全 文 ：! 第 " 卷第 # 期
# $$% 年 % 月 生 物 加 工 过 程 &’()*+* ,-./)01 -2 3(-4/-5*++ 6)7()**/()7 809 #$$ %
· :%! ·
固定化赭曲霉 ;茅燕勇，毛! 斌，范伟平!
（南京工业大学! 制药与生命科学学院，南京 #= $$$>） 摘! 要：初步研究赭曲霉 ;<$#=? 固定化细胞的催化转化坎利酮 =="@羟基化的条件。实验表明优化的固定化方法 为：:A的海藻酸钠包埋 =%A的湿菌体，在 :A的氯化钙溶液中固化 = ’。催化转化条件为：B 7 C D坎利酮，4E ?F $，#B G。连续转化 " 批，每批的转化率均超过 B%A。转化获得的羟基化坎利酮粗品经乙酸乙酯提取分离，三次重结晶 后，采用质谱、核磁共振、元素分析等手段对羟基化坎利酮进行结构表征。鉴定结果表明，得到结晶的羟基化坎利 酮含量为 >>F HA，结晶呈浅黄色针状，其表面光滑；结构表征结果确认所制备的物质为 =="@羟基化坎利酮，其熔点 为 #:$ G，在乙酸乙酯中的比旋光度为@=#F BI。 关键词：固定化；坎利酮；=="@羟基化 中图分类号：JK:?HF B；JK$#BF >! ! ! ! 文献标识码：L! ! ! ! 文章编号：=?H# M "?HB（#$$ %）$# M$$:% M$:
%&’()*+,-.’*/+)&’,+0 ==!(123*’420+)&’, ’. 5+,*6,’,6 72 &//’7&0&863 91’06
!"#$%&’(()" *+,%-+$)" 5600-
8LN O0)@9-)7，8LN 3()7，PL; Q*(@4()7
（&-11*7* -2 D(2* R5(*)5* 0)S T’0/U059，;0)V()7 W)(X*/+(Y9 -2 J*5’)-1-79，;0)V()7 #= $$$>，&’()0） :7-)*+5)：3(-@Y/0)+2-/U0Y(-)01 =="@’9S/-Z910Y(-) -2 50)/*)-)* ’0+ [**) +Y.S(*S [9 .+()7 (UU-[(1(\*S ]’-1* 5*11+ -2 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" ;<$#=?^ _Y ]0+ +’-]*S Y’0Y Y’* -4Y(U01 (UU-[(1(\0Y(-) 4/-5*++ ]0+ Y’0Y Y’* ]*Y 5*11+ ](Y’ U0++ 5-)5*)Y/0Y(-) =%A ]0+ (UU-[(1(\*S [9 "A +-S(.U 017()0Y* 0)S +-1(S(2(*S [9 :A 5015(.U 5’1-/(S* 2-/ = ’^ N4Y(U01 U0++ 5-)5*)Y/0Y(-) -2 50)/*)-)* ]0+ =$ 7 C D^ N4Y(U01 4E 0)S Y*U@ 4*/0Y./* ]*/* ?^ $ 0)S #B G ^ J’* 5-)X*/+0Y(-) /Y0* -2 =="@’9S/-Z910Y()7 /0Y* -2 50)/*)-)* *Z5**S*S B%A [9 Y’* 0[-X* (UU-[(1(\*S 5*11+ .)S*/ Y’* -4Y(U01 5-)S(Y(-)+^ L2Y*/ +-1(S@1(‘.