全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ０１４
收稿日期：２０１２－１２－１８
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）项目（２００７ＡＡ０２Ｚ２００，２００７ＡＡ０６Ａ４０２）
作者简介：方　 芳（１９８６—），女，湖北钟祥人，博士研究生，研究方向：生物化工；刘晓宁（联系人），教授，Ｅ⁃ｍｅｉｌ：ｘｉａｏｎｉｎｇｌｉｕ＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
新型柱前衍生试剂分析草甘膦的高效液相色谱研究
方　 芳１，魏荣卿１，刘晓宁１，李寿椿２
（１􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００；２􀆰 南京中意化工技术开发研究所，南京 ２１０００９）
摘　 要：以 ２，５ 二甲氧基苯磺酰氯（ＤＭＯＳＣ）为柱前衍生化试剂，建立了柱前衍生草甘膦的紫外检测反相高效液相色
谱法，并优化了衍生化条件，得最佳条件：衍生温度 ３５ ℃，时间 １５ ｍｉｎ， ｐＨ １０􀆰 ０，草甘膦与 ＤＭＯＳＣ 的摩尔比为１ ∶６。
ＨＰＬＣ分析条件：采用 Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８柱，流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ３０ ℃，检测波长 ２２０ ｎｍ，流动相为甲醇－乙腈－磷酸盐缓
冲溶液（０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ５􀆰 ５），三者的体积比为 １５ ∶５ ∶８０。 结果表明：草甘膦质量浓度在 ５～ １００ μｇ ／ ｍＬ范围内线性关
系良好，相关系数为 ０􀆰 ９９６ ２，检测限为 ０􀆰 ０６７ μｇ ／ ｍＬ。 实验表明该方法反应条件温和，灵敏度高，衍生产物稳定。
关键词：衍生；２，５ 二甲氧基苯磺酰氯；草甘膦；高效液相色谱
中图分类号：Ｏ６５７􀆰 ７２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－００６９－０４
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｂｙ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｅ⁃ｃｏｌｕｍｎ
ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ
ＦＡＮＧ Ｆａｎｇ１，ＷＥＩ Ｒｏｎｇｑｉｎｇ１，ＬＩＵ Ｘｉａｏｎｉｎｇ１，ＬＩ Ｓｈｏｕｃｈｕｎ２
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｓｉｎｏ Ｉｔａｌｉａｎ Ｃｈｅｍｉｔｅｃｈ Ｒ＆Ｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ２，５⁃
ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ􀆰 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３５ ℃，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １５ ｍｉｎ，ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐＨ ｖａｌｕｅ １０􀆰 ０，ｔｈｅ ｂｕｆｆｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０􀆰 ２
ｍｏｌ ／ Ｌ，ａｎｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｎ（ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ） ∶ ｎ（ ｏ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ） ＝ １ ∶ ６􀆰 Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（５ μｍ，４􀆰 ６ ×２５０ ｍｍ），ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ２２０ ｎｍ，ｆｌｏｗ ｒａｔｅ
１􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ （ｍｅｔｈａｎｏｌ） ∶ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ｂ （ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ） ∶ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ｃ （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ ＰＢＳ，ｐＨ ５􀆰 ５，０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ）） ＝ １５ ∶ ５ ∶ ８０， ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｆｏｒ
ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ５ μｇ ／ ｍＬ ｔｏ １００ μｇ ／ ｍＬ． Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ
０􀆰 ９９６ ２． Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ０􀆰 ０６７ μｇ ／ ｍＬ􀆰 Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ
ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ，ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ；２，５⁃ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ；ＨＰＬＣ
　 　 草甘膦（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ，ＰＭＧ），化学名称为 Ｎ 膦羧
基甲基甘氨酸，是一种广谱、非选择性、内吸传导性
强的除草剂［１］，它具有良好的除草性能，近年来在
农业领域得到越来越多的应用。 目前测定草甘膦
的方法主要有分光光度法［２］、毛细管电泳（ＣＥ） ［３］、
离子色谱法［４］、气相色谱法（ＧＣ） ［５］、液相色谱法
（ＬＣ）等，而柱前衍生液相色谱法［６－８］是最常用的方
法之一，柱前衍生液相色谱法中荧光衍生检测高效
液相色谱法［９］、蒸发光散射检测高效液相色谱法［１０］
等所采用的仪器或试剂普及度较低，而紫外检测柱
前衍生高效液相色谱法［６，１１－１２］则易于常规检测。 用
于紫外检测的柱前衍生化试剂有对甲氧基苯磺酰氯
（ＭＯＢＳ Ｃｌ） ［６］、对甲基苯磺酰氯（ＴｓＣｌ） ［１１］、邻硝基
苯磺酰氯（ＮＢＳＣ） ［１２］、对硝基苯甲酰氯（ＰＮＢＣ） ［１３］，
３，５ 二硝基 ４ 氯三氟甲苯（ＣＮＢＦ） ［７］等，这些试剂
存在反应温度高，或反应时间长，或反应后需萃取除
去过量的试剂等缺点。 针对以上缺点欲探索一种反
应活性高、操作简单、衍生产物稳定的柱前衍生化
试剂。
２，５ 二甲氧基苯磺酰氯（ＤＭＯＳＣ）常用于药物
合成，但作为柱前衍生化试剂分析胺基化合物从未
报道，本文采用 ＤＭＯＳＣ 为新型柱前衍生化试剂，草
甘膦为仲胺化合物代表，探索一种衍生反应条件温
和、灵敏度高的高效液相检测草甘膦的方法。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 仪器与试剂
Ｓｕｍｍｉｔ型 Ｄｉｏｎｅｘ（戴安） 高效液相色谱仪，色
谱系统由 Ｐ６８０ ＨＰＬＣ 泵、ＵＶＤ １７０Ｕ 可变波长紫
外检测器、８１２５ 型进样装置和柱温箱 ＴＣ １００ 组
成。 工作站：美国戴安 Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ公司。
ＤＭＯＳＣ（９８％，Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ 公司），ＰＭＧ 标准品
（９９􀆰 ２％，上海农药研究所）；甲醇（ＨＰＬＣ 级，Ｍｅｒｃｋ
公司），硼砂、Ｎａ２ＨＰＯ４、无水乙醇均为市售分析纯；
水为超纯水。
１􀆰 ２　 液相色谱条件
Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８柱（５ μｍ，４􀆰 ６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）；流动
相：Ｖ（Ａ 甲醇） ∶Ｖ（Ｂ 乙腈） ∶Ｖ（Ｃ 磷酸盐缓冲溶液
（０􀆰 ０２ ｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ ５􀆰 ５））＝ １５ ∶５ ∶８０；流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ；
柱温 ３０ ℃；检测波长 ２２０ ｎｍ；进样量 ２０ μＬ。
１􀆰 ３　 衍生方法
分别将 ＰＭＧ 标样溶于硼砂缓冲溶液 （ ０􀆰 ２
ｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ １０􀆰 ０）中，配制 ＰＭＧ溶液（０􀆰 ３３ ｍｇ ／ ｍＬ），
ＤＭＯＳＣ溶于甲醇配成溶液（５􀆰 ５４ ｍｇ ／ ｍＬ），取前后
两者体积比 ２ ∶１混合后，置于 ３５ ℃恒温水浴中反应
１５ ｍｉｎ，取出用 ０􀆰 ４５ μｍ滤膜过滤，按 １􀆰 ２液相条件
检测。 在 ｎ （ＤＭＯＳＣ） ∶ ｎ （ ＰＭＧ） ＝ ６ ∶ １、３５ ℃、１５
ｍｉｎ、ｐＨ １０􀆰 ０条件下进行衍生，化学反应式见图 １。
１􀆰 ４　 标准曲线绘制
用硼砂缓冲溶液（０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ １０􀆰 ０）配制 ＰＭＧ
的储备液（１００ μｇ ／ ｍＬ），分别取储备液 ０􀆰 ０５、０􀆰 １５、
０􀆰 ２５、０􀆰 ３５、０􀆰 ４５、０􀆰 ５５、０􀆰 ６５、０􀆰 ７５、０􀆰 ９０ 和 １􀆰 ０ ｍＬ 于
１０个试管，用缓冲溶液定容至 １􀆰 ０ ｍＬ（草甘膦质量浓
