（ＡｓＡ）和脱氢抗坏血酸（ＤＨＡ）含量，低温胁迫引起
ＡｓＡ含量降低，ＤＨＡ含量升高．在对照幼苗中，低温处
理 ７２ ｈ时，ＡｓＡ含量降低了 ０．１２ μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ，ＤＨＡ
含量升高了 ０．１１ μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ；喷施 ＡＯＰＰ 的幼苗
中，ＡｓＡ含量降低了 ０．１５ μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ，ＤＨＡ含量升
高了 ０．１３ μｍｏｌ·ｇ－１ ＦＭ．低温胁迫引起的 ＡｓＡ 含量
降低和 ＤＨＡ 含量升高导致 ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ 下降，且喷
施 ＡＯＰＰ 的幼苗中 ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ（３􀆰 ４５）显著低于对
照（５．０４）．
低温可以诱导黄瓜幼苗中抗氧化酶 ＣＡＴ 和
ＡＰＸ活性的升高．如图 ５ 所示，低温下，黄瓜幼苗叶
片中 ＣＡＴ和 ＡＰＸ活性分别是常温培养幼苗的 １．４３
倍和 １．８０倍．而 ＡＯＰＰ 预处理的幼苗低温处理 ７２ ｈ
后，ＣＡＴ和ＡＰＸ活性均显著低于对照，分别只有对
图 ５　 ＡＯＰＰ 预处理对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片中 ＣＡＴ 和
ＡＰＸ活性的影响
Ｆｉｇ．５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＯＰＰ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＡＴ ａｎｄ
ＡＰＸ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ．
照幼苗的 ７６．６％和 ８４．２％．
２􀆰 ６　 ＰＡＬ 清除 Ｈ２Ｏ２在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的
作用
ＤＭＴＵ是一种有效的 Ｈ２Ｏ２清除剂［２８］ ．对 ＡＯＰＰ
预处理的幼苗喷施 ＤＭＴＵ后（ＡＯＰＰ＋ＤＭＴＵ）再进行
低温处理，结果（图６）表明，低温下，ＡＯＰＰ＋ＤＭＴＵ
图 ６　 ＤＭＴＵ和 ３⁃ＡＴ与 ＡＯＰＰ 复合处理对低温胁迫下黄瓜幼苗中 Ｈ２Ｏ２含量、ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ、ＭＤＡ含量和 Ｆｖ ／ Ｆｍ的影响
Ｆｉｇ．６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏ⁃ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡＯＰＰ ａｎｄ ＤＭＴＵ ｏｒ ３⁃ＡＴ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈ２Ｏ２ ｃｏｎｔｅｎｔ， ＡｓＡ：ＤＨＡ ｒａｔｉｏ， ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ Ｆｖ ／ Ｆｍ
ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ．
６４０２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
处理的幼苗中 Ｈ２Ｏ２积累显著降低，仅为单独喷施
ＡＯＰＰ 的幼苗中 Ｈ２Ｏ２含量的 ６５．９％，相应地 ＡｓＡ ∶
ＤＨＡ升高，幼苗的 Ｆｖ ／ Ｆｍ升高，ＭＤＡ合成减少，幼苗
对低温胁迫的抗性增强．
对黄瓜幼苗喷施 ＣＡＴ 抑制剂 ３⁃ＡＴ［３０］，低温胁
迫时，幼苗表现出与喷施 ＡＯＰＰ 类似的效果，Ｈ２Ｏ２
含量升高，ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ降低；对 ＡＯＰＰ 预处理的黄瓜
幼苗喷施 ３⁃ＡＴ（ＡＯＰＰ＋３⁃ＡＴ），低温时叶片中 Ｈ２Ｏ２
