全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
9=QCJ(JTDIOCBEDN\QD)ODHJ((@CMQCJJOQCM
2DE*! -D*#
B`O*#$%%
KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$$!
收稿日期"#$%$ 6%% 6$3
基金项目"山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目##$$8\4$#$$!$(济南大学博士基金资助项目#\$7$#$(山东大学微生物技术国家
重点实验室开放课题##$$3 6$3$
作者简介"韩"省#%!38%$&男&山东济宁人&硕士研究生&研究方向"资源与环境微生物(李"强#联系人$&副教授&@FPBQE"EatIeCf%#7*HDP
高抑菌活性乳酸杆菌的筛选及性质
韩"省%&冯书珍%&李"冕%&王元秀%&李"强%&#
#%*济南大学 化学化工学院&济南 #$$##( #*山东大学 微生物技术国家重点实验室&济南 #$%$$$
摘"要"从自酿酸奶中分离得到 % 株高抑菌活性菌株&经 %74 O^-Y测序后鉴定为 -4)&342($"()*[4V 以大肠杆
菌)金黄色葡萄球菌为指示菌&取得良好抑菌效果 经组分分析及蛋白酶降解&抑菌活性物质确定为蛋白物质&推
测其由一些高分子的蛋白类物质和低分子的多肽类物质组成 抑菌活性物质在酸性条件下显示出良好的抑菌活
性&发酵液经 7$ k处理 &$ PQC后&活性基本没有下降&经 %$$ k处理 &$ PQC仍保留 3&*!g的活性&表现出良好的
热稳定性
关键词"抑菌(%74 O^-Y(乳酸杆菌(蛋白
中图分类号"+!&7""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$00 6$
)1265E.2/5/H:-545:E04.[5E.2/27-.;-K5:E04.21E51.11E45./-2)&120($"19=
.Y-4=JCM
%
&[@-W4=I<=JC
%
&U,` QBC
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%
&U,+QBCM
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#%*4H=DDEDN9=JPQ(AOXBCK 9=JPQHBE@CMQCJJOQCM&SCQZJO(QAXDNTQCBC&TQCBC #$$##&9=QCB( #*4ABAJ_JXUB;DOBADOXDN
Q`HOD;QBEdJH=CDEDMX&4=BCKDCMSCQZJO(QAX&TQCBC #$%$$&9=QCB$
*K1E45:E".QM= ;BHAJOQD(AB(Q((AOBQC LB(Q(DEBAJK NODPXDMIOABCK LB(QKJCAQNQJK AD;JB(-4)&342($"()*
[4V;X%74 O^-Y(JaIJCHQCMPJA=DK*S(QCMHK4&(2&/):76(&4&44$"$*#$"B(QCKQHBADO;BHAJOQB&JGHJEJCA
;BHAJOQD(AB(Q(BHAQZQAXLB(BHaIQOJK*d=J;BHAJOQD(ABAPBQCEXHDC(Q(AJK DN)ODAJQC(;XHDCAJCABCBEX(Q(BCK
)ODAJB(JKJMOBKBAQDC )OJ(IPJK AD;JPQGAIOJ(DN)ODAJQC(BCK )J)AQKJ(*SCKJOBHQKQHHDCKQAQDC(&A=J;BHAJF
OQD(ABA(=DLJK MDDK BCAQ;BHAJOQBEBHAQZQAX*YNAJOAOJBAPJCABA7$ k NDO&$ PQC&;BHAJOQD(AB(Q(BHAQZQAXKQK
CDAKJHEQCJ*R=JC A=JAJP)JOBAIOJOD(JAD%$$ k& AOJBAPJCAAQPJLB(&$ PQC&3&j!g DNA=J;BHAJOQD(ABF
(Q(BHAQZQAXOJPBQCJK&QA(=DLJK JGHJEJCAA=JOPBE(AB;QEQAX*
L0M I24H1";BHAJOQD(AB(Q(( %74 O^-Y( -4)&342($"()*( )ODAJQC