度为 ５～１００ μｇ ／ ｍＬ）；ＤＭＯＳＣ １０􀆰 ２ ｍｇ 溶于 ６ ｍＬ 甲
醇中，分别取 ０􀆰 ５ ｍＬ 于上述 １０ 个试管中，混合（１􀆰 ５
ｍＬ ／管），按优化后的条件衍生并检测。
􀜏􀜏
􀜏􀜏
􀜍􀜍
ＯＣＨ３
Ｓ
Ｏ
􀪅􀪅
Ｃｌ
Ｏ
􀪅􀪅
Ｈ３ＣＯ
＋ Ｃ
Ｏ
􀪅􀪅
ＨＯ
Ｈ２
Ｃ
Ｎ
Ｈ
Ｈ２
Ｃ
Ｐ
Ｏ
􀪅􀪅
ＯＨ
ＯＨ → 􀜏􀜏
􀜏􀜏
􀜍􀜍
ＯＣＨ３
Ｈ３ＣＯ
Ｓ
Ｏ
􀪅􀪅
Ｏ
􀪅􀪅 Ｎ
Ｃ
Ｈ２
Ｃ
Ｏ
􀪅􀪅
ＯＨ
Ｃ
Ｈ２
Ｐ
Ｏ
􀪅􀪅
ＯＨ
ＯＨ
图 １　 ２，５ 二甲氧基苯磺酰氯与草甘膦化学反应式
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ２，５ ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 衍生化反应时间对衍生效率的影响
按衍生方法 １􀆰 ３考察衍生反应时间（１、５、１０、２０
和 ３０ ｍｉｎ）对衍生效率的影响，反应 １０ ｍｉｎ 时的色
谱图见图 ２。 由图 ２ 可知：ＰＭＧ 与 ＤＭＯＳＣ 很容易
反应，反应速度很快，１０ ｍｉｎ 已基本完成反应，相比
于其他 ＰＭＧ衍生化反应［１１］，该反应时间短，为保障
反应完全，故确定 １５ ｍｉｎ为最佳反应时间。
图 ２　 草甘膦衍生反应液相色谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２􀆰 ２　 衍生化反应的温度对衍生效率的影响
在反应 ｐＨ为 ９􀆰 ０、反应时间为 １５ ｍｉｎ 时，考察
不同反应温度（２５、３０、３５、４０、４５和 ５０ ℃）对衍生效
率的影响，结果见图 ３。 由图 ３ 可知：随着反应温度
的升高，衍生产物的量增加，３５ ℃后衍生产物量随
着温度的进一步升高反而减少。 由此说明，ＤＭＯＳＣ
作为衍生化试剂相比于其他衍生试剂［６，１１］表现为较
低温度下的良好反应活性，这对于一些对温度敏感
的生物活性物质的衍生化检测有重要的应用意义。
取 ３５ ℃为最佳反应温度。
图 ３　 反应温度对衍生反应的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 衍生化反应的 ｐＨ对衍生效率的影响
在反应温度 ３５ ℃、反应 １５ ｍｉｎ 时，考察衍生不
同反应 ｐＨ（ｐＨ ８􀆰 ０～１１􀆰 ０）对衍生反应效率的影响，
结果见图 ４。
图 ４　 ｐＨ对衍生反应的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
由图 ４可知：当 ｐＨ较低时，反应释放的 ＨＣｌ 会
抑止反应；而当反应 ｐＨ较高时，则易加快衍生试剂
的水解，只有当 ｐＨ １０􀆰 ０ 至 １０􀆰 ５ 时，此弱碱环境不
仅可以中和衍生释放的 ＨＣｌ，且不易造成衍生试剂
的水解，因此，选择 ｐＨ＝ １０􀆰 ０为最佳 ｐＨ。
２􀆰 ４　 衍生试剂的量对衍生效率的影响
通过改变衍生反应中添加的 ＤＭＯＳＣ 的量来考
察反应摩尔比对衍生效率的影响。 结果表明：随着摩
尔比的增加，衍生产物的量增加，同时衍生试剂的水
解量明显增加，考虑既提高检测灵敏度，又避免大量
衍生试剂水解浪费，选择衍生反应的摩尔比为 １ ∶６。
２􀆰 ５　 精密度实验
相同条件下，平行反应 ５ 次，测定每次的峰面
积，并求出其相对标准偏差（ＲＳＤ） 为 ０􀆰 ９８％，结果
表明该方法有较好的重复性。
２􀆰 ６　 衍生反应液稳定性考察
将反应好的衍生产物溶液过滤，室温储存 ３ 个
月后检测，结果显示衍生产物的峰形、峰面积、保留
时间等无明显差异，表明衍生产物具有良好的稳
定性。
２􀆰 ７　 标准曲线绘制及回收率实验
按 １􀆰 ４标准曲线绘制法结果表明 ＰＭＧ 质量浓
度在 ５～１００ μｇ ／ ｍＬ范围内， ＰＭＧ 衍生产物峰面积
与浓度呈良好的线性关系，回归方程为 Ｙ ＝ Ｙ ＝
０􀆰 ２０５ ３ｘ＋１􀆰 ４２７ ８，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９６ ２，以信噪比 Ｓ ／ Ｎ ＝ ３
计算检出限，其最小检出限为 ０􀆰 ０６７ μｇ ／ ｍＬ。
将草甘膦标准样添加质量在空白水体中，添加
质量浓度分别为 ４５、６５ 和 ７５ μｇ ／ ｍＬ，然后衍生化，
ＨＰＬＣ测定。 所得水体中草甘膦的回收率分别为
１０１􀆰 ７、１０３􀆰 ７和 ９６􀆰 ４％。 由此可知该方法准确度很
好，符合农药残留分析的要求。
３　 结　 论
研究了新型的伯仲胺基衍生化试剂 ２，５ 二甲
氧基苯磺酰氯与仲胺草甘膦的柱前反应，用紫外 高
效液相其衍生产物进行检测。 通过一系列的衍生
条件优化得知：该方法操作简单，反应时间短，反应
条件温和，灵敏度高，在 ３５ ℃下、１５ ｍｉｎ即可完成反
应，而且衍生产物稳定，反应重复性好，ＨＰＬＣ 色谱
分离条件简单。 综合考虑，该方法优于其他柱前衍
生方法，同时相对于其他衍生剂来说，该试剂同样
适用于其他含有胺基的生物活性物质的衍生化反
应，是一种应用前景良好的衍生试剂。
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（责任编辑　 荀志金）
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（责任编辑　 荀志金）
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