全 文 ：第6卷第3期
2008年5月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Mav2008
· 39·
螺旋藻中O／．．葡萄糖苷酶抑制剂的提取及动力学
张 哲，王 曼，尹鸿萍，杨 烨，周雅琼，蔡 寅
(中国药科大学 生命科学与技术学院，南京210009)
摘要：研究与开发了钝顶螺旋藻中的a-葡萄糖苷酶抑制荆。采用氯仿一甲醇溶液浸提、大孔吸附树脂脱色、硅胶层
析柱，SaphedexLH．20柱层析等步骤分离纯化得到ix一葡萄糖苷酶抑制荆；利用紫外及红外图谱分析了所提抑制剂结
构；采用双倒数作图法研究其抑制动力学特性。从螺旋藻分离的理．葡萄糖苷酶抑制剂达到了色谱纯，通过多种色谱
分析，推测该试样为带有共轭体系的多羟基酯类化合物。对a一葡萄糖苷酶具有较强的抑制效果，抑制剂质量浓度为
0．18g／L时，抑制率达73％；动力学研究表明为典型的非竞争性抑制，为进一步的研究与开发奠定了基础。
关键词：甜葡萄糖苷酶；抑制剂；分离纯化；非竞争性抑制；钝顶螺旋藻
中图分类号：TQ460．6；R927．1文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0039一05
Extractionofa-glucosidaseinhibitorfromSpirulinaanditskinetics
ZHANGZhe，WANGMin，YINHong—ping，YANGYe，ZHOUYa—qiong，CAIYin
(SchoolfLifeScienceandTechnology，ChinaPharmaceuticalUniversity，Naming210009，China)
Abstract：Naturald—glucosidaseinhibitorw鹊extractedfromSpirulina．andpurifiedbymacroporousres—
in—absorbingdecoloration，silicagelchrom tography，andSephadexLH-20gelfiltrationinturn．Theac—
tiveinhibitorfractionwasanalyzedbyUVandIR．Theinhibitorykineticswainvestigatedb sonthe
Lineweaver—Burkplot．Amulti-hydroxylestercompoundoftheinhibitorWasproposedaccordingtothe
UVandIRscanprofile．Theinhibitorshowedefficientnhibitoryactiononq·glucosidase．Theinhibitory
rateof73％wasreachedattheconcentrationof0．18s／L．Lineweaver-Burkplotshoweda typicalnon—
competitivenhibitionoftheaturalinhibitorond—glucosidase．
Keywords：Ⅸ一glucosidase；inhibitor；noncompetitive；separation；Spirulina
q一葡萄糖苷酶属于低聚糖水解酶类，包括麦芽
糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶和海藻糖酶等；按照传统
分类属于糖苷酶的第二十类。d．葡萄糖苷酶的主要
生理功能是从多糖、二糖非还原性末端催化水解Ot．
1，4一糖苷键，释放出葡萄糖¨。2J，是人体对淀粉等糖
类物质水解的关键酶。
q．葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型的降血糖药
物，它可通过抑制人小肠刷状缘细胞表面的Ot一葡萄
糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成及吸收，同时增加
肝脏及周围组织对胰岛素的敏感性，减少胰腺刺激
的作用，从而起到降糖及治疗糖尿病的目的口。J。
另外，Ot-葡萄糖苷酶抑制剂还具有抗病毒【5J、抗肿
瘤的作用帕J，其活性也愈发成为药物研究的热点。
在筛选天然的糖苷酶抑制剂方面的研究主要集中
在陆生的动植物中，而从海洋或湖泊活性产物中分
离及筛选糖苷酶抑制剂的工作起步较晚。卜8|。海洋
