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Varied local compositions of corn stover and their effects on pretreatment

L-抗坏血酸洛芬酯非水相酶促合成的动力学与热力学



全 文 :第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3 ?#6!3%&% ?%# ?%"(&7!0%#男#山东烟台人#硕士研究生#研究方向"药物合成与生物催化技术&汤鲁宏$联系人%#副教授#Z-J@C/"B@LX/GJ1L3AFJ
! 抗坏血酸洛芬酯非水相酶促合成的动力学与热力学
刘信宁#汤鲁宏
江南大学 医药学院#无锡&0&%&%%%# ?%% ?%6
M./0F.:15/GF-04I2GK/5I.:127!H51:24JK694270/01F041
1K/F-01.1:5F56KL0GJK 6.9510./BHI0F-K6HBHJ3F5/26
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JF/,JCL!X% 世纪 !% 年代 R@a@等*&+相继发现一些
酶在无水的环境下仍具有催化活性后#越来越多的
人致力于非水介质中酶结构和功能的研究#使得传
统酶学领域迅速产生出一个全新的分支非水
酶学LFL@dGHFG1HL;KJF/FXK+ (
维生素 *是维持机体正常生理功能的重要维
生素之一#广泛参与机体氧化)还原等复杂代谢过
程*+ #易溶于水#可以很好地被人体吸收( 芳基丙
酸类的非甾体抗炎药具有良好的抗炎)解热和镇痛
作用*0+ #但此类药物都难溶于水#且具有胃肠道副
作用等缺点*(+ ( 为提高该类药物的水溶性和生物
利用度#以便更好地应用于临床#本实验室通过酶
促有机合成技术*#+ #将洛芬类药物))cA%有选择性地结合#合
成一种新的化学单体#以期获得一类水溶性好)生
物利用度高)副反应相对较小的消炎镇痛药物(
本文研究酶)底物)溶剂等多种因素在酶催化
反应中的作用和影响#在此基础上#探讨非水相酶
法合成芬维*酯反应的动力学和热力学机制#以确
定最有效的酶促反应环境(
D?材料与方法
D=D?试剂
脂肪酶8FMF;KJ0(#诺维信公司提供&其余试
剂均为分析纯(
D=B?主要仪器
5SR 型空气振荡器#江苏太仓市实验设备 厂&\ $%%% 型高效液相色谱仪#日本日立公司( DWO?实验方法 由一定量的布洛芬$或酮洛芬)氟比洛芬%和相 应比例的 ! 抗坏血酸及叔戊醇等溶剂组成反应体 系#考察底物浓度)溶剂)酶质量分数)反应温度)摇 床转速对反应速率的影响( DWP?分析方法 薄层层析法#$## 二氯靛酚显色法*6+ #高效液 相色谱法( DWR?定量方法 根据高效液相色谱已建立的芬维 *酯的标准 曲线#利用峰面积积分法计算所生成的芬维 *酯的 质量分数( B?结果与讨论 BWD?摇床转速对芬维,酯合成反应速率的影响 在其他条件均相同的情况下#在 % i$(% E,JCL 范围内测定分别以布洛芬)酮洛芬和氟比洛芬为底 物时摇床转速对反应速率的影响#结果见图 &( 由 图 & 可知"在转速较低时#由于传质阻力大#反应速 率也较低&随着转速增大#反应速率也随之逐渐增 大&当摇床转速增大至$%% E,JCL以上时#反应速率 不再显著增加#说明此时外扩散限制与传质因素对 反应的影响已经可以忽略( 所以#把摇床转速设定 为 $%% E,JCL( 图 D?摇床转速对反应速率的影响 Q.;=D?#70:F12742F54K 1900G2/405:F.2/A062:.FK BWB?温度对芬维,酯合成反应初速率的影响 有机相中固定化酶具有较高的热稳定性#固 定化酶在有机相中的最适温度比水相中的要 高*!