全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (2): 195–208　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0590 195
收稿 2015-11-18　　修定 2015-12-18
资助 现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-30)。
* 通讯作者(E-mail: jun-wang@cau.edu.cn)。
葡萄苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析
孙润泽1, 张雪1, 成果1, 李强1, 朱燕溶1, 陈武2, 潘秋红1, 段长青1, 王军1,*
1中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒研究中心, 北京100083; 2中信国安葡萄酒业股份有限公司, 新疆玛纳
斯832200
摘要: 苯丙氨酸解氨酶(PAL)作为苯丙烷途径的入口酶, 与植物生长发育以及生物和非生物胁迫响应等生物过程密切相
关。本研究通过生物信息学方法, 在已测序的葡萄基因组中预测得到17个PAL基因, 其中13个串联分布在第11和16号染色
体的2个重复基因群中, 4个随机分布于其他染色体。系统发育树分析表明, 葡萄大部分PAL基因与双子叶植物PAL基因聚为
一类, 而串联分布于第11号染色体的4个PAL基因与单、双子叶植物PAL基因亲缘关系较远。利用‘赤霞珠’葡萄果实转录组
数据克隆获得5个PAL基因的全长编码序列, 序列分析显示, 这些PAL基因能够编码具有完整结构域的PAL蛋白。表达谱分
析及产物检测结果表明, VviPAL2和VviPAL15在葡萄果实和其他组织中的表达量相对较高, 且在不同发育期果实中的表达
与酚类物质的积累密切相关。此外, 果实曝光和遮光处理分别促进和抑制VviPAL2、VviPAL4和VviPAL7的表达及相应产物
的积累。
关键词: ‘赤霞珠’; 苯丙氨酸解氨酶; 基因家族; 表达谱; 酚类物质
酚类物质由苯丙烷途径(phenylpropanoid path-
way)和类黄酮生物合成途径(flavonoid biosynthetic
pathway)产生, 是植物体内重要次生代谢产物之一,
广泛参与植物种子传播、紫外线辐射保护、抵御
病原菌与食草动物等生物过程。葡萄是全球种植
面积最大的水果类经济作物, 其果实中的酚类物
质主要包括羟基苯甲酸(hydroxybenzoic acid, HBA)
和羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid, HCA)两类酚
酸(phenolic acid), 以及黄酮醇(flavonol)、原花色素
(proanthocyanidin, PA)和花色苷(anthocyanin)等类
黄酮(flavonoid)。各类酚类物质的合成时期不同,
在果实中的积累部位也有所差异。HCA类酚酸在
果实发育早期合成, 通常以酯化形式存在于果皮
和果肉中; 黄酮醇在葡萄果实发育早期和成熟期
两个阶段的果皮中合成并积累; PA主要在果实发
育早期合成并大量积累于果皮和种子中; 而花色
苷仅在果实成熟阶段的果皮中合成并积累(Adams
2006; Braidot等2008)。这些物质不仅与果实的成
熟、感官品质、颜色及抗逆性密切相关(Chen等
2006; Teixeira等2013), 而且决定葡萄酒的颜色、
风味、苦味、收敛性、生化稳定性及其对人体健
康的潜在功效(Santos-Buelga和Scalbert 2000; Wa-
terhouse 2002)。因此, 葡萄果实发育过程中酚类物
质的合成与调控引起了人们的广泛关注。
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,
PAL; EC 4.3.1.24)是苯丙烷途径的入口酶和限速
酶, 也是连接初生代谢和次生代谢的分支酶之一,
在植物体内能够催化莽草酸途径的产物L-苯丙氨
酸(L-phenylalanine, L-Phe)脱氨基生成反式肉桂酸
(trans-cinnamic acid, t-CA), 后者为合成HCA类酚
酸、木质素(lignin)和类黄酮等物质的共同底物。
PAL蛋白首次在大麦(Hordeum vulgare)中被发现
(Koukol和Conn 1961), 随后被证实广泛存在于植
物、真菌、酵母和藻类中, 但目前在动物中尚未
发现。在所有已研究的植物中, PAL蛋白由一个多
基因家族编码, 在拟南芥(Arabidopsis)、烟草(Ni-
cotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)和杨树(Pop-
ulus trichocarpa)等植物中的基因拷贝数较低(Raes
等2003; Hamberger等2007; Reichert等2009), 而在
番茄(Lycopersicon esculentum)、马铃薯(Solanum
tuberosum)和西瓜(Citrullus lanatus)等植物中具有
较高的拷贝数 (Chang等2008; Dong和Shang
2013)。植物PAL基因家族成员对各类激素和逆境
胁迫的响应不同, 在植物体不同组织和不同发育
期的表达也存在差异。在拟南芥中, PAL酶由4个
基因AtPAL1~4编码, 其中AtPAL1、AtPAL2和At-
PAL4在茎中表达量较高, AtPAL3仅在茎中微量表
达, AtPAL1能够在维管组织中表达, AtPAL2和At-
PAL4均能在种子中表达(Fraser和Chapple 2011)。
此外, AtPAL1和AtPAL2在叶片中的表达受低温和
植物生理学报196
氮气消耗诱导(Olsen等2008)。西瓜基因组中共有
12个PAL基因, 其中11个ClPAL基因在茎、雄花和
