全 文 ：谷胱甘肽发酵过程中的乙醇控制
王 峥，谭天伟，温少红!
（北京化工大学 生命科学与技术学院，北京 !"""#$）
摘 要：在酿酒酵母谷胱甘肽发酵中，比较了乙醇控制在一定浓度和逐步下降两种乙醇控制方式对谷胱甘肽合成
的影响，后者较好。考察了后一控制方法与葡萄糖浓度和流加速率、呼吸商、谷胱甘肽总量和含量的关系，结果表
明，在不添加前体氨基酸的情况下能达到 ! %#" &’ ( )。
关键词：谷胱甘肽；发酵；酿酒酵母；乙醇
中图分类号： *+$#",% 文献标识码： - 文章编号：!%.#/0%.1（#""2）"#/""%2/"2
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谷胱甘肽（’AML;L7:?98，5>N）是一种广泛存在于
活体细胞内的生物活性三肽，其分子中同时含有!/
谷氨酰基和活性巯基，由于具有解毒、抗氧化和防衰
老等重要生理功能，因此在医药、食品以及化妆品等
领域将具有十分广阔的应用前景。对于谷胱甘肽的
生物法生产，日本学者们早在 #" 世纪 %" T $" 年代
就申请过多项专利，并实现了工业化生产，但迄今为
止，对谷胱甘肽的研究依然是生化工程领域的一个
热点。日本学者 >;Q;L?等［!］通过在线监测发酵液中
氧和乙醇的浓度，运用前馈 (反馈控制系统控制葡萄
糖的流加速率，发酵完毕后 5>N产量为 # 0%" &’ ( )，
细胞内 5>N含量达 0. &’ ( ’，这是所有报道中结果
最好的。-AB;B;J;等［#］人对乙醇浓度进行模糊控制，
把乙醇控制在 !" ’ ( ) 左右，5>N 产量提高了 U%V
（质量分数），说明乙醇的控制对 5>N的发酵有很大
的益处。国内的学者也开始了 5>N发酵方面的工
作［0］，所报道的最高产量是用大肠杆菌基因工程菌
所产的 11" &’ ( )［2］。本文通过控制乙醇的逐步下
降来控制发酵过程，在不添加氨基酸的情况下，较大
地提高了 5>N的产量。
: 材料和方法
!,! 菌株
酿酒酵母（!"##$"%&’(#)* #)%)+,*,") ）5/!2，5>N积
累株，本实验室保藏。
! 收稿日期：#""2/"0/!#
基金项目：国家 1%0项目（#""#--#!."##）和国家自然科学基金（#"0"%""#）
作者简介：王峥（!$1"/），男，浙江永康人，硕士研究生，研究方向：微生物发酵。
联系人：谭天伟（!$%2/），男，博士，教授，研究方向：生物化工，=/&;:A：LX;E #""2
·%2·
生 物 加 工 过 程
@7:98K8 Y?MJ9;A ?B F:?RJ?C8KK =9’:988J:9’
第 #卷第 #期
#""2年 U月
万方数据
!"# 培养基及培养条件
斜面培养基：麦芽汁 !$ % & ’、酵母粉 ( % & ’、蛋白
胨 ) % & ’、葡萄糖 !$ % & ’、琼脂 #$ % & ’。
种子培养基：葡萄糖 ($ % & ’、酵母粉 * % & ’、磷酸
氢二铵 ( % & ’、硫酸镁 $"+ % & ’、磷酸氢二钾 ! % & ’、磷
酸二氢钾 ! % & ’。
发酵培养基：葡萄糖 ,$ % & ’、酵母粉 !) % & ’、麦
汁 *$ % & ’、磷酸氢二铵 !$ % & ’、硫酸镁 )% & ’、糖蜜 #+
% & ’、玉米浆 !* % & ’、磷酸氢二钾 ! % & ’、磷酸二氢钾 !