(S +*40/0Y(-) 0)S *ZY/05Y [9 *Y’91 05*Y0Y* Y’* 5/.S* ’9S/-Z950)/*)-)* ]0+ -[Y0()*S 0)S 4./(2(*S [9 /*@5/9+Y011(\0Y(-)^ RY/.5Y./01 5’0/@ 05Y*/(\0Y(-) -2 4./(2(*S ’9S/-Z950)/*)-)* ]0+ 5-)S.5Y*S [9 U*0)+ -2 8R，;8a，0)S *1*U*)Y 0++09^ a*+.1Y -2 ETD& +’-]*S Y’0Y 5-)Y*)Y -2 ’9S/-Z950)/*)-)* -2 4./(2(*S 5/9+Y01+ ]0+ .4 Y- >>^ HA Y’/-.7’ Y’/(5* /*@ 5/9+Y011(\0Y(-) () *Y’91 05*Y0Y*^ J’* 4./(2(*S 5/9+Y01+ 044*0/*S 50)0/9 05(5.10/^ _Y ]0+ 4/-X*S Y’0Y Y’* 4/-S@ .5Y -2 [(-@50Y019\*S -Z(S0Y(-) [9 (UU-[(1(\*S ]’-1* 5*11+ ]0+ =="@’9S/-Z950)/*)-)*，(Y+ U*1Y()7 4-()Y ]0+ #:$ G，0)S (Y+［"］#$b () *Y’91 05*Y0Y* (+ M =#^ B#%I^ ;62 9’*3-：(UU-[(1(\0Y(-)；50)/*)-)*；=="@’9S/-Z910Y(-) ! ! 坎利酮（50)/*)-)*）是一种心血管药物，其 =="@ 羟基化后是合成依普利酮（*41/*)-)*，一种高效的治 ! 收稿日期：#$$ %@$%@=% 作者简介：茅燕勇（=>HH@），男，硕士生，主要从事酶催化不对称合成方面的研究。 联系人：范伟平，$#%@B"%BH"">，P]4\’.c +-’.F 5-U万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $卷第 % 期 疗心血管疾病的药物［&，%］）必不可少的关键前体化 合物。目前报道坎利酮的 &&!’羟基化主要由赭曲 霉游离细胞催化转化完成［$］，该反应如图 & 所示。
! ! 但赭曲霉生长产生的红色色素［"］给后续产物
分离带来困难，严重影响产品的收率和生产成本。
为此，本文研究固定化赭曲霉细胞催化转化制备
&&!’羟基化坎利酮的技术，以期简化分离工艺，减少
杂质，降低生产成本［(］。
!" 材料与方法
&) &! 材! 料
&) &) &! 菌种与培养基
菌株：赭曲霉（!"#$%&’(()" *+,%-+$)"）*+,%&#，本
实验室筛选保藏。
斜面培养基：-./培养基。
发酵培养基（0 1 2）：葡萄糖 &,，玉米浆 &(，酵母
膏 &) ,，34 () 5，&%& 6 ,) & 7-8灭菌 &( 9:;。
转化培养基（0 1 2）：葡萄糖 (，玉米浆 &(，酵母
膏 &) ,，坎利酮 &,，七水硫酸镁 ,) <，34 () 5，超声处
理（&%) " = 1 >9%）&, 9:;。
&) &) %! 主要仪器与试剂
仪器：4?+’/ 全温摇瓶柜；@A/’", 生物传感
仪；BC’"< 冷井；=8DEFG /22H/*IJ %#<, 液相色谱
仪，K-&5 柱；/L ",,, 型质谱分析仪；-JKBH*’ J2’
7JK %",,’"型元素分析仪；AKMIBJK /N ",, 型
核磁共振仪；@+= O’" 型显微熔点仪；P/@IQ -’&,%,
型全自动旋光仪。
试剂：坎利酮（<5) RS）；聚乙烯醇（-N/’&%"）；
钠型 B’卡拉胶；海藻酸钠（I) -) ）；玉米浆（A) K) ）；
酵母膏（A) K) ）；其余试剂均为分析纯。
&) %! 方! 法
&) %) &! 赭曲霉 *+,%&# 的培养
孢子接种于斜面，%5 6扩增 ( T R U，扩增孢子
制成孢子悬浮液（&,5个 1 92）后按 RS接种量，温度