+ ( 温度不但影响酶的催化活性和操作稳定 性#也影响底物的状态以及底物和产物的传质速 度( 在其他条件均相同的情况下#在 0( i6% j范 围内测定  种底物的温度对反应速率的影响#实 验结果见图 $( 图 B?温度对反应速率的影响 Q.;=B?#70:F127F0I9045F3402/405:F.2/A062:.FK 0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" ""由图 $ 可知"温度对芬维 *酯的合成反应速率 具有较大的影响( 随着温度的升高# 种底物合成 ! 抗坏血酸棕榈酸酯的反应速率都迅速升高( 当 分别达到最适温度后#随着温度的继续升高#反应 速率反而迅速降低(  种底物合成芬维*酯的最适 温度分别为 #()#%)#( j( B=O?酶的添加量对芬维,酯合成反应速率的影响 ""在其他条件相同的情况下#分别研究酶的质量 分数对以布洛芬)酮洛芬)氟比洛芬为底物的合成 反应速率的影响#结果见图 ( 由图  可知"随着酶 质量分数的增大#反应速率逐渐加快#当酶质量分 数达到某一值时#反应速率基本保持恒定#这是由 于底物已被酶全部消耗#故酶促反应速率保持不 变( 当酶质量分数达到最适宜浓度#即底物为布洛 芬时 (f#酮洛芬时 6g(f#氟比洛芬时 (f#反应速 率达到恒定( 图 O?酶的质量分数对反应速率的影响 Q.;=O?#70:F127G.7040/F6.9510:2/:0/F45F.2/1 2/405:F.2/A062:.FK BWP?底物$!%浓度对芬维,酯合成反应速率的影响 ""在 ! 抗坏血酸和酶量等其他条件相同的情况 下#改变  种底物的浓度#测出相应的反应速率#结 果见图 0( 由图 0 可知"合成反应速率随着底物浓 度的增大而加快( 此后#反应速率变化的趋势逐渐 变缓#最后达到一最大值( 继续增加底物浓度时# 反应速率反而下降#这可能是由于底物的抑制作用 导致的*7+ ( 故应以出现最大值时的浓度为反应最 适宜底物浓度#若再增大底物浓度#不仅使分离提 纯过程复杂化#并有可能减小反应速率( BWR?反应溶剂对芬维,酯合成反应速率的影响 溶剂也是影响反应的一个重要因素#反应体系 中加入溶剂后#反应底物的浓度降低#与酶接触的 表面积增大#转化率明显提高( 不同溶剂对脂肪酶 酯化反应的影响是由于溶剂的疏水性不同引起的( 图 P?底物浓度对反应速率的影响 Q.;=P?#70:F12713J1F45F0:2/:0/F45F.2/1 2/405:F.2/A062:.FK 此反应底物是由维生素 *和洛芬类药物组成#两类 底物分别为亲水性与疏水性的物质#作为反应底物 互不相溶( 因此#需选择有一定亲水性$即有一定 极性%的溶剂#这样对维生素 *有一定溶解性( 同 时极性又不能太强#否则极易造成酶的失活( 实验 所选用的脂肪酶8FMF0( 在不同有机介质中催化维 生素*与布洛芬的反应初速率如表 & 所示( 表 & 结 果表明"在叔戊醇)叔丁醇)甲苯)丙酮中#由 8FMF 0( 催化的反应均可以发生#反应相对初速率各不 相同#而在氯仿中#催化反应不能发生( 表 D?溶剂对反应速率的影响 E5J60D?#70:F12724;5/.:126A0/F12/405:F.2/A062:.FK 溶剂 反应速率,$ # JF/!JCL ?& !X ?& % 叔戊醇 %g6 叔丁醇 $(g# 甲苯 &%g 丙酮 &7g! 氯仿 % BW@?动力学参数的确定 在传统的水溶液体系中#酶催化反应符合经典 米氏方程#而在非传统反应介质中#由于在有机溶 剂中的不溶解性#酶以分散的固相参与反应#反应 本身为非均相#反应机制变得更加复杂#应当考虑 传质等因素对反应的影响( 在反应过程中#若底物 或产物在液相主体和固定化酶外表面之间存在着 浓度梯度时则会引起外扩散( 同时#固定化酶催化 的反应与固定化酶颗粒内部的物理结构常数)反应 物系的性质等因素有关时会影响其内部阻力的变 化而发生内扩散*7+ ( 由 $g& 可知#提高摇床转速能 够减少外扩散与传质引起的传质影响&由 $g 可知# ("第 # 期 刘信宁等"! 