收稿日期：2007一ll-ll
基金项目：江苏省六大人才高峰基金资助项目
作者简介：张哲(1981一)，男，江苏南京人，硕士研究生，研究方向：生化药物。
联系人：王更，教授，E—mail：waning@publiel．ptt．jB．cn
万方数据
·40· 生物加工过程 第6卷第3期
及湖泊环境的复杂性造就了物质结构及活性与陆
源物质有很大的差异，具有广阔的研究与开发前景。
螺旋藻具有减肥、降糖作用，是广泛应用的保
健药品。本研究提取分离了钝顶螺旋藻中具有较
强抑制a一葡萄糖苷酶的活性组分，并进行了该有效
成分对a-葡萄糖苷酶的抑制动力学研究，可进一步
促进相关有效成分的开发利用，同时为阐明螺旋藻
的药用机理奠定理论基础。
1 实验材料
钝顶螺旋藻为云南施普瑞生物工程公司产品；
仅．D．葡萄糖苷酶(d—D．glucosidaseEC3．2．1．20)，
Sigma公司；4一硝基苯一Ot—D一吡喃葡萄糖苷(PNPG)，
Merck公司；还原型谷胱甘肽(GSH—reduced)，Amo—
resco公司；大孑L吸附树脂AB-8，安徽三星树脂科技
有限公司。
2 实验方法
2．1 a一葡萄糖苷酶抑制剂活性的测定【91
d．葡萄糖苷酶活性的测定：以0．7mmol／L
PNPG的底物，在含0．1mmol／L谷胱甘肽，O．5
mmol／L(pH6．8)K3PO。缓冲液体系中加入0【一D一葡
萄糖苷酶(0．1U)，反应体积为2．85mL，37oC反
应20rain，加入4mL的100mmol／LNa2C03溶液终
止反应，于400nm波长处测定在酶催化下释放出硝
基酚的量。在检测体系中以0．5mL的提取物(抑
制剂)替代同体积缓冲液用以测定其活力。
酶活力单位：在37℃、pH6．8条件下，lmin
内水解PNPG释放1Ixmol对硝基酚(PNP)所需的酶
量为1个酶活力单位U。
a．葡萄糖苷酶抑制剂活性：在相同的条件下降
低1个酶活力单位所需的抑制剂的量为1个抑制剂
活力。
抑制率=(抑制剂活力／原酶活力)×100％
2．2螺旋藻中q．葡萄糖苷酶抑制剂的提取
以Bligh．Dyer法¨训稍加改进提取螺旋藻中总
脂溶性组分。将25g螺旋藻粉加入250mL体积比
为2：1的氯仿一甲醇混合溶液中，室温下磁力搅拌6h
后，抽滤取滤液。滤渣再用少量体积比为1：1的氯
仿一甲醇混合溶液抽提2—3次，合并滤液。因粗提
液中色素含量较高，采用大孔吸附树脂AB一8进行
脱色处理，按10g：100mL的比例向滤液中加入预
处理过的大孔吸附树脂AB一8，置于恒温摇床中吸附
6h，抽滤后滤液减压蒸馏，可得固体残留物。将固
体残留物以少量洗脱液溶解后上硅胶(100—200
目)层析柱，按极性分别以500mL氯仿、500mL丙
酮、1 000mL甲醇和丙酮混合液(y(甲醇)：y(丙
酮)=4：6)、500mL甲醇为流动相洗脱，收集各流进
行仅．葡萄糖苷酶抑制剂活性测定。选取抑制活性
最强的组分经蒸馏，残留物溶于少量甲醇，上Sepha-
dexLH一20凝胶层析柱进一步纯化，甲醇为流动相，
流速为18mL／h，测定各流份的d-葡萄糖苷酶抑制
剂活性，绘制洗脱曲线并合并高抑制剂活性组分，
浓缩干燥后获得d一葡萄糖苷酶抑制剂试样。
2．3 HPLC测定仅．葡萄糖苷酶抑制剂试样的纯度
HPLC条件：色谱柱(XTerra@RPl84．6mm×150
mm)；柱温30℃；流动相为60％甲醇水溶液；流速
1 mL／min；进样量20“L；紫外检测器(210nln)。
2．4紫外及红外检测
检测仪器：岛津SPD．M10Avp(PDA)，检测波
段：190—300rim
检测仪器：NlcoletImpact410红外光谱仪，
4000～400cm。1处进行红外扫描。
2．5 0【．葡萄糖苷酶抑制剂的动力学研究
2．5．1抑制剂质量浓度对抑制效果的影响
配制1．60g／L的抑制剂溶液，分别从中取出
25、50、100、250、500斗L加人酶活力测定体系中(系
统缓冲液用量相应减少)，测定其对a一葡萄糖苷酶
的抑制活力。
2．5．2抑制剂作用时间对抑制效果的影响
在试管中加入1．6s／L的抑制剂500“L(终质
量浓度0．28s／L)，分别于37℃保温0、2．0、5．0、
10．0、20．0、40．0min，测定其抑制率。
2．5．3抑制作用类型的确定
在抑制剂量一定的条件下，加入0．70、0．56、
0．35、0．21、0．14mmol／L的底物溶液，测定酶活力。
