全 文 ：’第5卷第3期
2007年8月
生物加工过程
ChineseJournalofBioproeessEngineering
Aug．2007
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重组蛋白质在酵母表达体系中的高效表达策略
徐寒梅，周 康，沈子龙
(中国药科大学 生命科学与技术学院，南京210009)
摘要：酵母由于其本身的一些优良特性和容易操作性，可以高水平表达重组蛋白，近年来已经有多个酵母表达的
蛋白质多肽类药物上市。作为宿主的酵母最常用的是毕赤氏酵母和酿酒酵母。本文对酵母的一般特性、酵母表达
操作、密码子、载体和表达策略、两种不同酵母表达系统的特点等进行了论述，供研究者进行酵母高效表达体系的
选择与操作参考。
关键词：酵母；表达；启动子；密码子；载体
中图分类号：TQ786 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)03—0001—05
Theyeastexpressionsystemforecombinantprotein
XUHan—mei，ZHOUKang，SHENZi—long
(SchoolfLifeScienceandTechnology，ChinaPharmaceuticalUniversity，Naming210009，China)
Abstract：Quiteafewpeptideremediesproducedbytheyeastexpressioncomeintothemarketrecently，
becausethyeastexpressionsystemeasilyhandledwithexcellentcharacteristicandproducingrecombi—
nantproteinw thhilghyield．ThemethylotrophicyeastP．pastorisandS．cerevisiaearencommonuseas
thehostforexpressionofheterologouspr tein．Thetraitsofbothexpressionsystemsarecompared；there-
latedcoden，vector，andp omoterardiscussed；theadvancedprotocolof perationandthestrategyforop-
timizafionaresurveyedinthisarticle。
Keywords：yeast；expression；promoter；codon；vector
酵母(Saccharomycescerevisiae)是一种单细胞真
核生物，自然界存在着很大的一个酵母群体。对酵
母的特性进行系统研究是在1970～1980年，随着人
类基因组计划的启动，酿酒酵母在1996年完成了
测序，这是第一个完成基因组测序的真核生物。明
确了酵母的基因序列，就有可能对酵母表达系统进
行不断发展和日趋完善，因此许多具有商业价值的
外源蛋白在酵母系统中得到了成功表达。
酵母表达系统在进行外源蛋白表达的宿主方
面有其特殊的优势：遗传背景清楚、快速、操作简
单、容易放大⋯；调控型启动子如乙醇氧化酶基因
(alcoholoxidaseI，AOXl)特别适合控制表达外源基
因心-3]；合成的外源蛋白Ⅳ|端糖基化部分类似于哺
乳动物体内合成蛋白的糖基化状态Ho；喜欢有氧生
长的生理特性，有助于促进其高密度培养，如Pichia
pastoris发酵后能够达到130g／L干细胞重口o，这种
特性特别适合于放大生产；酵母表达产物无内毒
素、致瘤物质、病毒DNA等，由于其千百年来在食品
工业的应用，一直具有GRAS称号(GenerallyReg r-
dedAsSafe)，是一种安全的表达宿主。
收稿日期：2007-04·10
作者简介：徐寒梅(1966一)，女，内蒙古赤峰人，博士，副教授，研究方向：生物化学与分子生物学。
联系人：沈子龙，教授，E—mail：Zilongshe@sina．com
万方数据
· 2 · 生物加工过程 第5卷第3期
1酵母菌的生殖方式
酵母菌在自然界中分布很广，是单细胞真核微
生物。酵母菌有多种繁殖方式，有人把只进行无性
繁殖的酵母菌称作“假酵母”，而把具有有性繁殖的
酵母菌称作“真酵母”。酵母菌的无性繁殖有芽殖
和裂殖两种方式，最常见的无性繁殖方式是芽殖，
裂殖是少数酵母菌进行的无性繁殖方式，类似于细