雌花中均大量表达, 6个ClPAL基因在果实中大量
或适量表达, 且表达水平受乙烯信号的调节(Dong
和Shang 2013)。已有研究表明, 葡萄基因组中存
在15~20个PAL基因(Sparvoli等1994), 但目前关于
葡萄PAL (VviPAL)基因家族结构和功能的系统性
分析尚未见报道。本文以我国主栽的红色酿酒葡
萄品种‘赤霞珠’ (‘Cabernet Sauvignon’)为研究对象,
利用已有的葡萄参考基因组数据和‘赤霞珠’葡萄
果实转录组数据, 对‘赤霞珠’葡萄PAL基因家族的
系统进化和基因结构进行了详细的生物信息学分
析。同时, 结合基因克隆、启动子分析、基因表
达和代谢产物检测, 深入探讨了‘赤霞珠’葡萄果实
中PAL基因的表达调控及功能, 为进一步研究葡萄
果实酚类物质代谢的调控机理提供参考。
材料与方法
1 植物材料与处理
葡萄(Vitis vinifera L.)各组织样品于2013年采自
北京市密云县张裕爱斐堡国际酒庄葡萄园(40°38′N
116°90′E) 10年树龄的‘赤霞珠’。所有组织均随机
采于至少50株健康葡萄植株, 其中花穗采于盛花
期(E-L 23), 根、茎、叶片和卷须采于坐果期(E-L
29), 果实分别采于坐果期、花后5周(E-L 31)、膨
大期(E-L 33)、转色初期(E-L 35)、转色中期(E-L
36)、转色结束期(E-L 37)和采收期(E-L 38)等7个
发育阶段。每次采样时间均固定于上午10:00~
11:00, 每个样品重复采样3次, 样品采集后立即用
液氮速冻并于−80°C保存。每个采样点的部分葡
萄果实在冷冻保存前手工剥离果皮、果肉及种子,
用于后续葡萄果实不同组织(器官)样品的基因表
达和产物检测实验。此外, 选取膨大期、转色中
期和采收期3个发育期样品进行葡萄果实体外离
体温度胁迫实验。各采样点分别随机采集1 500粒
发育正常且无物理伤害的果实, 处理前用去离子
水清洗晾干。温度处理在恒温培养箱中进行, 处
理组温度分别设为1 0和4 0 ° C , 对照组温度为
25°C。处理组的处理时间为4、12、20和28 h以及
处理20 h后室温恢复2、4和8 h, 对照组取样时间为
4、12、22、24和28 h。每组处理进行3次生物学
重复, 每个生物学重复随机选取50粒葡萄果实, 各
处理结束后立即用液氮速冻并低温保存, 用于后
续基因表达检测实验。
果穗遮光和曝光处理实验于2012年在新疆昌
吉州玛纳斯县中信国安葡萄酒有限公司酿酒葡萄
种植基地(40°17′N 86°12′E)进行。葡萄园中‘赤霞
珠’葡萄为12年树龄的自根苗, 行向为南北向, 整形
方式为“厂”字形(modified vertical-shoot-positioned
trellis system, M-VSP), 栽植密度为2.5 m×1.1 m
(Cheng等2014)。实验采用随机区组田间试验设
置, 每组处理重复3次, 每次重复包括15株长势一
致的健康葡萄植株。遮光处理采用36 cm×30 cm内
侧带黑纸的果袋对转色期葡萄果穗套袋, 转色结
束后摘袋, 曝光处理为在葡萄果实转色初期摘除
结果新梢基部1~6节上的叶片。各处理的采样及
前处理方法同上。
2 葡萄PAL基因家族生物信息学分析
‘黑比诺’ (‘Pinot Noir’)葡萄全基因组注释序
列于Genoscope数据库(http://www.genoscope.cns.
fr/spip/)下载; ‘赤霞珠’葡萄果实转录组从头组装
(de novo transcriptome assembly)数据为本实验构
建(Sun等2015a), NCBI高通量测序数据库(Se-
quence Read Archive, SRA)登录号SRR1656853。
PAL蛋白结构域的隐马尔可夫模型(hidden Markov
model, HMM) PF00221于Pfam数据库(http://www.
sanger.ac.uk/Software/Pfam/)下载。以PF00221为探
针, 利用HMMER 3.0软件包在‘黑比诺’参考基因组
和本实验室构建的‘赤霞珠’葡萄果实转录组预测
的蛋白序列中进行检索, 检索结果提交至NCBI保
守结构域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)
验证。采用MEGA 5.2软件中的邻接(neighbor-join-
ing, N-J)法构建系统发育树(Tamura等2011), 系统
树自举检验重复值设为1 000。
3 基因克隆与生物信息学分析
根据‘黑比诺’基因组序列和‘赤霞珠’葡萄果
实转录组序列设计PAL基因克隆引物(表1), 以本实
验室已构建的‘赤霞珠’葡萄果实cDNA文库为模板
(Mu等2014)进行PCR扩增、克隆和测序, 具体操作
参考Sun等(2015b)的方法。克隆所得序列通过
NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)
和DNASTAR软件预测开放阅读框(open reading
孙润泽等: 葡萄苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析 197
frame, ORF)及其氨基酸序列, 并利用DNAMAN
6.0和在线分析软件MOTIF (http://www.genome.jp/
tools/motif/)进行多重序列比对和蛋白保守结构域
预测。通过SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/)、
TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Tar-
getP/)、SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/)、ProtComp 9.0 (http://www.softberry.