""乳酸菌是人和动物肠道正常菌群中的益生菌&
不仅对人和动物具有保健功能&而且能够产生有机
酸#如乳酸)丁酸和醋酸等$)过氧化氢和细菌素等
抑菌物质*%+ &这些抑菌物质应用于食品行业&具有
改善风味和抑制腐败菌和病原菌的生长)延长保质
期等特点 乳酸菌产生的细菌素易被人体消化道
中的蛋白酶降解&不会在体内蓄积引起不良反应&
被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐
剂和饲料添加剂*# 60+ 乳酸菌素也存在效价低)用
量大)抗代谢性能差)抗菌时效短)抗菌谱窄等缺
点&因此筛选获得高活性的抗菌活性稳定的菌株具
有重要研究意义
""本文从自酿酸奶中筛选出高抑菌活性菌株&分
别对在静止培养和摇床发酵条件下菌体的生长曲
线)).变化)抑菌物质的合成等发酵参数的变化和
联系进行分析
C?材料与方法
CNC?菌种
""革兰氏阳性菌大肠杆菌#H"47#*2472 4&(2$和革
兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌#/):76(&4&44$"$*#$"$
为指示菌&济南大学生物科学与技术系实验室保藏
CN@?培养基
%j#j%"筛选培养基# b`4 培养基$
""蛋白胨 %$ M&酵母粉 M&葡萄糖 #$ M&醋酸钠
M&柠檬酸二胺 # M&吐温 3$ % PU& M`45
0
$j3 M&
C`45
0
$j#3 M&蒸馏水 % U&).7j# h7j0
%j#j#"指示菌生长培养基#U\培养基$
""蛋白胨 %$ M&酵母粉 M&-B9E%$ M&蒸馏水% U&
).8j
%j#j&"检测培养基
""采用双层平板"下层为 %jg水琼脂培养基&上
层培养基为 %$ PU指示菌生长培养基中加入 $j%
PU指示菌悬液体固体培养基
CNO?乳酸菌的分离)保藏
""在无菌操作下取 % PU自酿酸奶于试管中&再加
灭菌的 ! PU无菌生理盐水&梯度稀释 次&分别取
$
"
U涂布于 b`4固体培养基平板上&&8 k恒温培
养 # h& K 挑取单菌落& b`4 固体培养基平板划
线&&8 k恒温培养 # K b`4固体培养基斜面划线&
&8 k恒温培养 # K&放 0 k冰箱保藏*+
CNP?试验菌株活化
""取实验室保藏的 H"47#*2472 4&(2和 /):76(&4&4>
4$"$*#$"菌种于U\固体培养基平板上划线&&$ k
恒温培养 % K&U\固体培养基斜面划线&&8 k恒温
培养 % K&0 k冰箱保藏
CNQ?乳酸菌的鉴定
%jj%"菌株形态观察
""在光学显微镜及透射电镜下观察菌体形态
接种于 b`4 固体培养基上培养&观察菌落形态&并
测量菌落大小 接种于液体培养基中观察有无菌
膜及其他情况
%jj#"菌株 %74 O^-Y序列测定*7 68+
"" -^Y的提取
"
>9b扩增反应
"
电泳观察
"
>9b产物纯化及 %74 O^-Y序列测定
%jj&"抑菌活性实验
""用杯碟法*3+测定抑菌活性"融化 U\培养基&待
融化的培养基冷却至 $ k左右时&每 #$$ PU加入
敏感指示菌菌液 $j PU&混合后立即倒入直径 ! HP
的培养皿中铺平 牛津杯直径均为 3 PP 待凝固
后&用镊子夹取牛津杯放置平皿中&然后在每个牛
津杯中加入 #$
"
U备用乳酸菌菌悬液 加样完毕
后&在无菌操作台内静置 % =&然后再转移到恒温箱
中&培养 3 h%$ = 若在牛津杯周围出现明显的抑菌
圈&则表明此株菌产生的代谢产物具有抑菌活性&
测量抑菌圈直径
CNR?乳酸菌的生理生化性质
%j7j%"乳酸菌菌株发酵周期#静止:摇床对比$
""将筛选的菌株转接到 b`4固体平板培养基活化
菌种&挑取单菌落接种至液体培养基&以 &g的接种
量分别于 &8 k静止培养:振荡培养 每隔 0 = 无菌
操作取样 & PU&在 7$$ CP处测定菌液的吸光值
#@.$&并以未培养的发酵液为对照&比较不同培养条
件下发酵液的抑菌活性 实验重复 & 次&允许误差
为 $j$%
""取生长曲线各个阶段的几次培养液 %$ PU离
心除去菌体&检测其抑菌效价&以时间为横坐标&抑
菌效价为纵坐标&绘制抑菌曲线
%j7j#"抑菌活性物质的性质
""%$ 中和法排除有机酸"取培养 &# = 的被检测
菌发酵上清液&离心后将其 ).调节至 j$&并以 ).