测定体系中抑制剂总量选用0、0．225、0．30mg3
组，得出3组在不同底物质量浓度条件下的酶活力，
用双倒数作图法确定抑制类型。
万方数据
2008年5月 张哲等：螺旋藻中Ot一葡萄糖苷酶抑制剂的提取及动力学 ·41·
3结果与讨论
3．1 螺旋藻中d一葡萄糖苷酶抑制剂的提取
螺旋藻粉以混合有机溶剂提取并经大孔树脂
脱色后，呈淡绿色，由于待分离物质与色素极性差
别较大，因此脱色过程活性组分的损失很小。螺旋
藻脂溶性粗提物的a一葡萄糖苷酶抑制剂活性如表l
所示，y(甲醇)：y(丙酮)=4：6混合溶剂洗脱组分呈
现了最强的抑制活力，并推测该活性成分具有一定
的极性。其他溶剂洗脱组分尽管也呈现了一定的
抑制活力，但成分复杂有待于进一步研究。
表l粗提物的糖苷酶抑制率
Table1 Percentageinhibitionoffractionsfrom
columnchromatography
甲醇．丙酮混合溶剂洗脱组分经浓缩后，该粗提
液再上SaphedexLH-20层析柱分离，各洗脱组分的
Ot．葡萄糖苷酶抑制剂活性见图1，其中100—200mL
流出流处呈现了很高的抑制剂活力，该组分浓缩干
燥后得到Ot-葡萄糖苷酶抑制剂试样，其提取物抑制
比活力为粗提液的2．3倍。
Ⅵ流出液)／mL
图1 SephadexLH-20洗脱曲线
Fig．ILH-20chromatographyoftheinhibitor
3．2 Ot一葡萄糖苷酶抑制剂试样分析
利用HPLC检测分离纯化的a一葡萄糖苷酶抑
制剂试样的纯度，结果如图2所示。分离试样在
210nm波长呈现单峰，推测分离的ot-葡萄糖苷酶抑
制剂试样具有较高的纯度。
●^
l寸
景饕三摹善 虽
oo一-_N m t一⋯一——i一一 J一
O 2 4 6 8 10 12 14
图2高效液相色谱图
Fig．2HPLCchromatographyoftheinhibitor
a一葡萄糖苷酶抑制剂试样的紫外扫描(190—
300am全波段)图谱见图3。图3中197nnl处有1
个较强的末端吸收峰，而在250—280nm无吸收峰，
由此可以推测该试样不含蛋白质或核酸；
ot．葡萄糖苷酶抑制剂试样红外光谱的特征吸收
见图4。图4中3420cm。1附近峰的吸收带为一OH
的伸缩振动；2954cm卅附近的吸收峰是一CH，的不
对称伸缩振动；2924cm一附近的吸收峰为--CH2一
的不对称伸缩振动；2872cm一附近的吸收峰为
一cH，的对称伸缩振动；2853cm一附近的吸收峰为
一CH：一的对称伸缩振动；1742cm。1可能为酯的
羰基振动峰；1599cm。1附近的强吸收提示可能有
碳碳双键；1456cm。1和1464cm。1左右可能
为一cH，与一cH：的弯曲振动。根据以上分析该d-
葡萄糖苷酶抑制剂试样可能是含有碳碳双键的羟
基酯类化合物。
舳
∞
∞
∞
o
冰、斜磊嚣
万方数据
·42· 生物加工过程 第6卷第3期
3．3 a一葡萄糖苷酶抑制剂的抑制动力学
3．3．1螺旋藻提取物剂量对n-葡萄糖苷酶活力的
影响
由图5可见，加入抑制剂质量浓度为0．04g／L时，
抑制率达到18．4％；加入0．18g／L时，抑制率为
73％，表明该提取物对(It．D．葡萄糖苷酶有较强的抑
制活性。
3．2．2抑制剂作用时间对抑制效果的影响
该提取物质量浓度为0．08s／L时，反应10min
即可以抑制54．9％的酶活力(图6)，说明该0【．葡萄
糖苷酶抑制剂既能快速结合，又能产生较强的抑制
效果。
100
80
蔷60
羹40
20
175 200 225 250 275 300
刀rim
图3紫外全波长扫描图谱
Fig．3UVspectrumoftheinhibitor
3000 2000 l000 0
波数，cm。-
图4红外光谱扫描图
Fig．4IRspectrumoftheinhibitor
0 0．2 0．4 0．6 0．8
p(螺旋藻提取物)他·L-1)
图5提取物剂量对酶活性的影响
Fig．5Inhibitoryeffectsofdifferentamount
onthe12t-glucosidase
100
80
蔷60
薹40
20
0 60
图6作用时间对抑制效果的影响
Fig．6Effectsofreactiontimeoninhibition
反应速度‰随抑制剂浓度增大而变小，而在不同
3．3．3双倒数抑制动力学曲线 抑制剂浓度下q．葡萄糖苷酶的米氏常数K。保持不
3组抑制剂浓度下的抑制双倒数曲线见图7， 变，双倒数曲线交于横坐标上是典型的非竞争性抑