抗坏血酸洛芬酯非水相酶促合成的动力学与热力学 酶的添加浓度在最适浓度范围之内时#随着酶浓度 的增加#反应速率逐渐加快#并且呈现线性关系( 这说明内扩散对整个反应的影响不大#反应主要是 由动力学所控制( 因此#建立以下动力学模型可忽 略扩散以及传质对反应速率的影响( $g#g&"无底物抑制的浓度范围及其动力学常数 脂肪酶催化反应符合双底物=CLX-=FLX` C-`C反 应机制方程*&%+ #经过脂肪酶 $Z%先与芳基丙酸 $4*++S%结合形成脂肪酶 酸复合物$Z-4*++S%# 接着该复合物转变成酰基脂肪酶中间体$Y%#在释 放出水后#该酰基酶中间体被 ! 抗坏血酸$4q+S% 进攻而形成芬维*酯$4*++4%#并释放出游离的脂 肪酶*&&+ ( 按照上述机制#反应应当符合动力学方程式 ?E ? J@b = J. + . F = J` + ` F& $&% 式中"?为反应初速率# # JF/,$JCL!X%&? J@b 为反应最 大速率# # JFN,$JCL!X%&+ . 和 + ` 分别为 ! 抗坏血 酸和底物的浓度#JF/,N( 通过 $g0 中已经测定的底物浓度下的反应初速 率#分别作双倒数曲线#结果见图 ( i6( 图 R?布洛芬合成芬维,酯反应的 DY1 ! 与 DY5的关系 Q.;=R?X065F.2/J0FN00/DY1 ! 5/GDY5./1K/F-01.127 ! 51:24JK6.J394270/01F04742I.J394270/ ""由于 ! 抗坏血酸在叔戊醇溶剂中是微溶的#它 在体系中始终过饱和#其浓度可视为恒定#此反应 可看 作 是 单 底 物 反 应( 则 将 式 $ & % 改 为 NCLH_H@MHE-`GEa方程 & ? E = J ? J@b & + ] F & ? J@b%
根据式0"&07-&(&3
*+"苑博华#蔡宇杰#廖祥儒#等3低温脂肪酶的产酶条件优化及其 酶学性质*W+3中国生物工程杂志#%&%#%$%"#6-63
UG@L F`! 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
JHLB@BCFL AFLDCBCFL IFE@AF/D-@ABCMH/C2@1H@LD HL;KJ@BCAA<@E@A-
BHEC;@BCFL*W+3**+"张窻#高蓉3维生素*检测方法研究进展*W+3中国卫生检验
杂志#$%"0(6-0#%3
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*#+"汤鲁宏#张浩#孙云飞3非水相酶促 ! 抗坏血酸棕榈酸酯合成
的动力学*W+3无锡轻工大学学报#$%%%#&7$0%"07-(3
5@LXNG@/K;HD 1KLBWFGEL@/FI[GbCTLCMHE1CBKFINCX07-(3
*6+"汤鲁宏#孙云飞#张浩3薄层扫描法测定 ! 抗坏血酸棕榈酸酯
*W+3食品工业科技#&777#(%"(6-(!3
5@LXNG2@/JCB@BH_CB< BLF/FXKFIYFFD OLDG1BEK#&777#(%"(6-(!3
*!+"夏目西卡玛尔#吾满江艾力3脂肪酶催化合成棕榈酸维生素 *
酯的研究*W+3应用化工#0%"6-6(3
P@Jb)@J@E#[GJ@L C^@LXZ/C3]BGDKFL /C2@1H-A@B@/KBCA1KLBFI!-@1AFE:K/2@/JCB@BH*W+3.22/CHD *0%%6#0$(%"(0%-(03
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7"第 # 期 刘信宁等"! 抗坏血酸洛芬酯非水相酶促合成的动力学与热力学

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