同为 j$ 的乙酸作为对照&进行对指示菌的抑菌实
验&分别检测两者的抑菌活性&发酵上清液的抑菌
活性与对照菌的抑菌活性之差&即为排除酸后发酵
液的抑菌活性*!+
""#$ 温度梯度检测抑菌活性"取 %$$ PU发酵
液&3 $$$ O:PQC 离心 &$ PQC 后&置于 7$)3$)%$$ k
温度梯度下&水浴 &$ PQC&做牛津杯抑菌试验&测定
抑菌圈的直径
""&$ 抑菌活性物质的组分测定"%$$ PU发酵
液 3 $$$ O:PQC 离心 &$ PQC 后&0 k条件下&上清
液逐渐加入#-.
0
$
#
45
0
&恒速搅拌&3 $$$ O:PQC
离心 &$ PQC&分别收集不同#-.
0
$
#
45
0
饱和度的
蛋白沉淀&测定抑菌活性&测得的有抑菌活性蛋
白沉淀即为抑菌活性物质粗品 将粗品经透析
除盐&得抑菌活性物质溶液 分别用考马斯亮蓝
法和苯酚 硫酸法测定活性物质中的蛋白及中性
糖含量&用硫酸 咔唑法和 @E(DCF`DOMBC 法测定己
0"第 # 期 韩"省等"高抑菌活性乳酸杆菌的筛选及性质
糖醛酸和氨基己糖的含量&并用 -^4 法测定还原
糖含 量& 用 @\染 色 看 其 是 否 含 有 核 酸 类
物质 *%$+
""0$ 蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质"把
胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分别溶解在 & PPDE:U的
磷酸缓冲液# ).8j$中配成母液&分别加入到被
检测菌发酵上清液中&使其终质量浓度为 $j
PM:PU&&8 k水浴 # =&以缓冲液相同倍数稀释后
的发酵液作为对照&用牛津杯法检测胰蛋白酶和
木瓜蛋白酶对被检测菌发酵上清液抑菌活性的
影响 *%%+
@?结果与讨论
@NC?分离)鉴定结果
""分离到的菌种记为 [4V菌株 在油镜下观察
[4V菌株的形态特征&发现菌株为杆菌&成链&常卷
曲&很少单个或成对存在 b`4 培养基上培养 % h
& K后&[4V菌株呈两面凸起&直径 % h& PP 液体
培养没有菌膜&菌液浑浊且有少量沉淀 用引物得
扩增菌株的 %74 O^-Y&>9b结果经琼脂糖电泳后
@\染色*%$+ &结果如图 % 所示
""[4V菌基因共测到 % !0 个碱基&利用 \UY4d
软件将该序列在 WJC\BCc 数据库与已登记的 %74
O^-Y序列进行同源性比较&结果如表 % 所示&其中
同源性最高的菌株是 -4)&342($"*7+,&"$"&可确
定[4V为 -4)&342($"()*
@N@?抑菌效果
""[4V菌株的抑菌效果见图 # 由图 # 可知"菌株
产生的活性物质对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都
具有较好的抑菌效果*%#+
%% B`cJO( #&&%菌株>9b结果
图 C?CR!4a$*X,` 电泳结果
U.;=C? 0`136E27CR!4a$*X,` 060:E429-2401.1
表 C?与数据库中的 CR14a$*序列的相似率
D5K60C?!.J.654.EM E2 E-0CR14a$*10V30/:01./H5E5K510
菌名 相似度:g 一致性 缺失序列
-4)&342($"*7+,&"$"
,^99&#$%
!!j3$ %#:%#3 $:%#3
-4)&342($"*7+,&"$"
(AOBQC UHO&
!!j80 %#0:%#3 $:%#3
-4)&342($"*7+,&"$"
(AOBQC U2%$3