万方数据
2008年5月 张哲等：螺旋藻中Ct．葡萄糖苷酶抑制剂的提取及动力学 ·43·
制动力学曲线。根据非竞争性抑制动力学方程
专=皂(·+等)击+忐(-+罢)
双倒数曲线交于横坐标时，Km=-[S]，S为底物浓
度，Kj为酶与抑制剂复合体的解离常数。
求得Ot—D一葡萄糖苷酶Km=4．167s／L。
图7抑制剂的双倒数酶动力学曲线
Fig．7Lineweaver·Burkplotoftheinhibitor
现有仅-葡萄糖苷酶抑制剂的降血糖作用机理
表明，抑制剂往往与小肠中的a-葡萄糖苷酶的活性
中心部位结合，阻抑酶活性的发挥，为典型的竞争
性抑制¨1|。螺旋藻有效组分呈现非竞争性抑制动
力学特征，可以丰富0【．葡萄糖苷酶抑制剂的降血糖
作用理论。
4结论
钝顶螺旋藻是有效的降糖保健药品，其活性组
分通过有机溶剂抽提、大孔树脂脱色、硅胶柱层析、
SaphedexLH-20柱层析后，得到色谱纯的d一葡萄糖
苷酶抑制剂试样。通过紫外及红外检测表明，该试
样可能为带有共轭体系的多羟基酯类化合物。抑制
动力学研究表明，该提取物不仅对Ot-D一葡萄糖苷酶
有较强的抑制活性，还呈现了典型的非竞争性抑制
动力学曲线，k=4．167g／L。
参考文献：
[1]GaoH，HuangYN，GsoB．d-glueosidaseinhibitioryffectby
theflowerbudBofTussilagof rfare[1]．FoodChemistry，2008
(106)：1195—1201．
[2]LuoJG，WangxB，MaL．Anoveld·gluo∞ida的inhibitioryey-
diepeptidefromthe眦ofGypsophilaoldhamiana[J]．Bioor-
ganic＆MedicinalChemistryLetters，2007，17：4460-4463．
[3]Horiis，FukaseH．Synthesisofa删ucosidasejJllljbjtnryactivityof
N·substitutedvaliolaminederivatives∞potentialoralantidiabetie
agents[J]．TheJounudofMedicalChemistry，1986，29：
1038—1046．
[4]张远超，陆付耳．口·葡萄糖苷酶抑制剂治理糖尿病的研究进展
[J]．中国中西医结合消化杂志，2004，12(2)：125—127．
[5]MehtuA，ZitzmannN．Alpha-glucesidaseinhibitors弘potential
broadbasedanti—viralagents[J]．FEBS—Lett，1998，430(1)：17-
21．
[6]OstranderGK，$cribnerNK．InhibitionofV．fms．inducedtumor
酬innudemicebycastamospermine[J]．CancerResearch，
1988，48：1091·1094．
[7]陈海敏，严小军，林伟．et一葡萄糖苷酶抑制剂类药物的研究进
展[J]．海洋科学，2005．29(11)：73-76．
[8]SeoEJ，Curtis—LongMJ，LeeBW．Xanthones如mCudraniaTn．
euspidatuisplayingpotentCt—glucosidaseinhibition[J]．Bioorgan—
ie＆MedicinalChemistryLetters。2007(17)：6421-6424．
[9]ChapdelaineP，TremblayRR，DllbeJY．p-Nitrophenol-a-D—91．-
cepyranoaide∞substrateformeflsul℃mentofmaltasectivityn
human髀men[J]．ClinicalChemistry，1978，24(2)：208-211．
[10]Bl砷E：，DyerWJ．Arapidmethodoftotallipidextractionand
purifieatfon[J]．CanJ BiachemBiophysiol，1959，37(8)：
911-920．
[11]XiaoSz．a—Glueosidaseinhibitor[J]．JJapaneseMedicine，
1999，20(1)：22-24．
万方数据