com/)和WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/)对蛋白
质结构进行预测和分析。以PAL基因序列为探针,
通过BLAST检索程序在参考基因组序列中寻找编
码基因上游DNA序列。利用在线分析软件Softberry
TSSP (http://linux1.softberry.com/)预测转录起始位
点和启动子区域, 并通过PlantCARE软件(http://
bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/
html/)和PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/
PLACE/index.html/)分析基因启动子顺式作用元件
(cis-acting elements)。
4 总RNA提取和实时定量(real-time quantitative)
PCR
利用Plant Total RNA Extraction Kit (Sigma–
Aldrich, St. Louis, MO, USA)提取和DNase I
(Promega, Madison, WI, USA)纯化‘赤霞珠’葡萄不
同组织(器官)总RNA, 随后利用AMV reverse tran-
scriptase (Promega, Madison, WI, USA)和oligo
d(T)18 (Takara, 辽宁大连)反转录合成cDNA。采
用SYBR® Premix Ex TaqTM (Takara, 辽宁大连)试剂
盒检测‘赤霞珠’葡萄不同组织(器官) PAL基因的表
达水平, 实时定量PCR反应于7300 Real-Time PCR
表1 基因克隆及定量分析引物
Table 1 Primers used for gene cloning and quantitative analysis
引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′)
VviPAL1 cDNA cloning ATGGAATTCTCACACCACAA TCAGCAAATTGGAAGAGGAG
VviPAL2 cDNA cloning ATGGAAGCAATGAACAGCCA CTAACAGATTGGGAGAGGAG
VviPAL4 cDNA cloning ATGCCACTCATCCCATTCAAC TTAGAGCTGGTCCCAATTCA
VviPAL7 cDNA cloning ATGGACAGCATGAACAATGG CTAGCAGATTGGGAGAGGAG
VviPAL15 cDNA cloning ATGCCTGCAGGTCGACGATT CTAGCAGATTGGGAGAGGAG
VviPAL1 real-time PCR CTCACACCACAACGGCAACG CGCCACCATTCTCTTCACCTC
VviPAL2 real-time PCR CCACCCATCAAGATTCTGCGAG CATTGTTCAGTGCGTGTTCTACCA
VviPAL4 real-time PCR CTCCGCAGGCTATTACATTTTC GGACTCACCTTGTTTTCACCAC
VviPAL7 real-time PCR GAAGAACCAAACAAGGCGGAG AGAGGCAAGCAAGGGGTAATG
VviPAL15 real-time PCR CAACTCTGTGAATGATAACCCCTT TGCTCCCTTGAAACCATAGTCC
VviUbiquitin real-time PCR GTGGTATTATTGAGCCATCCTT AACCTCCAATCCAGTCATCTAC
VviActin real-time PCR CTTGCATCCCTCAGCACCTT TCCTGTGGACAATGGATGGA
System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
进行, 反应体系及反应程序按照Sun等(2015b)方法
进行。以克隆得到的PAL基因序列为模板, 利用
Primer Premier 5软件设计基因特异引物(表1), 并
通过琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析检测引物特
异性。选取VviUbiquitin1和Vviβ-Actin基因作为内
参基因, 采用2–δCt方法计算各基因的相对表达量,
其中δCt=CtTarget−CtControl, Ct为循环阈值。
5 酚类物质提取与检测
葡萄果实酚酸的提取与HPLC检测采用宋文凤
等(2013)描述的方法。葡萄果皮黄酮醇、黄烷醇以
及花色苷3种类黄酮的提取、纯化与HPLC检测参照
Li等(2014)的方法进行。每组样品包括3次重复, 每次
重复随机选取100粒果实进行3次平行提取和检测。
实验结果
1 葡萄PAL基因家族全基因组预测
以植物PAL蛋白结构域的HMM模型为探针,
在‘黑比诺’参考基因组预测蛋白序列中进行检索,
获得18个PAL候选基因, 提交至NCBI保守结构域
数据库进行验证, 保留包含完整PAL结构域的基
因, 最终得到17个葡萄PAL基因(表2)。将各PAL基
因定位至相应的染色体, 并根据PAL基因在染色体
上的位置将基因命名为VviPAL1~17 (图1)。16个
PAL基因分别被定位到第6、8、11、13和16号染
色体上, 其中第6、8和13号染色体分别仅存在1个
PAL基因, 而第11和16号染色体分别包含4和9个
PAL基因, 且均以串列重复基因群的形式分布。此
植物生理学报198
表2 葡萄PAL基因家族
Table 2 PAL gene family in V. vinifera
基因名称 Genoscope基因序列号 GenBank登记号 功能注释