%5 6下 &(, F 1 9:;培养 %" V，抽滤得湿菌体，洗涤后
备用。
&) %) %! 细胞的固定化
聚乙烯醇’硼酸凝胶：5 0 聚乙烯醇加 R( 92 无
菌水，5, 6搅拌溶解，冷却至 ", 6 后与菌悬液（&(
0湿菌体加 %( 92无菌水）混合均匀，用 5W注射针头
滴入 (S硼酸溶液中，" 6放置 & V，制成直径 % 99
左右的颗粒。
卡拉胶凝胶：$0 钠型 B’卡拉胶加 R( 92 无菌 水，", 6搅拌溶化，$, 6保温；再与 $, 6保温的菌 悬液（同上）混合均匀，用 5 W注射针头滴入 ,) &( 9XY 1 2 B%@Q"溶液中，" 6放置 & V，制成直径约 % 99的颗粒。 海藻酸钙凝胶："S的海藻酸钠溶液 R( 92 与菌 悬液（同上）混合均匀，用 5W注射针头滴入 (S的氯化 钙溶液中，静置固化 & V，得到直径约 % 99的颗粒。 &) %)$! 固定化细胞转化方法
分别将“&) %) %”中制备的固定化颗粒加入含
&,, 92转化培养基的 (,, 92摇瓶中，%# 6，&(, F 1
9:;转化 "5 V，过程中控制葡萄糖浓度在 %) ( T () ,
0 1 2之间［#］。
&) %) "! 转化率的测定
采用文献［R］的 4-2I法测定。
&) %) (! 坎利酮及产物溶解度的测定
按文献［5］的方法测定坎利酮及产物粗品在乙
酸乙酯中的溶解度。
&) %) #! 产物纯品的制备
转化结束，单层纱布过滤，滤液抽率得到产物粗
品，去离子水清洗两遍后 (, 6真空干燥，测定转化
率。以溶解度为基础，称取一定量粗品于结晶器中，
加入 &,, 92乙酸乙酯，搅拌、升温至 (( 6完全溶解
后在 BC’"< 冷井中控温渐冷至 &( 6，放置 % V，抽滤
晶浆得纯化结晶，(, 6真空干燥后重结晶多次，得
产物纯品结晶。
&) %) R! 产物结构的表征
采用质谱分析（采用文献［R］的方法）、元素分万方数据
! "##$年$ 月 茅燕勇等：固定化赭曲霉 %&#"’( 细胞羟基化坎利酮 · )*! ·
析、核磁共振（+,+-.中，/01 内标，氢谱：)## 023。
碳谱：’## 023。）对产物进行结构表征。
!" 结果与讨论
"4 ’! 固定化方法的确定
"4 ’4 ’! 固定化材料的选择
分别采用 . 种材料对细胞进行了固定化，进行
$批次转化，结果见表 ’。表 ’ 说明海藻酸钙凝胶是 最好的固定化材料。以下实验均采用海藻酸钙凝胶 固定化。 表 ’! 固定化材料对坎利酮 ’’!5羟基化的影响 /67-8 ’! 9::8;< =: >??=7>->36<>=@ ?6<8A>6- =@ ’’!5BCDA=EC-6<>=@ =: ;6@A8@=@8 批次 不同的固定化材料所得到的转化率 F G 聚乙烯醇5硼酸凝胶 卡拉胶凝胶 海藻酸钙凝胶 ’ ).4 ( (’4 " **4 H " ).4$ ("4 * **4 *
. )’4 H $H4 ) *.4 ’ ) ..4 I$#4 ’ $(4 ($ ".4 " ""4 $"(4 * "4 ’4 "! 固定化条件的确定 分别改变海藻酸钠和氯化钙溶液的质量分数为 .G、)G、$G来研究两者浓度配比对首批转化的影
响，结果见表 "。
表 "! 海藻酸钠和氯化钙浓度配比对坎利酮 ’’!5羟基化的影响
/67-8 " ! 9::8;< =: JA=J=A<>=@ =: K=D>L? 6-M>@6<8 6@D ;6-;>L?
;B-=A>D8 ;=@;8@=@ =@ ’’!5BCDA=EC-6<>=@ =: ;6@5
A8@=@8
海藻酸钠
质量分数 F G
氯化钙
质量分数 F G
首批 ’’!5羟基化
转化率 F G
. *I4 .