含量进一步升高，ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ进一步降低，幼苗受到
的低温损伤加剧．上述结果表明，ＰＡＬ 清除 Ｈ２Ｏ２在
诱导黄瓜幼苗抗寒性中具有重要作用．
３　 讨　 　 论
ＰＡＬ 是连接初级代谢和苯丙烷类次生代谢的
枢纽，对植物生长发育和抵御环境胁迫有重要的生
理意义［３］，多种生物或非生物胁迫和外源激素均能
诱导 ＰＡＬ活性升高，且这种诱导主要发生在转录水
平上［４］ ．在本试验中，１０ ℃低温可以诱导黄瓜幼苗
中 ＰＡＬ基因表达和酶活性升高（图 １），说明 ＰＡＬ参
与黄瓜幼苗对低温胁迫的响应．黄瓜中 ＰＡＬ 以基因
家族形式存在，至少存在 ７ 个成员，每个 ＰＡＬ 基因
的表达均受到不同程度的低温诱导［１８］，表明各 ＰＡＬ
成员之间在低温响应中存在高度的功能冗余，因此，
难以采用常规的遗传突变方法对 ＰＡＬ 进行功能分
析．本试验中，对黄瓜幼苗喷施 １００ μｍｏｌ·Ｌ－１的抑
制剂 ＡＯＰＰ，可以显著抑制 ＰＡＬ活性，抑制酚类和异
黄酮类物质的积累（图 ２），表明这一生化手段可以
有效地用于 ＰＡＬ的功能研究．
ＰＡＬ 活性升高是植物应对环境胁迫的普遍反
应．当 ＰＡＬ 活性受到抑制，低温下黄瓜幼苗叶片受
伤害程度加剧，ＭＤＡ 合成和电解质渗漏率增大，光
损伤程度加剧（图 ３），胁迫相关基因的诱导表达受
阻（图 ４），表明抑制 ＰＡＬ活性会导致幼苗对低温胁
迫的抗性降低．类似的结果在油菜中也有报道，在
２ ℃低温条件下，经 ＰＡＬ 抑制剂氨基茚磷酸（ＡＩＰ）
处理的油菜叶片中，ＰＡＬ 活性降低了约 ９０％，叶片
中物质积累变缓，Ｆｖ ／ Ｆｍ降低，叶片抵抗随后－５ ℃
低温的能力显著降低［３１］ ．上述结果表明，ＰＡＬ 活性
升高对植物抵抗低温逆境是必需的．
ＰＡＬ是苯丙烷类代谢途径的关键酶．在植物中
苯丙烷类途径的代谢产物包括多酚、类黄酮、异类黄
酮、花色素苷等物质，低温可以诱导这些化合物的大
量合成积累［３－４］ ．低温胁迫时，由于基因突变或施用
抑制剂引起的 ＰＡＬ 活性抑制，会引起植物体内酚
类、类黄酮、木质素和花色素苷等苯丙烷类次生代谢
产物的合成受阻，含量降低，这已在大豆［３２］、拟南
芥［３３］等植物中得到了验证，在黄瓜幼苗中也得到了
类似的结果（图 ２）．苯丙烷类次生代谢物质的积累
对植物抵抗逆境胁迫具有重要作用．首先，这些化合
物分布于植物表层或细胞液泡中，对低温引起的光
损伤具有屏蔽和保护作用［３４］ ．因此，在黄瓜幼苗中
抑制 ＰＡＬ活性加剧了低温引起的光损伤（图 ３）．其
次，这些次生代谢物质可以作为 ＲＯＳ 清除剂，直接
防御和清除 ＲＯＳ［３４］ ． Ｈ２Ｏ２是细胞中最主要的 ＲＯＳ
之一［３５］ ．本研究发现，随着 ＰＡＬ活性降低，黄瓜幼苗
叶片中 Ｈ２Ｏ２过量积累，细胞内还原状态的 ＡｓＡ含量
降低，氧化状态的 ＤＨＡ 含量升高，ＡｓＡ ∶ ＤＨＡ 降低
（表 ２），幼苗抗寒性显著降低（图 ３，图 ４）；对 ＡＯＰＰ
预处理的幼苗增施 ＤＭＴＵ后，低温胁迫引起的 Ｈ２Ｏ２
得以清除，幼苗对低温胁迫的抗性得以恢复（图 ６）．
可见，低温诱导 ＰＡＬ 活性升高，引起苯丙烷类代谢
产物大量合成，可以减轻低温对幼苗的光损伤，并作
为 ＲＯＳ清除剂缓解低温引起的次级氧化损伤，植物
获得抗寒性．
在植物中，ＰＡＬ 除了参与合成多酚、类黄酮等
次生代谢产物外，还介导水杨酸（ＳＡ）等重要激素的
生物合成［３６］，抑制 ＰＡＬ 活性可以显著降低内源 ＳＡ
积累［１２］ ．ＳＡ可以诱导低温下黄瓜幼苗中抗氧化酶
活性升高［３６－３７］ ．低温胁迫下，ＡＯＰＰ 预处理可以导致
黄瓜幼苗中 ＣＡＴ和 ＡＰＸ活性显著降低（图 ５）；对幼
苗喷施 ＣＡＴ 抑制剂 ３⁃ＡＴ，加剧了低温胁迫引起的
Ｈ２Ｏ２积累，进而加剧了细胞氧化损伤（图 ６），表明
低温诱导 ＰＡＬ 活性升高，还可以通过促进 ＳＡ 等激
素的合成，激活细胞内抗氧化酶体系，清除 Ｈ２Ｏ２等
ＲＯＳ分子，维持胞内氧化还原状态的平衡．
综上所述，低温诱导黄瓜幼苗中 ＰＡＬ 的基因表
达和活性升高，ＰＡＬ在低温响应中的作用是多方面
的．一方面，ＰＡＬ可以促进多酚类、类黄酮类、花色素
苷等苯丙烷类次生代谢产物的合成和积累，另一方