VviPAL1 GSVIVT01025214001 XM_002285241.2 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL2 GSVIVT01025703001 XM_002281763.3 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL3 GSVIVT01015123001 XM_010658183.1 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL4 GSVIVT01015124001 XM_002278480.3 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL5 GSVIVT01015138001 XM_002278480.3 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL6 GSVIVT01015140001 XM_010657852.1 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL7 GSVIVT01016257001 XM_010660093.1 苯丙氨酸解氨酶G1
VviPAL8 GSVIVT01024292001 XM_002267917.3 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL9 GSVIVT01024293001 XR_077533.3 苯丙氨酸解氨酶假基因
VviPAL10 GSVIVT01024294001 XM_003633937.2 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL11 GSVIVT01024295001 XM_002268145.3 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL12 GSVIVT01024299001 XM_002268220.3 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL13 GSVIVT01024303001 XM_003633938.2 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL14 GSVIVT01024305001 XM_002268696.3 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL15 GSVIVT01024306001 XM_003633939.2 类苯丙氨酸解氨酶
VviPAL16 GSVIVT01024315001 XM_010663773.1 苯丙氨酸解氨酶
VviPAL17 GSVIVT01006148001 XM_003635609.2 类苯丙氨酸解氨酶
外, VviPAL17基因位于无法定位到相应染色体的连
锁群“chrUn”上。采用同样方法, 在‘赤霞珠’葡萄
果实转录组的预测蛋白序列中检索并验证, 共获
得9个葡萄PAL基因转录本, 与‘黑比诺’参考基因
图1 葡萄PAL基因的染色体定位
Fig.1 Mapping of the PAL gene family on V. vinifera chromosomes
孙润泽等: 葡萄苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析 199
组PAL基因的序列比对结果表明, Unigene1290
和CL27.cont ig3两转录本均与VviPAL1同源 ,
CL27.contig1、Unigene25158和CL27.contig2分别
对应于VviPAL2、VviPAL4和VviPAL15, 而Uni-
gene1287、1288、1289以及CL27.contig4这4个转
录本均为VviPAL7的同源基因。为了探讨不同植
物PAL基因的进化关系, 采用N-J法将葡萄PAL基因
和拟南芥、烟草、杨树、水稻和玉米(Zea mays)
PAL基因的蛋白序列构建系统发育树。结果如图2
所示, VviPAL1、VviPAL2和VviPAL7~17与拟南芥、
烟草和杨树等双子叶植物PAL基因亲缘关系较近,
而与水稻和玉米等单子叶植物PAL基因亲缘关系
较远。此外, 定位于第11号染色体的VviPAL3~6串
联基因群单独聚为一类。
图2 葡萄PAL蛋白与其他物种PAL蛋白系统发育树分析
Fig.2 Phylogenetic tree constructed from the deduced amino acid sequences of VviPALs and other plant PALs
AtPAL、NtPAL、OsPAL、PtPAL、VviPAL和ZmPAL分别表示拟南芥、烟草、水稻、毛果杨、葡萄和玉米PAL蛋白, 各物种PAL蛋
白分别按其编码基因在染色体上的位置顺序命名。
植物生理学报200
2 ‘赤霞珠’ PAL基因克隆与生物信息学分析
根据‘黑比诺’基因组预测的PAL基因序列和
‘赤霞珠’葡萄果实转录组参考序列设计引物, 从
‘赤霞珠’葡萄果实cDNA文库中克隆获得5个PAL基
因的完整编码序列(GenBank登记号为KU162973~
KU162977), 分别为‘黑比诺’ VviPAL1、VviPAL2、
VviPAL4、VviPAL7和VviPAL15的同源基因。这5个
PAL基因ORF长度分别为2 154、2 133、2 394、
1 860和2 007 bp, 与‘黑比诺’基因组中预测的PAL
基因的差异碱基数量分别为2、9、29、16和7个,
除VviPAL4基因序列不含内含子外, 其他基因序列
均由2个外显子和1个内含子组成。DNASTAR软
件预测结果显示, VviPAL1、VviPAL2、VviPAL4、
VviPAL7和VviPAL15基因分别编码包含717、710、
797、619和668个氨基酸残基的蛋白质, 分子量分
别为77.94、77.12、84.43、67.62和72.36 kDa, 等
电点(pI)分别为6.0、6.1、6.0、6.6和6.4。氨基酸
序列比对表明, ‘赤霞珠’与‘黑比诺’ VviPAL1、
VviPAL2、VviPAL4、VviPAL7和VviPAL15蛋白
序列分别存在1、6、9、3和5个差异氨基酸。蛋
白结构域预测结果显示, 这些VviPAL蛋白序列分
由氨基末端(N-terminus)、结构域II、核心域和屏
蔽域(shielding domain) 4部分组成, 且在核心域均
包含1个PAL蛋白家族普遍存在的活性位点丙氨
酸-丝氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)三肽保守结构域
(图3)。此外, 对各个PAL蛋白的结构分析表明,
VviPAL1、VviPAL2、VviPAL4、VviPAL7和
VviPAL15蛋白均不具备跨膜螺旋结构, 且不含信
号肽 , 为非分泌蛋白。亚细胞定位预测显示 ,