菌的裂殖。
酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行
有性繁殖。两个临近的酵母细胞各自伸出一根管
状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个
通道，两个细胞核在此通道内结合，形成双倍体细
胞核，然后进行减数分裂，形成4个或8个细胞核。
每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢
子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。
2酵母表达的实验操作
在转化酵母时，由于酵母有复杂的细胞壁，比
大肠杆菌转化困难。最初采用原生质法，但这种方
法需要去掉细胞壁才能使DNA进入细胞，细胞只有
通过再生细胞壁后才能表达抗性基因，直接将原生
质涂板于含有抗生素的培养平板上，会导致细胞死
亡；因此原生质法转化效率低，难控制。目前酵母
转化一般采用电转化或离子(“+，Cs+)转化的
方法。
3酵母表达载体
酵母表达载体按照复制形式分为整合型载体
(yeastintegrationplasmid，YIP)、自主复制型载体
(yeastreplicatingplasmid，YPP)、酵母着丝粒质粒
(yeastcentromericplasmid，YCP)、酵母附加体型载体
(yeastepisomalplasmid，YEP)及酵母人工染色体
(yeastartificialhromosome，YAC)等。用于表达外源
基因的载体通常是综合了整合型载体、自主复制型载
体或其他类型载体的功能而改造来的，目前常见的表
达载体有pPICZ／pPlCZot，pGAPZaA，B，C，pPIC3，
pPIC9，pHIL—D1，pA0804，pA0815，pPSC3K等。
以pPICZ／pPICZoL载体为例，它是一种调控表
达的载体，具有Zeocin抗生素选择标记基因，可以
不需要在缺陷培养基中就能直接选择重组子，同时
也能在大肠杆菌中进行筛选；该载体以乙醇氧化酶
I基因AOXl为启动子，在甲醇的诱导下进行表达；
C一端连接有c—myc表位和6个组氨酸(6xHis)序列，
可以进行有效的检测和快速纯化重组蛋白；5’
AOXl基因为整合介导区，与受体菌株有着同源序
列，用于将目标基因序列与酵母基因组进行重组；
pPICZcY载体还含有Ot—factor分泌信号，进行重组蛋
白的分泌表达。
还有一些Pichia表达载体采用甘油醛一3一磷酸
脱氢酶(glyceraldehyde-3一phosphatedehydrogenase，
GAPDH)的基因GAP的启动子(PGAP)，此启动子
构成组成型表达，有时对某些蛋白质的表达效率甚
至高于AOXl启动子，如pGAPZ载体系列；有的载
体可以允许提高目的基因在酵母中的拷贝数，从而
提高目的蛋白的表达水平，如pPIC3．5K和pPIC9K
载体具有卡那霉素抗(kanamycin)基因，用于选择整
合了多个拷贝载体的转化子；pA0815载体可以允
许克隆多个目的基因到同一个载体上，筛选是通过
多个插人可以提高对Geneticin的抗性的原理进行
的，此载体还可以控制目的基因的拷贝数；以上3个
载体也是以AOXl为启动子，通过诱导进行目的蛋
白的表达；3’AOXl基因用于将目标基因序列与酵
母基因组进行重组。
4启动子
由于酵母对异种生物的转录调控元件识别和
利用效率很低，所以表达盒中的启动子、分泌信号
序列及终止子一般来自酵母本身。启动子是其表
达盒的核心元件，在其上游具有激活序列(UAS)、
阻遏序列(URS)，其功能是结合调控蛋白；下游有
转录起始位点和TATA序列，为转录因子结合区。
许多甲基营养型酵母在生产重组蛋白时离不
开强的、调控型启动子，这些启动子中许多是与甲
醇利用途径相关的基因(methanolutilisationpath—
way，MUTpathway)。甲基营养型酵母的MUT表达
在转录水平受到严格的调控拍J，一部分的MUT是在
微体中进行的，依赖于甲醇的诱导，通过诱导，其累
积量可以占到80％以上的细胞质空间"J。在代谢
途径上，甲醇首先被乙醇氧化酶氧化为甲醛和
H：O：，有毒的H：0：被过氧化氢酶分解为氧气和水。
而甲醛或者被氧化或者被细胞代谢吸收鹋qJ。由于
万方数据
2007年8月 徐寒梅等：重组蛋白质在酵母表达体系中的高效表达策略 ·3·
甲基营养型酵母的MUT特征，而得到广泛的应用：