!!j78 %#7:%&% $:%&%
-4)&342($"4"#2 !!j78 %#&:%#3 $:%#3
-4)&342($"
()*OJCCBCaQENX%$
!!j78 %#&:%#3 $:%#3
-4)&342($"
()*OJCCBCaQENX%7
!!j7% %##:%#3 $:%#3
-4)&342($"
*7+,&"$"Ub#
!!j7% %#%:%#3 $:%#3
图 @?乳酸菌的抑菌效果
U.;=@?85:E04.21E51.1070:E2/65:E.:5:.HK5:E04.5
70 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
@NO?乳酸菌的性质
#j&j%"乳酸菌菌株生长及抑菌曲线的测定
""静止培养条件下&[4V菌株所产生的抑菌物质
的活性与生长量的关系如图 & 所示 由图 & 可知"
菌株在 #$ = 进入对数生长期&03 = 后进入稳定期
从抑菌效果看&抑菌活性随着培养时间的延长出现
了增长的趋势 在对数生长期达到最大值&其后抑
菌活性略有下降&但总体上较为稳定
图 O?静止培养条件下浊度及抑菌活性曲线
U.;=O?85:E04.21E51.15:E.W.EM 5/HE34K.H.EM 3/H041E5E.:
:36E340:2/H.E.2/
""摇床培养条件下&[4V菌株所产生的抑菌物质&
其活性与生长量的关系如图 0 所示 由图 0 可知"
菌株在 %# = 进入对数生长期&0$ = 后进入稳定期
从抑菌效果看&随着菌体生长&抑菌效果逐步加强&
在 0$ =达到最大值 其后&随着培养时间延长&抑
菌活性略有下降&但总体上较为稳定
图 P?摇床培养条件下浊度及抑菌活性曲线
U.;=P?85:E04.21E51.15:E.W.EM 5/HE34K.H.EM 3/H04
1-5b./; :36E340:2/H.E.2/
""同时从图 & 与图 0 的对比中也可看出"摇床培
养条件的最高 @.值要比静止培养条件的最高 @.
值高 $j$!&摇床培养条件的最大抑菌圈直径比静止
培养条件的最大抑菌圈直径大 & PP 这说明 [4V
在摇床发酵条件下生长较为有利
#j&j#"抑菌活性物质的性质
""%$ 中和法排除有机酸"将发酵液离心后的上
清液调节至 ).*$&并以 ).*$ 的乙酸作对照以
排除有机酸的干扰&实验结果见表 # 由表 # 可知"
在排除有机酸干扰后&发酵液对指示菌有抑制作
用&与排酸前的发酵液相比&其抑制作用略有下降
这表明 [4V发酵液中主要起抑菌作用的物质不是
有机酸&有其他成分在抑制指示菌的生长
表 @?排除有机酸后的抑菌实验结果
D5K60@?85:E04.21E51.10G904.J0/EI.E-23E24;5/.:5:.H
试样 抑菌圈直径:PP
发酵上清原液 &# l&
).j$ 的发酵液 &% l#
).j$ 的乙酸 %3 l&
""#$ 温度梯度检测抑菌活性"不同温度处理
[4V发酵液对抑菌活性的影响结果如表 & 所示 由
表 & 可知"随着处理温度的上升&抑菌活性略有下
降(发酵液在 %$$ k处理 &$ PQC 时&仍然保留
3&j!g的抑菌活性 这说明乳酸菌所产生的抑菌物
质具有较好的热稳定性
表 O?不同温度处理U!c发酵液对抑菌活性的影响
D5K60O?85:E04.21E51.15:E.W.EM 5EH.7040/EE0J904E3401
温度:k 抑菌圈直径:PP
7$ &$ l&
3$ #3 l&
%$$ #7 l&
&8#对照$ &% l&
""&$ 抑菌活性物质组分的测定"经测定&$g h
7$g#-.