VviPAL1、VviPAL2、VviPAL7和VviPAL15蛋白
定位于非叶绿体和线粒体的胞质内, 而VviPAL4蛋
白包含叶绿体运输肽, 亚细胞定位于叶绿体。
图3 葡萄PAL蛋白多重序列比对
Fig.3 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of VviPALs
完全一致、保守和不保守的氨基酸残基分别用黑底白字、灰底黑字和白底黑字表示, 方框所示为PAL蛋白中由Ala-Ser-Gly氨基酸残
基组成的亲电基团。
孙润泽等: 葡萄苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析 201
3 PAL基因启动子及表达调控因子的预测与分析
利用TSSP和PlantCARE软件以及PLACE数据
库对VviPAL1、VviPAL2、VviPAL4、VviPAL7和
VviPAL15蛋白编码基因上游DNA序列进行分析,
预测出VviPAL1、VviPAL2、VviPAL4、VviPAL7和
VviPAL15基因的转录起始位点碱基残基分别为
T、A、A、A和A, 位于各基因起始密码子上游
112、119、78、421和263 bp处。将转录起始位点
定义为+1, 预测得到的VviPAL1、VviPAL2、
VviPAL4、VviPAL7和VviPAL15基因启动子基本元
件TATA-box分别位于−33、−31、−32、−30和−24
bp处, 且在TATA-box上游存在多个转录增强元件
CAAT-box, 符合真核生物RNA聚合酶II型基因启
动子的基本特征。对各基因编码序列上游1 500 bp
DNA序列的顺式作用元件预测结果显示 , 5个
VviPAL基因启动子存在多种类型的光响应元件、
逆境胁迫响应元件以及激素响应元件(表3)。其中,
VviPAL1基因启动子包含光响应元件Box 4、chs-
CMA1a和Sp1, 防御及胁迫响应元件TC-rich re-
peats, 高温胁迫响应元件HSE, 干旱响应元件MBS
和植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)
响应元件TGACG-motif。VviPAL2基因启动子包含
光响应元件Box 4、G-box、ACE、4cl-CMA2b、
as-2-box、GATA-motif、L-box和Box II, 防御及胁
迫响应元件TC-rich repeats, 真菌诱导元件Box-W1,
植物激素乙烯响应元件ERE, 赤霉素(gibberellin,
GA)响应元件P-box和MeJA响应元件TGACG-motif,
在VviPAL2基因的5′非编码区(5′-untranslated region)
还存在2个转录增强元件5UTR Py-rich stretch。
VviPAL4基因启动子包含光响应元件Box I、Box
4、ATCT-motif、MRE、TCT-motif和TGG-motif,
GA响应元件TATC-box, 水杨酸(salicylic acid, SA)
响应元件TCA-element以及1个WRKY转录因子结
合位点W-box。VviPAL7基因启动子包含光响应元
件Box 4、GT1-motif、I-box和Sp1, 高温胁迫响应
元件HSE, 低温响应元件LTR, 脱落酸(abscisic acid,
ABA)响应元件ABRE, MeJA响应元件TGACG-mo-
tif, 以及1个MYB结合位点MBS。VviPAL15基因启
动子包含光响应元件Box 4、4cl-CMA2b、ACE、
G-box、GAG-motif、L-box、Sp1、AE-box、Box
I和Box II, 乙烯响应元件ERE和MeJA响应元件
TGACG-motif。此外, 在VviPAL15基因的5′非编码
区也包含2个连续的5UTR Py-rich stretch。
4 ‘赤霞珠’ PAL基因的组织特异性表达和诱导表达
定量PCR实验结果表明, VviPAL1、VviPAL2、
VviPAL4、VviPAL7和VviPAL15在‘赤霞珠’葡萄的
根、茎、叶片、卷须、花、果实和种子等不同器
官中均能表达, 其中VviPAL2和VviPAL15在种子中
的表达量最高, 且在其他器官中的表达量均相对
较高, VviPAL1在根、叶片、花和种子中适量表达,
VviPAL4和VviPAL7在各器官中表达量均相对较低
(图4-A)。在葡萄果实发育过程中, 各VviPAL基因
在果实中的表达从坐果至转色前均呈先升高后降
低的趋势, 在转色期至成熟期的果实中, VviPAL2和
VviPAL15的表达恢复升高, 而VviPAL1、VviPAL4和
VviPAL7仅微量表达(图4-B)。各基因在果皮中的
表达量均显著高于果肉中的表达量, 且随发育期
的变化趋势与果实中基本一致(图4-C和D)。此外,
在不同发育期的种子中, VviPAL2和VviPAL15的表
达量在坐果期至转色初期较高, 在转色期至成熟
期较低, 而VviPAL1、VviPAL4和VviPAL7的表达均
保持较低水平(图4-E)。
对转色期葡萄果穗进行曝光处理能够提高
VviPAL1、VviPAL2、VviPAL4、VviPAL7和
VviPAL15在转色中期的表达 , 其中VviPAL1和
VviPAL4的表达与对照有显著差异, 但在转色完成
后和成熟期, 各VviPAL基因在曝光处理与对照果
实中的表达几乎无显著差异(图5)。遮光处理导致
VviPAL1、VviPAL2和VviPAL15在转色初期葡萄果
实中的表达显著降低, 而转色完成恢复曝光后, 各
基因的表达又恢复升高。温度胁迫处理对不同发
育期葡萄果实中VviPAL基因表达的影响不同, 其
中VviPAL1的表达在膨大期葡萄果实受低温和高
温胁迫处理后均下调, 而在高温处理后的成熟期
果实中上调; VviPAL2的表达在低温处理后的膨大
期和转色中期以及高温处理后的转色中期的果实
中均上调 , 室温恢复放置后其表达恢复正常 ;
VviPAL4的表达在低温和高温处理后的膨大期葡
萄果实中均上调, 而在另外2个发育期的果实中无
显著变化。此外, 低温处理能够显著提高各个发
育期葡萄果实中VviPAL15的表达, 而降低VviPAL7
的表达; 高温处理显著抑制各个发育期葡萄果实
中VviPAL15的表达 , 提高转色中期葡萄果实中
VviPAL7的表达; 室温恢复放置后 , VviPAL7和
植物生理学报202
表3 葡萄PAL基因启动子顺式作用元件预测