因为起始甲醇的利用是在微体中进行的，而甲醇是
其唯一的碳源，因此甲基营养型酵母被作为模式生
物研究微体的生物起源和功能¨⋯；毕赤酵母还作为
模式生物研究早期分泌途径u1|。甲基营养型酵母
的主要应用还是在重组蛋白的生产中¨2。14o，目前
已经有几百个不同的蛋白质在甲基营养型酵母中
得到了表达，一些这类基因的启动子区域都得到了
分离和克隆¨5|，特别是毕赤酵母乙醇氧化酶IAOXl
基因的启动子、一些其他甲基营养型酵母的相关基
因的启动子，已经被应用于在酵母中表达重组蛋
白L16I。如在且polymorpha中，常使用FMD(formate
dehydrogenase)启动子进行重组蛋白表达H7I。DAS
启动子也是一个调控型的启动子，有时可以代替
AOX启动子，在P．pastoris和C．boidinii中其作用效
果甚至比AOX启动子还强。FLD和FDH基因通常
是用氮源如甲胺或胆碱来诱导，在C．boidinii中
FDHl启动子也有用甲酸盐来诱导的。
使用不同调控类型的启动子可以扩展酵母系
统在重组蛋白生产中的应用范围；另外，识别和确
定启动子序列的调控区域、DNA结合蛋白和各自的
信号途径有助于更好地改造启动子并加以应用，这
方面还有许多研究有待进行。
5密码子偏好性
酵母识别的密码子与大肠杆菌系统和高等生
物有所不同H8|，因此在酵母中表达外源基因时需要
进行基因序列分析，尽量采用酵母系统的密码子，
需要时可以通过人工合成的方法来获得目的基因
进行克隆。因为Cyt2Aal基因中(A+T)含量很高，
连续多个腺苷酸会导致酵母转录提前终止。文
献¨副根据P．pastoris酵母喜好密码子，将基因的(A
+T)含量从70％降低到50％，只保留了18．5％的
原来基因的密码子。合成中N端起始的50～75个
核苷酸要确保其对应的mRNA(特别是在翻译起始
密码子附近)不会形成稳定的二级结构，文献[18]
使用了GeneticsComputerGroup(GCG，Wisconsin
Packageversion10．2-UNIX，Madison，WI)软件包进
行辅助设计，将设计的基因合成57～71个核苷酸
大小的片段，3’端含有19～23bp的重复碱基，通过
recursivePCR将所有片段连接扩增出Cyt2Aal
基因。
6提高目的蛋白表达水平和质量的策略
对于每一种不同的蛋白质在酵母中表达，都是
一个新的课题，没有一成不变的模式能够确保表达
成功；利用酵母进行重组蛋白生产，只有表达产量
和质量都合格才能够得到应用。酵母对外源基因
的表达水平受很多因素的影响，在基因水平上，提
高和控制外源基因的转录水平是提高表达水平的
有效方法之一，所以筛选高效启动子就十分重要；
另外，表达载体在细胞中的拷贝数和稳定性对外源
基因在酵母中的表达有明显影响。在蛋白水平，要
考虑表达产物的可靠性问题，其中包括外源基因在
表达系统中的遗传稳定性、不同生物来源的基因在
酵母中表达后加工和修饰的情况。
当遇到外源重组蛋白的表达产率低，产物无活
性或被降解的情况，或没有检测到蛋白表达，则应
该从以下几个方面进行改进：
(1)确定蛋白是否对酵母细胞具有毒性，如果
有毒性，则选择诱导表达系统。
(2)目的蛋白的水解重组蛋白的稳定性是提高
蛋白表达量的一个重要因素，如果在表达中有蛋白
质降解现象，即使采用高密度培养酵母以提高发酵
液中的蛋白含量，但由于相应的蛋白酶的含量也随
之增加，目的蛋白的积累会受到严重影响。所以细
胞中蛋白酶的水平决定着目的蛋白的最终产量。
为了提高目的蛋白的表达产率，可以采用以下策
略：(a)选择蛋白酶缺陷的菌株，避免表达产物的降
解，提高目的蛋白的积累量；(b)在培养基中添加富
含氨基酸的组分和酪蛋白的水解物，胃蛋白的水解
物，降低对目的蛋白的水解速度；(C)采用非缓冲体
系的培养基，通过pH的改变降低蛋白酶的活性，减
少对表达产物的降解量。
(3)信号肽的选择分泌表达重组蛋白是一种获
得目的产物的理想方法，因为它一方面可以简化后
期的分离纯化工艺，另一方面可减轻细胞的负荷，
提高细胞生产蛋白的能力。还可以减少蛋白酶对
目的蛋白的水解机会。Salma¨引将酿酒酵母的仅一因
子信号肽的前信号序列融合到人肿瘤抑制因子P53
的cDNA区在毕赤酵母中构建MUT8，发现其对人肿
瘤抑制因子P53的表达量比传统中使用的
S．cerevisiaeyP3的表达量高。YuMingmi㈣1在毕赤
酵母中表达来源于Yarrowialipoytica的Lip2酯酶
万方数据
