全 文 ：NOV．2008
·30·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第6期
2008年11月
化学一酶法制备￡．高苯丙氨酸
贾红华，陈永生，陈美娟，韦 萍，黄 和
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：以苯丙酸乙酯为原料，通过正交设计优化2．氧4．苯基丁酸盐的制备条件：苯丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比
为l：3，缩合反应时间为2．5h，H：S04质量分数为20％，水解反应时间为15h，优化条件下2．氧4．苯基丁酸盐的产
率为68．24％。随后，利用EcoliA5所产的天冬氨酸转氨酶为生物催化剂制备厶高苯丙氨酸。酶转化反应的最适
务件为：游离细胞体系pH、温度、底物质量浓度和细胞质量浓度分别为8．5、37℃、20∥L和30g／L；而固定化细胞
体系则分别为7．0—9．0、40℃、10s／L和30g／L。采用廉价的￡．谷氨酸(L-Giu)作为氨基供体，添加表面活性剂有
利于提高L—HPA产率。通过研究固定化细胞转化反应进程，结果发现8h内90％的底物可转化为L-HPA。
关键词：天冬氨酸转氨酶；￡．高苯丙氨酸；固定化；2．氧4．苯基丁酸
中图分类号：Q814，TQ460文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0030—05
ProcessforproducingofL-homeoephenylalanine
bychemo-enzymaticmethod
JIAHong—hua，CHENYong—sheng，CHENMei-juan，WEIPing，HUANGHe
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Nanjing210009，China)
Abstract：The2一ox04-phenylbutanate(OPBA)waspreparedfromethyl3-phenylpropionatefirstly．and
orthogonalexperimentaldesignwasusedtooptimizethereactionc ditions艄follows：molarratioofethyl
3-phenylpropionatetod ethyloxalatewasI：3，condensationreactiontimeWaS2．5h，concentrationof
H2S04WaS20％，hydrolysisreactiontimeWaS15h，andtheyieldofL-HPAwas68．24％undertheop-
timizedconditions．Secondly．L—HPAWaspreparedfrom2一oxo-4一phenylbutanatecatalyzedbyaspartate
aminotransferaseproduc dfromE．coliA5，andtheoptimumconditionsweregiven：pH，temperature，
concentrationofOPBA，andcellcontentwas8．5，37℃，20s／L，and30s／L，respectivelyforthfree
cellssystem，and7．0～9．0，40℃，10s／L，and30s／Lintheimmobilizedcellssystem．Theamino
donorwasL-Glu．andthesurfactantsh dadirectinfluenceo theyieldofL．HPA．Inthereactioncata．
1yzedbytheimmobilizedcells，90％ofthesubstratec nbeconvertedasL．HPAin8 h．
Keywords：aminotransferase；L-homophenylalanine；immobilization；2-oxo-4．phenylbutanoicacid
L一高苯丙氨酸(L-homophenylalanine，L-HPA)及
其酯是生产血管紧张素抑制剂类药物的重要原料，如
依那普利、贝那普利、赖诺普利等⋯。其制备主要通
过化学合成法[2-s]。近年来也有一些酶法合成的报
道‘4。。利用海因酶法以消旋苯乙基海因为原料制备
￡．HPA，但是整个反应的转化率太低‘引。转氨酶由于