Table 3 Putative cis-acting regulatory elements in the VviPAL gene promoters
基因 顺式作用元件 位置/bp 功能预测
VviPAL1 TATA box −33 启动子核心元件
Sp1 −58 光响应元件
TGACG-motif −187 MeJA响应相关顺式作用元件
HSE −306、−867和−1011 高温胁迫响应相关顺式作用元件
TC-rich repeats −537、−898和−1190 防御和胁迫响应相关顺式作用元件
chs-CMA1a −561和−877 光响应元件片段
Box 4 −982和−1087 光响应相关保守DNA片段
MBS −1070 干旱诱导型MYB结合位点
VviPAL2 5UTR Py-rich stretch +32和+56 转录增强元件
TATA box −31 启动子核心元件
L-box −80和−275 光响应元件片段
P-box −130 GA响应元件和光响应元件片段
box II −185 光响应元件片段
ACE −194 光响应相关顺式作用元件
Box-W1 −232 真菌诱导子响应元件
4cl-CMA2b −274 光响应元件
TC-rich repeats −349 防御和胁迫响应相关顺式作用元件
TGACG-motif −594 MeJA响应相关顺式作用元件
GATA-motif −658 光响应元件片段
Box 4 −860 光响应相关保守DNA片段
as-2-box −919 组织特异性表达和光响应相关元件
G-box −985 光响应相关顺式作用元件
ERE −1180 乙烯响应元件
VviPAL4 TATA box −32 启动子核心元件
W box −71 WRKY转录因子结合位点
HSE −366和−1076 高温胁迫响应相关顺式作用元件
Box I −413 光响应元件
ATCT-motif −431 光响应相关保守DNA片段
TCT-motif −461 光响应元件片段
TATC-box −510 GA响应相关顺式作用元件
Box 4 −751和−771 光响应相关保守DNA片段
MRE −888 光响应相关MYB 结合位点
TCA-element −1219 SA响应相关顺式作用元件
TGG-motif −1396 光响应元件片段
VviPAL7 TATA box −30 启动子核心元件
Sp1 −62 光响应元件
I-box −130 光响应元件片段
ABRE −152 ABA脱落酸响应相关顺式作用元件
CGTCA-motif −222和−234 MeJA响应相关顺式作用元件
TGACG-motif −237 MeJA响应相关顺式作用元件
MBS −252 MYB结合位点
GT1-motif −299 光响应元件
HSE −570和−963 高温胁迫响应相关顺式作用元件
Box 4 −805 光响应相关保守DNA片段
LTR −1073 低温胁迫响应相关顺式作用元件
VviPAL15 5UTR Py-rich stretch +38和+48 转录增强元件
TATA box −24 启动子核心元件
Box I −50 光响应元件
ERE −51 乙烯响应元件
L-box −77和−262 光响应元件片段
G-box −164、−307和−1178 光响应相关顺式作用元件
CGTCA-motif −167 MeJA响应相关顺式作用元件
ACE −179 光响应相关顺式作用元件
AE-box −208 光响应元件片段
4cl-CMA2b −261 光响应元件
Box 4 −525和−943 光响应相关保守DNA片段
Box II −582 光响应元件片段
Sp1 −968 光响应元件
GAG-motif −1029 光响应元件片段
TGACG-motif −1170 MeJA响应相关顺式作用元件
孙润泽等: 葡萄苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析 203
图4 PAL基因在‘赤霞珠’葡萄不同器官(A)和不同发育期果实(B)、果皮(C)、果肉(D)和种子(E)中的表达
Fig.4 The relative expression of VviPALs in different organs (A) and in fruit (B), skin (C), flesh (D) and seed (E) during different
developmental stages of ‘Cabernet Sauvignon’ grapes
不同小写英文字母表示数据在同一发育期内具有显著差异(P<0.05), 图5和7-B同。图A中各VviPAL基因在果实和种子中的表达量取
自7个发育期平均值。
VviPAL15的表达均恢复正常(图6)。上述结果表明,
VviPAL基因在果实中的表达受到光照和温度的调
控, 家族各成员在逆境胁迫下的响应有所差异, 且
受到果实发育期的影响。
5 ‘赤霞珠’葡萄果实代谢产物积累
黄酮醇、PA和花色苷3种类黄酮以及HCA类
酚酸是葡萄果实中含量较高的酚类物质, 其中果
皮中的类黄酮约占果实总酚类物质浓度的90%以
上。在葡萄果实发育过程中, 酚类物质浓度从坐
果期至膨大期不断降低, 而在转色期至成熟期又
逐渐升高(图7-A), 与VviPAL2和VviPAL15在果实中,
尤其是在果皮中的表达变化趋势基本一致。在葡
萄果实转色期对果穗进行曝光处理能够提高果实
中的酚类物质含量, 但在成熟期与对照无显著差
异。与之相反, 对转色期果实进行遮光处理能够
显著降低果实中酚类物质的含量, 而恢复曝光后
果实中的酚类物质含量提高, 且在成熟期与对照
无显著差异(图7-B)。相关性分析表明, 葡萄果实
中VviPAL2、VviPAL4和VviPAL7在不同光照处理下
的表达变化与酚类物质含量呈正相关关系, 证明
这3个VviPAL基因家族成员在光调控的葡萄果实
酚类物质代谢过程中发挥重要作用。
植物生理学报204
讨　　论
葡萄为葡萄科葡萄属多年生落叶藤本植物,
其中欧亚种等大多数葡萄种的染色体数为2n=2x=
38 (王军和段长青2010), 已完成全基因组测序的酿
酒品种‘黑比诺’ PN40024葡萄基因组大小约为487
Mb (Jaillon等2007)。PAL基因在葡萄基因组中由
一个多基因家族组成, 探针杂交实验分析表明,
PAL基因在葡萄单倍体基因组中的拷贝数为15~20
个(Sparvoli等1994), 而Velasco等(2007)通过生物信
息学预测的方法在已测序的‘黑比诺’葡萄全基因
组中发现13个PAL基因。本研究利用植物PAL蛋白
结构域HMM模型, 在12×覆盖率‘黑比诺’基因组的