. ) H)4 )
$H’4 ) . H$4 #
) ) H)4 H
$H#4 ’ 由表 "可知，较适合的海藻酸钠与氯化钙质量分 数分别为 )G与 .G（或 )G）。但第$ 批转化结束后
发现海藻酸钠与氯化钙浓度分别为 )G与 .G时，固
定化颗粒强度较低，在第五批转化中发生破裂。
因此，选择海藻酸钠与氯化钙的浓度均为 )G的固
定化颗粒较为妥当。另外，考察了改变固化时间对转
化的影响，发现固化时间为 (# ?>@比较适合（图 "）。
图 "! 固化时间对坎利酮 ’’!5羟基化的影响
N>M4 "! 9::8;< =: ;=@;A8<>=@6AC <>?8 =@ ’’!5BCDA=EC-6<>=@ =:
;6@A8@=@8
"4 "! 转化条件的确定
"4 "4 ’! 温度和 J2对固定化细胞转化影响
考察了温度和 J2 对固定化细胞转化的影响，
发现最适温度和最适 J2均与专利［’］结果相一致。
"4 "4 "! 底物浓度对转化的影响
"H O，J2 (4 # 条件下用固定化细胞对不同浓度
的坎利酮进行一批次转化实验，结果见图 .。图 .
说明坎利酮浓度超过 H M F P 时，产物的收获量随原
料添加量增加而减少，说明过多底物对转化产生抑
制作用，适合的底物质量浓度应为 H M F P。
—&—转化率；—#—产物质量
图 .! 坎利酮浓度对 ’’!5羟基化的影响
N>M4 .! 9::8;< =: ;=@;8@=@ =: ;6@A8@=@8 =@ ’’!5BCDA=EC-6<>=@
"4 "4 .! 初步优化条件下的转化
初步优化的转化方法：)G 的海藻酸钙包埋
’$G的湿菌体，固化 ’ B，"H O，J2 (4 #，转化 H M F P 坎利酮；进行$ 批次连续转化，每批转化 )H B。结果
如图 )。由图 ) 可知，该条件下固定化细胞使用 .
次较好，每批的转化率可达到 H$G以上。万方数据 ! · "#! · 生物加工过程 第$ 卷第 % 期
图 "! 优化条件下的 & 批次转化
’()* "! ’(+, -./01 23 0.45,424, /5.463257,8 24 29/(7.: 0248(/(24
%* $! 粗品的分离纯化 %*$* ;! 坎利酮和产物的溶解度
对坎利酮和转化产物（首批转化得到，纯度 <
==>）在乙酸乙酯中的溶解度进行测量。结果见图
&。由图 &可知，同温下坎利酮和产物溶解度差异较
明显，用冷却结晶法纯化粗品以得到高纯品是可能
的。
—$—坎利酮；—&—羟基化坎利酮 图 &! 坎利酮和产物在乙酸乙酯中的溶解度 ’()* &! ?2:@-(:(/A 23 0.45,424, .48 9528@0/ (4 ,/1A: .0,/./, %*$* %! 坎利酮转化产物的纯化
连续 $批次转化得到的粗品混合均匀（纯度为 =$* ">），进行 $次重结晶，结果见表$。结晶纯度
分析见图 B。
表 $! 产物粗品在乙酸乙酯中的三次重结晶纯化 C.-:,$! D,6@:/6 23 /15,, 5,E05A6/.::(F./(24 23 9528@0/ (4 ,/1A: .0,/./,
重结晶次数 溶剂用量 G 7H 纯度 G >
起始 I =$* " ; ;II =J* = % =" ==*$
$=I ==* J 图 B! 产物纯品的 KLHM分析图 ’()* B! KLHM 01.5/ 23 9@5(3(,8 9528@0/ %* "! ;;!E羟基化坎利酮的结构表征 元素分析结果如表 "。 表 "! 产物纯品的元素分析结果 C.-:, "! N:,7,4/ .66.A 325 9@5(3(,8 ;;!E1A852OA0.5,424, 元素 理论质量分数 G > 实测质量分数 G > M J$* =J" J$* =#" K #* ;;= #* ;%; P ;J* =IJ ;J* #=& 由表 " 推知纯化晶体的元素组成和 ;;!E羟基 化坎利酮的理论数值相符合。Q? 谱（图 J）中的基 峰为纯品的分子离子峰，［Q R K］为$&J* %，可知纯