收稿Et期：2008-08-29
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)重点资助项目(2007AA021307)
作者简介：贾红华(1979一)，男，湖北监利人，博士。研究方向：生物4r．工-。
联系人：韦萍，教授，E-mail：weiping@njut．edu．cn
万方数据
2008年11月 贾红华等：化学一酶法制备￡一高苯丙氨酸 · 3l ·
具有底物范围广、反应产率高等特点[6】，已被广泛应
用于非天然氨基酸的生物合成。Chen等口3以重组的
酪氨酸转氨酶为催化剂，催化转化2．氧4一苯基丁酸
制备L·HPA，转化率可达95％，产物光学纯度超过
99％。本文从苯丙酸乙酯出发，首先优化合成了2一
氧4·苯基丁酸，随后以此为原料通过EcoliA5细胞
所产天冬氨酸转氨酶催化转化制备L-HPA。
1材料与方法
1。1仪器与试剂
THZ．C恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；
KF-SL发酵罐(Kozan—Dong．Namdong—Ku．Inchon．
Korea)；J2．HS高速冷冻离心机(Beckmann公司)；
高效液相色谱仪(HPLC，Alltech公司)。
苯丙酸乙酯，盐城泰和达公司；草酸二乙酯，聚乙
烯醇，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；四硼酸钠
(硼砂)，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；厶高苯
丙氨酸，Sigma公司；2一氧4-苯基丁酸标准品，自制。
菌种：昱．coliA5，南京工业大学菌种保藏室。
培养基：葡萄糖15g／L，牛肉膏1．5g／L，蛋白胨
6g／L，MgSO,1．5g／L，NaCI1．5∥L，玉米浆20ⅡlL／L，
pH为7．2。
1．2实验方法
1．2．13一苄基-2，羰基丁二酸二乙酯的合成
在100mL的单口烧瓶中加入过量的甲醇，加入
1．15gNa块，磁力搅拌至完全反应。减压蒸去甲
醇。加入8．71mL(0．05t001)苯丙酸乙酯和16．95
mL(O．125t001)草酸二乙酯的混合物，边滴加边搅
拌，在60。C减压反应1．5h，得红褐色油状产物。
1．2．22一氧4．苯基丁酸盐的制备
将1．2．1中反应得到的红褐色液体加入到250
mL三口烧瓶中，加入60mL20％的硫酸溶液，搅
拌，加热回流15h。反应完毕，收集有机相。水相用
乙酸乙酯萃取2次，每次15mL，合并有机相，用水
洗涤1次。然后用20％的K2CO，溶液萃取2次，每
次15mL，萃取液合并即为2一氧4一苯基丁酸盐溶液，
置于棕色瓶低温保存备用。
1．2．3EcoilA5发酵产酶方法
配置发酵培养基3L，装入容积为5L的机械搅
拌罐中，121oC、0．1MPa下灭菌20rain，冷却后接人
种子，在37℃，400r／rain下通风培养16h。待发酵
完成后，培养基离心，获得菌泥，用无菌生理盐水洗
涤菌泥，保存于冰箱中。
1．2．4固定化细胞的制备方法
将聚乙烯醇溶胀24h，加人一定量的海藻酸钠，
灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将菌悬液与
一定量的吸附填充物混合，待聚乙烯醇冷却后与其
搅拌均匀。用50mL的注射器滴加到交联剂溶液
中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡，置于冰箱
冷藏过夜。用生理盐水洗涤，冰箱保存。
1．2．5生物转化反应过程
取2一氧4．苯基丁酸盐溶液，按摩尔比l：1．2加入
L-Glu，同时加入一定量的EcoilA5游离细胞或固定
化细胞，混匀，调节pH至8．5，定容至一定体积。充
氮气保护，置于37。C、120r／min摇床中，反应20h，
得白色混悬液。取样测定2-氧4．苯基丁酸和己一高苯
丙氨酸含量，按摩尔比计算其摩尔转化率。
1．2．62一氧4一苯基丁酸和L．HPA的定性和定量
测定
2．氧4·苯基丁酸和L-HPA的定性测定采用薄层
色谱法博J，定量测定则采用HPLC法：采用反相C18键
合硅胶柱(250mmx4．6mm，5岬)，流动相为70％的
o．05mol／L的NaH2104(衡008moL／L三乙胺)和30％
的甲醇，流速为1．0mL／min，检测波长为206ILITI。
2结果与讨论
2．1 2一氧4．苯基丁酸的制备条件优化
为提高2一氧_4．苯基丁酸盐的产率并考察各因素