· d · 生物加工过程 第5卷第3期
时，通过导人酿酒酵母仅一因子信号肽，实现了目的
蛋白的高效表达。但信号肽如果选择不佳，会使蛋
白质分泌量少或者没有进行分泌表达。
(4)使用多拷贝序列外源基因在酵母表达系统
中的拷贝数影响外源基因的表达水平，一般来说，
整合的拷贝数越多，蛋白的表达量越大。如鼠的表
皮生长因子(EGF)，人肿瘤坏死因子(TNF)。目前
常用提高外源基因整合拷贝数的方法是：(a)通过
不同的转化方法提高整合拷贝数；(b)在体外载体
上多次插入目的基因片断；(c)将载体中的基因两
端连上来自宿主或其他非必需高重复的基因片断，
通过同源重组而达到高拷贝整合的目的。
(5)提高发酵水平酵母是一类真核生物表达系
统，它能使表达产物糖基化，其细胞的组分和代谢
产物对人体无毒，而且还可以在简单又廉价的培养
基上生长并达到高细胞浓度。因此酵母系统一直
是进行重组蛋白发酵生产的选择。通过选择发酵
参数(温度，时间，pH，通气量等)和改善培养基的组
成，优化发酵工艺，提高发酵产率。甲醇可以诱导
AOX启动子驱动重组蛋白表达，也可诱导蛋白酶的
表达，而用于培养的碳源甘油对AOX启动子有抑制
作用。所以在利用甲醇诱导外源蛋白表达时，要注
意甘油和甲醇的加入量。甘油的添加量应该在诱
导时被消耗尽，而甘油的添加量取决于培养条件和
转化子。
(6)检查是否有提前终止转录发生，如果有，则
要考虑目的基因序列中的AT含量，例如序列中含
有盯TrrATA，类似于HIV一1gpl20基因的AT—
TArITI’ITII^TAAA，会出现提前终止转录。
(7)表达产物的糖基化酵母表达体系有时候会
使表达产物过糖基化，影响表达产物的活性。可尝
试进行胞内表达，不通过分泌表达则蛋白质不会被
修饰；或者采用N．GlycosidaseF对蛋白质进行去糖
基化；也可以改造基因，去除Ⅳ-糖基化位点(Asn．X—
Ser／Thr)。
(8)近期研究表明酵母体系中的蛋白加工和多
腺苷化信号没有哺乳动物的保守，富含AT的基因
簇是实现目的蛋白高效表达的必要条件，其中密码
子的偏爱性和GC含量更能影响目的蛋白的生产。
(9)此外在提高表达产量和质量的策略上也可
以考虑融合充当分子伴侣作用的物质，促进重组蛋
白形成正确的构象。如有研究表明，将人的蛋白质
二硫键异构酶(hPDI)和牛促卵细胞生成激素
(bFSH)共转化毕赤酵母，bFSH的表达量提高到
1．56mg／L，是对照组产量的6倍‘21|。
7 总 结
目前常用于表达外源蛋白质的宿主酵母有酿
酒酵母和毕赤酵母。酿酒酵母有上述酵母表达系
统的优点，但也有不足的地方：在发酵过程中容易
产生乙酸，影响到高密度发酵；蛋白质分泌能力差，
容易使表达的蛋白(即使相对分子质量很小的)停
留在周质空间；产物容易过糖基化，造成人体应用
中产生免疫原性。
目前，甲基营养型酵母在工业上的应用越来越
多，与酿酒酵母相比，它们属于不具有酵解抑制有
氧氧化效应(crabtree—negative)酵母，严格好气的条
件下生长不会产生乙醇，发酵密度高、相应产量高；
毕赤酵母克服了酿酒酵母的缺陷，通过分泌途径对
蛋白质进行翻译后修饰，因此，可以有效分泌表达
复杂的重组蛋白、正确形成分子内和分子问二硫
键，不需要体外折叠复性，甲基营养型酵母的高密
度发酵结合分泌异源蛋白质的能力能使得每升培
养基获得几克蛋白；尽管与酿酒酵母相比，有时会
出现表达产物的过甘露糖化，但甘露糖化与糖基化
的主要区别是免疫原性小；毕赤酵母可以在简单
的、经过选择的培养基中生长，因此只分泌低水平
的内源蛋白，而高水平分泌外源蛋白，这使得目的
蛋白的分离和纯化更加有效。
但甲醇酵母不是食品微生物，发酵中需要添加
甲醇，发酵周期长，这些方面都是今后需要改进的
地方。
无论如何，由于酵母表达外源蛋白、特别是药
用蛋白质的种种优势，促使研究人员不断改进酵母
的遗传特性和生理特性。对于甲基营养型酵母，研
究人员试图通过改造，使其Ⅳ-端糖基化更接近于人
类蛋白的体内糖基化状态，目前已经有一些研究获
得了可喜的进展，如通过改造复杂的高尔基体来源
的聚糖结构为内质网源的聚糖，这种聚糖在高等和
低等生物中都是保守的；还有一项研究是同时合成
半乳糖和唾液酸途径，加入糖后使表达的蛋白质形
成类似于人源性的聚糖结构。这些突破更加提高了
甲基营养型酵母在生产药用蛋白，如治疗用抗体中
的应用前景，改变目前治疗用抗体由大肠杆菌、酿
酒酵母和哺乳动物细胞生产的现状。
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