0
$
#
45
0
饱和度的蛋白沉淀抑菌活性占到发
酵液上清总抑菌活性的 !#g 经组分测定&抑菌活
性物质组成如表 0 所示 由表 0 可知"抑菌活性物
质主要由蛋白类物质组成&含有少量中性糖及己糖
醛酸&用 -^4法未检测到还原糖&经 @\染色&没有
检测到核酸类物质存在
表 P?抑菌物质组分
D5K60P?,2J921.E.2/27K5:E04.21E51.113K1E5/:0??d
A#蛋白质$ A#中性糖$ A#己糖醛酸$ A#氨基己糖$
!3j8 %j% $j# $
80"第 # 期 韩"省等"高抑菌活性乳酸杆菌的筛选及性质
""0$ 蛋白酶检测抑菌活性物质"抑菌活性物质
经胰蛋白酶)木瓜蛋白酶作用后&其抑菌活性如表
所示 由表 可知"经胰蛋白酶)木瓜蛋白酶作用
后&抑菌活性物质仍对大肠杆菌)金黄色葡萄球菌
有一定抑制作用&活性分别降低了 0%j!g 和
&3j8g 表明该活性物质起抑菌作用的不是单一物
质&推测该活性物质可能为一些高分子的蛋白类物
质和低分子的多肽类物质&其中可能存在一些不易
被蛋白酶降解的有抑菌活性的环肽物质&深入的研
究工作将在今后陆续报道
表 Q?木瓜蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑菌实验
D5K60Q?85:E04.21E51.10G904.J0/E57E04H056./;
I.E-9595./5/HE4M91./
试样 抑菌圈直径:PP
活性下降
百分率:g
发酵上清原液 &% l#
木瓜蛋白酶处理的发酵液 %3 l& 0%j!
胰蛋白酶处理的发酵液 %! l& &3j8
O?结论
""从自酿酸奶中分离得到 % 株高抑菌活性菌株
[4V&经 %74 O^-Y序列比对&鉴定为 -4)&342($"
()* 抑菌物质在对数生长期开始产生&随着发酵时
间的延长&其效价到 0$ =达到最高&之后略有下降
以大肠杆菌)金黄色葡萄球菌为指示菌&取得良好
抑菌效果 经排除有机酸实验)高温梯度检测)蛋
白酶检测及组分分析&确定抑菌活性物质是蛋白类
物质&推测其由一些高分子的蛋白类物质和低分子
的多肽类物质组成 抑菌活性物质在酸性条件下
显示出良好的抑菌活性&发酵液经 7$ k处理 &$ PQC
后&活性基本没有下降(经 %$$ k处理 &$ PQC 仍保
留 3&j!g的活性&表现出良好的热稳定性&这将极
大地提高抑菌活性物质在食品防腐剂)饲料添加剂
以及医药开发方面的应用效果&同时也对国内外抑
菌活性新菌株和高产菌株的研究具有重要的理论
和实践指导意义
参考文献"
* % +"金世琳*乳酸菌的科学与技术*T+*中国乳品工业&%!!3
##$"%0F%*
* # +"4H=QEQCMJOS&_BXB` &UmHcJ[_*\J=BZQDODN-2")#*2 +&,&46)&>
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-4)&342($""J#*T+*TY))E\BHAJOQDE&%!!%&8$#7$" 08&F083*
* & +">IHHQ` T&2JKBPIA=I @b&_ICcB\4&JABE*,C=Q;QAQDC DN-2")#>
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* 0 +"蒋志国&杜琪珍*乳酸菌素研究进展 *T+*中国酿造&#$$3
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* +"9=BOAJOQ(R>&_JEX> &`9DEQC(T_*YCAQ;QDAQH(I(HJ)AQ;QEQAXDN
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* 7 +"TD=C W&-DJEb&>JAJO.&JABE*\JOMJXn(PBCIBEDNKJAJOPQCBAQZJ;BHF
AJOQDEDMX* +`*\BEAQPDOJ"RQEQBPsRQEcQC(&%!!#"873F88$*
* 8 +"东秀珠&蔡妙英*常见细菌系统鉴定手册* +`*北京"科学出
版社&#$$%"&07F&03*
* 3 +"付长春*杯碟法影响抗生素效价测定的因素分析*T+*西北药
学杂志&#$$3&#&#$" &%$F&%#*
* ! +"侯运华&孔健&郝运伟&等*一株乳酸菌产生类细菌素 @CAJOQDF
HQCAcF(的初步研究*T+*山东大学学报"自然科学版&#$$#&&8
#$" 07&F08$*
*%$+"李铁军&李爱云&张晓峰*乳酸菌抗菌机理研究进展*T+*微生
物学通报&#$$#&#!#$" 3%F3*
*%%+"余焕玲&晏萍*乳酸菌的生理功能及在食品中的应用*T+*饮
料工业&#$$$#0$"%$F%&*
*%#+"曾志刚&陈英&余柏松*细菌素产生菌的筛选及其细菌素的分
离纯化*T+*中国抗生素杂志&#$$&#$" #8F#!*
30 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"