品的分子量为 $&B* %，较坎利酮（M%% K%# P$）的分子
量（$"I* %）多 ;B，结合元素分析结果，可证明得到的 产物是羟基化坎利酮。 图 J! 产物纯品的 Q?图 ’()* J! Q? 01.5/ 23 9@5(3(,8 9528@0/ ; K SQD 分析结果：KE;.，%*$=、88、（ ;$* =， &* %）；KE;-，;* =$、7；KE%.，%* &J、7；KE%-，%* $B、7； KE"，&* J;、6；KEB，B* ;J、88、（=* =，%* J）；KEJ，B* IB、 88、（=* #，%* ;）；KE#，%* B$、87、（;%* $）；KE=，;*$&、万方数据
! "##$年$ 月 茅燕勇等：固定化赭曲霉 %&#"’( 细胞羟基化坎利酮 · )*! ·
+++、（ ’#, -，), #，", .）；/0’’1，), "#、+++、（ ’#, )，
’#, "，), )）；/0’"2，’, *"、3；/0’"1，’, )"、3；/0’)，
’, *’、3；/0’$2，’, *"、3；/0’$1，’, (- 3；/0’(2，
’, *(、3；/0’(1，’, *$、3；/0’4，’, #.、5；/0’*，’, ".、 5；/0"#2，", --、3；/0"#1，’, *)、3；/0"’2，",$)、3；
/0"’1，", )’、3。’- 6 %78 分析结果：60’，-$, 4.、9； 60"，-$, 4.、9；60-，"##, -’、5；60)，’"(, ’.、+；60$， ’(-, "$、5；60(，’"*, "’、+；60.，’-4, )-、+；604，
-4, ’"、+；60*，$(, #4、+；60’#，-(, "’、5；60’’，(4, -#、 +；60’"，-(, (.、9；60’-，)), "$、5；60’)，)(, *)、+；60
’$，"", *#、9；60’(，-),$.、+；60’.，*$, ’.、5；60’4， ’(, ##、:；60’*，’.,$(、:；60"#，-’, )4、9；60"’，"*, $"、 9；60""，’.(, 4’、5。 /7;6表明 ! ), "# 的氢（/0’’1）与 ! (4, -# 处 的碳原子（60’’）直接相关。/0/ 6<=>分析发现，! ), "# 的氢和 /0*、/0’"2、/0’"1 存在 /0/ 相关，’- 60 %78偏共振去偶碳谱表明 6’’ 为次甲基碳。结合 7=、?8以及元素分析等结果，可以推知 6’’ 存在一 个羟基。/7@6的分析结果表明 /0*、/0’"2、/0’"1 和 60’’ 存在远程偶合。而 /0’’ 的偶合分裂常数 （ -!// A ’#, )，’#, "，), )/B）很高（/ 在 " 位时偶合 分裂常数高），说明 /0’’ 在 6’’ 的 " 位，相应的，羟 基应该在 6’’ 的 # 位。样品的化学成分应该是 ’’#0羟基化坎利酮。 ",$! ’’#0羟基化坎利酮的熔点和比旋光度
测定了 ’’#0羟基化坎利酮的熔点为 ")# C；在
乙酸乙酯中质量浓度为 $ D E F时，比旋光度［#］"#G为
H ’", 4I。
!" 结" 论
本文初步研究结果表明：用固定化赭曲霉
%&#"’( 转化坎利酮 ’’#0羟基化是可行的。但底物
和产物的水溶性差，载体的被包作用影响传质和酶
活的收率，重用次数不多，因此固定化方式还须进一
步改进。
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