面，ＰＡＬ 可以介导 ＳＡ 等激素的合成，提高 ＣＡＴ、
ＡＰＸ等抗氧化酶的活性，最终减少 Ｈ２Ｏ２等 ＲＯＳ 的
积累，维持胞内氧化还原平衡，减轻低温引起的光损
伤和氧化损伤，介导幼苗表现出抗寒性．
７４０２７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 董春娟等： 苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用　 　 　 　 　
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ｔｉｖｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｓ ｉｎ ｓｏｙ⁃
ｂｅａｎ ｒｏｏｔｓ ａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２，
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Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＡＬ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ， ｄｅｖｅｌｏｐ⁃
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ｌｏｇｙ， ２０１０， １５３： １５２６－１５３８
［３４］　 Ｈｅｉｍ ＫＥ， Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｏ ＡＲ， Ｂｏｂｉｌｙａ ＤＪ． Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ａｎ⁃
ｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ⁃ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２，
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［３５］　 Ｎｅｉｌｌ Ｓ， Ｄｅｓｉｋａｎ Ｒ， Ｈａｎｃｏｃｋ Ｊ． Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｉｇ⁃
ｎａｌｉｎｇ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００２， ５：
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ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｏ ｃｏｍｂａｔ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００９， ４７： １７７－２０６
［３７］　 Ｌｉｕ Ｗ （刘　 伟）， Ａｉ Ｘ⁃Ｚ （艾希珍）， Ｌｉａｎｇ Ｗ⁃Ｊ （梁
文娟）， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｐｈｏｔｏ⁃
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ． Ｃｈｉ⁃
ｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ （应用生态学报），
２００９， ２０（２）： ４４１－４４５ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
作者简介　 董春娟， 女， １９８３ 年生， 博士， 副研究员． 主要
从事蔬菜苗期栽培生理研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｄｏｎｇｃｈｕｎｊｕａｎ＠ ｃａａｓ．ｃｎ
责任编辑　 张凤丽
９４０２７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 董春娟等： 苯丙氨酸解氨酶在诱导黄瓜幼苗抗寒性中的作用