对其产率的影响，采用正交设计法对合成工艺条件进
行优化。所选择的4个因素分别为：苯丙酸乙酯(X)
与草酸二乙酯(Y)摩尔比(因素A)；苯丙酸乙酯与草
酸二乙酯在醇钠作用下的缩合反应时间(因素B)；水
解时加入H：so。的质量分数(因素c)；水解时间(因
素D)。
表1正交实验因素水平表
Table1 Thefactorsandlevelsoforthogonaldesignexperiments
因素
水平 A B C D
n(X)：凡(Y)￡(缩合)／h"(82SO,)／％f(水解)／h
万方数据
·32· 生物加工过程 第6卷第6期
裹2正交实验结果
Table2 Theresultoforthogonaldesignexperiment
表3正交实验结果分析
Table3 Analysisoforthogonalexperiment
对表3中的数据进行分析，得出最佳工艺条件
为A，D：c：B，，即苯丙酸乙酯与草酸二乙酯的摩尔比
为1：3，缩合反应时间为2．5h，H：SO。质量分数为
20％，水解反应时间为15h。从极差分析得知，苯
丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比和水解反应时间对
2．氧4．苯基丁酸的产率影响最为显著，是实验过程
中考虑的主要因素。缩合反应时间和加入的硫酸
质量分数对2．氧4．苯基丁酸的产率影响较小。采
用优化的A，D：C：B，条件进行实验，所得2-氧4-苯
基丁酸的产率为68．24％，高于正交实验中所有反
应条件下所得的2．氧14-苯基丁酸的产率。
2．2 pH对L．HPA溶解度的影响
在37oC下，测定不同pH下L—HPA的溶解度。
如图1所示，当pH在2以上，L．HPA的溶解度很
低。由于在pH8．5下L．HPA的溶解度极低，在反
应过程中，￡．HPA的不断析出促使反应平衡朝产物
方向进行。而当pH≤l时，由于形成可溶性的
L．HPA盐酸盐，溶解度大大提高。鉴于￡一HPA溶解
度的这种特性，L—HPA的分离纯化也比较简单。
2．3氨基供体对生物转化反应的影响
为筛选转氨反应的合适氨基供体，考察了不同
氨基供体对生物转化反应的影响。图2的研究结果
表明￡一Glu为最佳氨基供体。文献[9]报道L—Glu
图1 pH对L-HPA溶解度的影响
Fig．1EffectofpHonthesolubilityofL-HPA
作为氨基供体时，天冬氨酸转氨酶酶活最高，但反
应的平衡常数接近1，导致转化率不高。在本体系，
由于L-HPA溶解度较低，从而可拖动转氨反应朝着
生成L—HPA方向进行，大大提高反应转化率和产物
产率。
雾 熏 熏 圉圉励励一
AspGluPheTyrTrpGlyLysAmmonia
氨基供体
图2氨基供体对生物转化反应的影响
Fig．2Effectofaminod no玛ONthebiotransformation
2．4 pH对生物转化反应的影响
在不同的pH条件下，酶分子和底物分子中基
团的解离状态发生变化，从而影响酶与底物的结合
能力和催化能力。只有在有效的pH范围内，酶才
能显示其催化活性，在最适pH条件下，酶催化反应
速率达到最大。由图3可以看出，游离细胞的最适
100
堡80
茫60
毒40
Z
j20
O
5 6 7 8 9 10
pH
图3 pH对生物转化反应的影响
Fig．3EffectofpHonthebiotransformation
∞
∞
∞
∞
∞
O
母、爵k《山}{-7
万方数据
2008年11月 贾红华等：化学一酶法制备￡．高苯丙氨酸 · 33·
pH为8．5，而固定化细胞的最适pH则为7．0-9．0。
这可能是由于细胞经固定化后，聚乙烯醇载体对颗
粒内的反应溶液体系具有一定缓冲作用，从而导致
固定化细胞在一定pH范围内都具有比较好的催化
效果。。
2．5温度对生物转化反应的影响
如图4所示，游离细胞的最适温度为37℃，固
定化细胞的最适温度都为40cc，较游离细胞有所提
高。且细胞经固定化后，其稳定性大幅提高，46～
52℃。L—HPA相对产率较游离细胞体系高。酶催化
反应的最适温度是酶热稳定性与反应速率影响的
综合结果。升高温度，一方面提高了反应的速率，
另一方面降低了酶的活性。
茎群80一茎，卟 ～．。 ＼毫印l ：蓄蹇翟嚣胞 ＼
图4温度对生物转化反应的影响
Eg．4Effectof emperatureOllthebiotransformation
2．6底物浓度对生物转化反应的影响
底物浓度是反应过程中直接影响反应产率的
一个重要因素。实验考察了不同底物浓度对游离
细胞和固定化细胞生物转化过程的厶．HPA产率的