% & ’、-.# / !$ 0% & ’、12# / * 0% & ’、34# / *0% & ’和 5.# / *
0% & ’。
流加培养基用质量浓度为 *$$ % & ’的葡萄糖。
斜面种子活化 ! 6 后接入种子培养基，($7、
!+$ 8 & 09.下培养 #: 6。
!"( 分析方法
!"("! 细胞干重（;8< 32== >29%6?）!"# 的测定
取一定体积的发酵液离心后收集菌体，用去离
子水洗两次后 !$)7下烘 # 6后称重，计算出细胞的
质量浓度。
!"("# 葡萄糖浓度的测定
酶膜法：（生物传感分析仪 @AB—:$3，山东省农
科院）。
!"("( 谷胱甘肽的测定
B’’CDBE法［)］
!": 发酵罐培养
全自动发酵罐 ) ’（上海保兴）中装液量 # ’，接
种量 !$F（体积分数），前 # 6搅拌转速为 #$$ 8 & 09.，
之后按每 6提高 !$$ 8 & 09.逐步提高到 * 6的 *$$ 8 &
09.，以后一直维持在 *$$ 8 & 09.，通气量为 # ’ & 09.，
温度控制在 ($7，GH 值采用氨水控制在 )":左右，
外接乙醇在线测定仪（华东理工大学，上海）。
!") 胞内谷胱甘肽的提取
发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤 ( 次
后，在 :$F（质量分数）乙醇中 ($7下抽提 # 6，离心
取上清液进行分析。
! 结果与讨论
#"! 乙醇浓度与谷胱甘肽生成的关系
在酵母的发酵过程中乙醇的产生速率说明初级
代谢的方向，其浓度主要受到氧的供给和葡萄糖流
加速率影响。在图 ! 中可以看出在 I@H发酵的最
初阶段，葡萄糖浓度较高产生 38JK?822葡萄糖效应，
乙醇含量一直上升，到 L 6左右达到最大值。随后
流加开始进行。在乙醇控制在 )F（质量分数）左右
的情况下，谷胱甘肽总量缓慢增加，而在控制乙醇逐
步降低的条件下，谷胱甘肽增长速度较高，到 (* 6
图 ! 发酵过程中乙醇控制方式与 I@H合成的关系
#$$:年 )月 王 峥等：谷胱甘肽发酵过程中的乙醇控制 ·*)·
万方数据
!"#$% &’’()* +’ ,+-(./ +’ (*012+. )+2)(2*31*"+2 )+2*3+.."2# +2 *0( /42*0(/"/ +’ 567
时，后者的产量比前者高 89:，可达 ;98 ,# < =。对
于生物量来说，控制乙醇在 8:比逐步降低长得略
快，到 >? 0后区别不大。
由上述结果说明谷胱甘肽的合成与乙醇的产生
关系较为密切，随着乙醇的消耗谷胱甘肽的总量升
高，反之随着乙醇的产生谷胱甘肽总量下降。因此
可以通过控制乙醇递减来实现谷胱甘肽的高产。
>@> 乙醇浓度与葡萄糖浓度及流加速率的关系
研究发现只有在葡萄糖几乎耗尽，生长停止时，
细胞内才开始大量合成 567。为提高细胞 567的
含量，一般采用后期限量流加葡萄糖的方法，可以消
除底物抑制、达到高密度细胞培养、延长 567的生
产时间。我们通过控制乙醇浓度逐步下降的方法使
得葡萄糖浓度控制在较低的水平。
图 > 是乙醇浓度与葡萄糖流加速率之间的关
系，从图中可以看到，由于初糖浓度较高，导致了葡
萄糖效应，乙醇浓度急剧上升。%9 0后乙醇浓度达
到最高点，同时葡萄糖浓度下降到 > # < =左右。此
时开始流加葡萄糖并控制流加速率，使得乙醇浓度
按照一定的速度逐步下降。使用该方法，葡萄糖浓
度能控制在较低水平，从而可提高发酵过程的 567
的总量（如图 %所示）。
图 > 乙醇质量分数及流加速率的关系
!"#@> A(.1*"+2 B(*C((2 (*012+. )+2)(2*31*"+2 12- ’((- 31*( +’ #.D)+/(
>@E 乙醇浓度与 !" 之间的关系
根据 61F1*+等［%］的研究，!" 控制在 9@G到 9@;
之间有利于谷胱甘肽的合成。发酵进行到 %? 0后，
H7基本上控制在 8@?左右，其变化对 IJ> 生成影响
较小，因此对 !" 的影响也是较小。从图 E 中可以
看到随着控制乙醇浓度逐步下降，!" 值除了个别
点较高以外，基本都控制在 9@G K 9@;之间。说明控
制乙醇的下降的方法能较好的控制 !" 值，实现
567产量的提高。
>@? 乙醇浓度与 567的总量和含量的关系
从图 ?中可以看到，采用控制乙醇逐步下降的
反馈流加方法，适当的延长发酵时间后，对 567总
量和含量的提高仍然有促进作用。在 8> 0后，567
总量能达到 %G>9 ,# < =，干重 %?9 # < =。
·GG· 生物加工过程 第 >卷第 >期
万方数据
图 ! 乙醇与 "#的关系
$%&’! ()*+%,- *+ -./01*, 2*12-1.)0.%*1 013 "#
图 4 567总量及含量与乙醇的关系
$%&’4 "-,0.%*1 8-.9--1 2*1.-1. *+ 567 *) .*.0, 567 013 -./01*, 2*1.-1.
! 结论
综上所述，在酿酒酵母发酵生产 567过程中采
用控制乙醇逐步下降的流加方式，:; /后能把葡萄
糖浓度控制在 < & = >以下，!" 值基本处于 ;?@ A ;?B
内，利于 567的合成，得到的 567总量较高。该控
制方式操作简单，易于工业化放大。若通过进一步
对前体氨基酸的添加控制，567发酵水平还可望进
一步提高。
参考文献：
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