注释基因结果中检索, 并通过保守结构域验证获
得17个假定葡萄PAL基因家族成员(表2)。拟南芥
基因组大小为125 Mb, 包含4个PAL基因(Raes等
2003), 相比而言, 葡萄PAL基因数量和基因组大小
的比例与其在拟南芥中基本一致。葡萄PAL基因
图6 温度处理对‘赤霞珠’葡萄果实中PAL基因表达的影响
Fig.6 Effects of high and low temperature treatments on the
transcription of VviPALs in ‘Cabernet Sauvignon’ grape berries
以Log2 (处理组平均值/对照组平均值)计算热图中每个色块
的数值, 横坐标中20+2、20+4和20+8分别表示低温或高温处理20
h后室温恢复2、4和8 h。
图5 曝光和遮光处理对‘赤霞珠’葡萄果实中PAL基因表达的影响
Fig.5 Effects of sunlight exposure and shading treatments on the transcription of VviPALs in ‘Cabernet Sauvignon’ grape berries
孙润泽等: 葡萄苯丙氨酸解氨酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析 205
图7 不同发育期及光照处理后‘赤霞珠’葡萄果实酚类物质
含量
Fig.7 Concentrations of phenolic compounds in ‘Cabernet
Sauvignon’ grape berries during different developmental
stages and under light treatments
家族成员在第6、8、11、13和16号染色体以及未
知染色体连锁群上的随机分布表明, 这些PAL基因
家族成员可能来自葡萄进化起源的六倍体祖先基
因组(ancestral genomes) (Jaillon等2007), 或由葡萄
基因组特异性大规模复制产生(Velasco等2007), 而
VviPAL3~6和VviPAL8~16在第11和16号染色体片
段上的串列排布及其序列相似度则证明, VviPAL基
因在基因组中可能经历若干次基因片段串联复制
事件(Cannon等2004)。系统发育树分析表明, 大多
数VviPAL基因与拟南芥、烟草和杨树等双子叶植
物PAL基因具有共同的进化祖先, 而独立于单子叶
植物和双子叶植物聚类的4个串联重复VviPAL基
因则可能来源于被子植物分化前更为古老的祖先
(图2)。葡萄PAL基因家族在基因组中的大量扩增
从一方面为PALs在葡萄适应外界环境过程中的重
要作用提供证据。
葡萄果实中的酚类物质在果实细胞质中直接
合成、运输并积累(Braidot等2008), 作为苯丙烷代
谢和类黄酮生物合成途径的入口酶, PALs在葡萄
果实发育过程中的表达活性与果实成熟、品质及
其对生物和非生物胁迫的抗性等方面具有密切关
系。因此, 我们利用本实验室构建的‘赤霞珠’葡萄
果实转录组参考序列数据, 对能够在果实中表达
的葡萄PAL基因家族成员进行克隆和基因结构预
测, 并通过定量PCR实验分析各基因的表达谱。芳
香族氨基酸解氨酶家族蛋白包含一个由Ala-Ser-
Gly组成的三肽的自我环化、脱水构成的高度保
守的亚甲基咪唑酮(methylidene-imidazolone, MIO)
亲电基团(Ritter和Schulz 2004)。序列比对结果显
示, VviPAL1、VviPAL2、VviPAL4、VviPAL7和
VviPAL15基因的ORF中均具有环化三肽结构。植
物PAL蛋白在亚细胞水平上主要分布于细胞质以
及胞质内的线粒体、叶绿体和微粒体等细胞器
(Santiago等2000; Achnine等2004)。基因结构的高
度保守特征及其预测蛋白在细胞质和叶绿体中亚
细胞定位结果表明, 克隆所得VviPAL基因能够编
码具备与其他植物PALs相同催化功能的蛋白。
基因表达谱分析显示, VviPAL2和VviPAL15在
‘赤霞珠’葡萄的根、茎、叶片和卷须等营养器官
以及花、果实和种子等生殖器官中均有较高水平
的表达(图4), 此外, 多个VviPAL基因家族成员在
‘赤霞珠’葡萄果实中的表达受到不同光照、温度
处理的诱导或抑制(图5和6), 表明VviPAL基因家族
成员在‘赤霞珠’葡萄发育以及对环境刺激的响应
过程中可能存在功能冗余性。PAL基因的冗余现
象在拟南芥、西瓜和黄瓜(Citrullus lanatus)等植物
中同样存在。拟南芥pal1和pal2单突变体植株生
长或发育与野生植株相比无明显表型差异 , 而
pal1/pal2双突变则导致植株败育、木质素积累降
低以及次生细胞壁超微结构改变等表型变化(Raes
等2003)。CsPAL基因家族全部成员在黄瓜不同组
织中均能表达, 且有多个基因的表达能够响应逆
境胁迫或激素处理(Shang等2012)。植物PAL蛋白
通常以同源四聚体形式发挥功能, 而在原核细胞
中共表达烟草不同PAL蛋白时, 能够产生具有相似
催化活性的异源四聚体(Reichert等2009), 据此推
测, 葡萄PAL基因家族不同成员在相同组织的共表
达可能具有重要生理意义。尽管葡萄各个PAL基
植物生理学报206
因在‘赤霞珠’葡萄果实发育过程中的表达模式较
为相似, 但各成员表达水平及其对逆境胁迫的响
应模式均存在显著差异(图4、5和6), 可能是由于
各基因启动子顺式作用元件的差异所致。
VviPAL2和VviPAL17基因转录起始位点下游的5′非
编码区分别包含2个连续的转录增强元件5UTR
Py-rich stretch (Daraselia等1996), 该元件的存在与
两基因在葡萄果实及其他组织较高的表达水平密
切相关。同时, VviPAL2和VviPAL17基因在不同发
育期的葡萄果实中的表达变化与果实中相应产物
积累的对应关系证明, 两基因可能在葡萄果实酚
类物质生物合成过程中发挥主导作用。
光照和温度是影响葡萄果实中糖酸代谢以及
酚类物质等次生代谢产物合成和积累的重要环境
因素(Downey等2006)。本研究结果表明, 对转色
期‘赤霞珠’葡萄果实进行曝光处理能够加速果实
中酚类物质的合成, 而遮光则具有延迟作用, 与前
人报道的结果基本一致(Koyama和Goto-Yamamoto
2008; Li等2013)。VviPAL2、VviPAL4和VviPAL7基
因在光照处理葡萄果实中的表达变化与产物积累
正相关, 其启动子序列中分别存在多种类型的光