影响，结果如图5所示．由图5可知底物2．氧4-苯
基丁酸盐质量浓度为20g／L时，游离细胞酶转化
率最高，固定化细胞最适底物质量浓度为10g／L。
謇
鼍
宝
J
图5 2-氧_4．苯基丁酸盐质量浓度对生物转化反应的影响
Fig．5Effectofconcentrationof2-oxo-4-phenylbutyrate
onthebiotransformation
2．7细胞浓度对转氨反应的影响
生物催化剂的使用量也是实际过程必须考虑
的一个问题，因此考察不同细胞浓度对游离细胞和
固定化细胞转化率的影响。由图6所示，在一定的
底物浓度下，游离细胞和固定化细胞体系的转化率
均随细胞浓度的增加而提高，但细胞含量达到一定
比例后则保持稳定。从经济角度出发最适的游离
细胞和固定化细胞质量浓度均为30g／L。
毒
J}L
蚕
‘
圈6细胞质■浓度对转氨反应的影响
Fig．6Effectofcellcontento hebiotransformation
2．8表面活性剂对酶活的影响
由于天冬氨酸转氨酶是胞内酶，使用表面活性
剂对细胞进行处理，可改善细胞膜的通透性，降低
反应底物与酶接触的阻力。由图7可知，使用
0．6％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0．4％的
Tween-80和0．3％的十二烷基硫酸钠(SDS)时，其
￡．HPA产率分别为未添加时的134．83％、125．72％
和118．26％。
“表面活性剂l，％
图7表面活性剂对转化反应的影响
Fig．7Effectofsurfactansonthebiotransformation
2．9 固定化细胞生物转化过程进程曲线
取150mL质量浓度为lOg／L、pH为8．5底物溶
液，加入一定量的固定化细胞，置于40℃、120r／rain
：兮∞够∞晒舳竹加
万方数据
·34· 生物加工过程 第6卷第6期
的恒温摇床开始反应。每隔2as样，反应20h为止，
HPLC法测定2．氧．4．苯基丁酸盐和￡-HPA浓度，制作
反应进程曲线。结果如图8所示，当反应进行到8h，
90％的底物已被转化，L．HPA的产率也接近90％。
当反应到20h，底物转化率为99．5％，产物相对底物
的产率为91．73％。
100
誊80
螯60
墨40
山
玉20
O
他
图8固定化细胞生物转化随时间的变化
Fig．8Thetimecourseofthebiotransformation
catalyzedbytheimmobilizedceHs
2．10固定化操作的稳定性
取30mL10g／L的底物(pH8．5)，加入一定量
的固定化细胞，置于40℃、120r／min的恒温摇床开
始反应，20h为一个周期进行固定化稳定性对照转
化实验。A组添加0．4％的Tween80，B组作为空白
对照。结果显示，经过7个批次的反应后，A组产率
变化不大，而B组产率则从开始就不高，且2批次
反应后更低。这可能是由于未添加表面活性剂时，
产生的L—HPA含有大絮状颗粒无法及时移除而堵
塞固定化微孔，从而限制了后面底物的进入，导致
L．HPA产率低。当添加表面活性剂后，由于它产生
了细微晶粒，容易在振荡过程中移除，从而对固定
化细胞的传质阻碍作用减小，所以相对未添加的产
率影响较小。
120
零100
最80
蒌60
孟40
J20
0
l 2 3 4 5 6 7
批次
圈9 固定化细胞的稳定性操作
Fig．9ThestabilityofimmobilizedceUs
3结论
以苯丙酸乙酯为原料，首先优化了2-氧_4一苯基
丁酸盐的制备条件，随后利用五coli．45天冬氨酸转
氨酶，制备了L—HPA。具体结论如下。
1)优化后的2-氧4．苯基丁酸盐制备条件：苯丙酸
乙酯与草酸二乙酯摩尔比为l：3，缩合反应时间为
25h，H2so,质量分数为20％，水解反应时间为15h，
优化条件下2一氧4．苯基丁酸盐的产率为68．拼％；
2)酶转化反应的最适条件为：游离细胞体系最
适pH、温度、底物浓度和细胞浓度分别为8．5、37℃、
20g／L和30g／L；而固定化细胞体系则分别为7．0～
9．0、40℃、10s／L和309／L。采用廉价的L-Gh作为
氨基供体，添加表面活性剂有利于提高L-HPA产率。
通过研究固定化细胞转化反应进程，结果发现8h内
90％的底物可转化为L-HPA。在固定化细胞的操作
稳定性实验中发现，添加表面活性剂后明显可提高固
定化细胞的使用寿命。
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