响应元件(表3), 可能对于不同光照水平下的基因
转录调控具有重要作用。已有的研究表明, 温度
对黄酮醇和PA合成的影响较小, 但低温和高温能
够分别促进和抑制转色期至成熟期葡萄果皮中花
色苷的合成与积累(Spayd等2002; Yamane等2006;
Cohen等2012)。除了受花色苷合成分支途径的关
键结构基因类黄酮葡萄糖基转移酶(UDP-glucose:
flavonoid 3-O-glucosyltransferase, UFGT)表达的直
接调控(Yamane等2006), 上游代谢途径中PAL基因
家族成员VviPAL15的表达活性及其底物L-Phe的浓
度(数据未呈现)在高温和低温处理后的葡萄果实
中的变化也是导致不同温度下生长的葡萄果皮花
色苷积累差异的可能原因。
本文全面分析了葡萄PAL基因家族的组成、
染色体定位及其进化关系, 并对葡萄果实中表达
的5个PAL基因的结构、上游启动子调控元件、表
达谱以及基因表达与产物积累的相关性等方面进
行了综合研究。然而, VviPAL基因启动子在光照和
温度处理下的活性变化以及VviPAL蛋白在体内和
体外的催化活性仍需实验验证。此外, VviPAL基因
对紫外辐射、干旱、高盐、病原菌、机械损伤等
逆境胁迫和乙烯、ABA、SA、MeJA等激素处理
的响应模式, 以及葡萄PAL基因家族其他成员在果
实中的潜在功能仍需进一步详细研究。
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SUN Run-Ze1, ZHANG Xue1, CHENG Guo1, LI Qiang1, ZHU Yan-Rong1, CHEN Wu2, PAN Qiu-Hong1, DUAN Chang-Qing1,
WANG Jun1,*
1Center for Viticulture and Enology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing
100083, China; 2CITIC Guoan Wine Co., Ltd., Manasi, Xinjiang 832200, China
Abstract: Phenylalanine ammonia-lyase (PAL), the first enzyme in the phenylpropanoid pathway, plays critical
roles in plant growth, development and resistance to biotic/abiotic stresses. In this research, a total of 17 PAL
genes were identified from the Vitis vinifera reference genome by the bioinformatics methods. Thirteen of the
VviPAL genes are arranged in tandem in two duplication blocks located on chromosomes 11 and 16, the rests
are randomly distributed on other chromosomes. Phylogenetic tree analysis revealed that most of the VviPAL
members have a closer relationship with PALs from other dicots species, whereas the four VviPALs arranged in
tandem on chromosome 11, which classified into neither the dicot nor monocot group, may serve as ancestral
PALs in plants. The full-length cDNA of five VviPAL genes were isolated from ‘Cabernet Sauvignon’ according
to the reference transcriptome of ‘Cabernet Sauvignon’ grape berries. Sequence analysis of the deduced VviPAL
proteins showed that all of them contain conserved functional domains, confirming that these VviPALs may
have similar functions with PALs from other plant species. Expression profiling reveals that VviPAL2 and
VviPAL15 were strongly expressed in all test organs/tissues, and their expression throughout berry development
was positively correlated with the accumulation of phenolic compounds. Furthermore, the transcripts of
VviPAL2, VviPAL4 and VviPAL7 in grape berries were induced by cluster sunlight exposure and suppressed by
cluster shading, which might contribute to changes in metabolites accumulation.
Key words: ‘Cabernet Sauvignon’; phenylalanine ammonia-lyase; gene family; expression profile; phenolic
compounds
Received 2015-11-18 Accepted 2015-12-18
This work was supported by China Agriculture Research System (Grant No. CARS-30).
*Corresponding author (E-mail: jun-wang@cau.edu.cn).