全 文 ：Aug。2007
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生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第5卷第3期
2007年8月
一菌双酶法制备乞4．氟苯丙氨酸
陈美娟，陈永生，贾红华，姜 岷，韦 萍
(南京王韭大学 潮药与生命稃学学院，窝京210009)
攘要：裁建重鳃聂coli产天冬氨酸酶和天冬氨酸耱氨酶催化生产￡毒一氧苯西氨酸黪盖艺。实验络暴表明最镰转
化条件为：37℃，pH值4．5—8．5，菌体与酮酸的质蚤浓度比为1．5，CTAB的质量分数为0．04％，酮酸的质量浓度
11．28g／L，富马酸铵与酮酸的摩尔比为3．O：1．0，添加1mmolfL的Fe“，五一天冬氨酸与酮酸的摩尔比为o．4：l。在
最逐条件下，经过14h酶转化反应达到乎衡，酿酸转化率可这爨95％以上，M一氟苯麓氡羧蟹率也可达到80％以
上。此法原料简单易得，为“一氟苯丙氨酸的稍备提供了一种新方法。
关键词：酶法；L4．氟苯丙氨酸；对氟苯雨酮酸；天冬氨酸酶；天冬氨酸转氨酶
中翻努类号：Q814。9 文献标识粥：A 文章编号：1672—3678(2007}03—0052—06
ThepreparationofL-4-fluorophenylalaninecatalyzedbycoupled
twoenzymesproducedfromrecombinantE．coil
CHENMei-juan，CHENYong—sheng，JIAHong-hua，JIANGMin，WEIPing
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Na．jing210009，China)
Abstract：Preparation《L-4一fluorophenylalaninecatalyzed匆aspartateammonia-tyaseandaspartateami—
notlansferaseromr combinontstrainofE．coliwastudied．Atfirst ep．fumaricacidturnedintoL—
aspartieacidasthedonorfammoniagroupforfurtherr action，catalyzedby spartateammonia—lyase．
Witht eammoniadonor霹一fluorophenylpyruvatewasconvenedtoL-4一fluorophenylalaninecatalyzedbyas—
partateminotransferase．After14h，thebioconversionof4-fluorophenylpyrnvatewasover95％andthe
yieldofL-4-fluorophenylalaninecou dbeabove80％undertheoptimalconditionsasfollows：37℃，pH
valuerangeof4。5～8。5，1．5ofthemassratioofcellto4一fluorophenylp，alavate，0．甜％ofthemaSsra—
tio fCTAB，11．28g／Lofthe4-fluorophenylpyruvateconcentration，n((NH4)2Fuma)：n(4一fluorophe—
nylpyruvate)=3．O：1，1mmol／LFe“，and玮(毛一Asp)：n(4一fluorophenylpyruvate)=0．4：1．Theaw
materialsofthispreparationwerecheapandeasytoobtain．
Keywords：Enzymaticmethod；L4一fluorophenylalanine；4-fluorophenylpyruvate；aspartateamm nia-
lyase；aspartateaminotransferase
非天然氨基酸由于其结构的特殊性和功能的
多样性，已在手性模块、构象约束和药物活性产黑
开发研究中起裂相当重要的作用，许多菲天然氨基
酸是药物和药物前体的关键组分1卜21。￡4。氟苯丙
氨酸(￡-4-fluorophenylalanine，4-fluoro-L—phenylala—
nine，简称FPhe)又名对氟苯丙氨酸，是人体内某些
收耩日期：2006一11-22
基金璞露：霹家973项羁(2003CB716004)；蓠家盎然辞学蚤点基金费勘项目(20336010)。
作者简介：陈美娟(1981一)，女，江苏宜兴人，硕士研究生，研究方向：生物催化。
联系人：韦 萍，教授，博士生导师，E-mail：dopa@njut．edu．cn
万方数据
2007年8月 陈美娟等：一菌双酶法制备￡_4一氟苯丙氨酸的研究 ·53·
羟化酶的抑制剂E3]，具有抗肿瘤作用Ho，而19FPhe
则可监测肿瘤生长情况及范围∞1。同时，由于FPhe
与￡．苯丙氨酸几乎是电子等排体，但是却含有强吸
电的氟原子来修正其偶极矩，故在多肽合成中被广
泛应用MJ。目前，关于其制备方法主要是化学合成
法。卜副和酶法旧J。化学合成法得到的是D，￡一混合
物，需要进行拆分，制取成本比较高。
随着基因工程的发展，基因重组技术越来越多
地应用于多种高活性酶在同一微生物细胞中进行
表达，使一种微生物具有催化多个反应的能力，显
1材料与方法
cooH／，^VcooH
ll
O
著提高了酶的催化活性。李华钟等u叫以大肠杆菌
野生菌为宿主细胞，采用基因重组技术，使该菌同
时具有较高的y．谷氨酸半胱氨酸合成酶和谷胱甘
肽合成酶活性。马飞等‘1川研究用土壤杆菌
CPUl295完整细胞双酶转化法生产D，(一)一对羟基
苯甘氨酸。本文基于已建立的以海因为原料的对
氟苯丙酮酸(FPPA)前体合成工艺，以廉价易得的氯
化铵和富马酸为底物采用产天冬氨酸酶(AspAL)和
天冬氨酸转氨酶(AspAT)的基因重组菌催化制备
FPhe。
AspAL
NH40；；22222
H00c—cH--CH2
NH2
5 4
I
cHr嚣一嚣一。H+c。2
COOHⅣcooH
-
NHl
+
F
些囟’■r’’’—。’—⋯
叫2一i“00H
3 0
l一富马酸；2一E—Asp；3一FPPA；4一FPhe；5一草酰乙酸；6一丙酮酸
图1 FPhe制备过程示意图
Fig．1SchemeofthepreparationofFPhe
1．1实验材料和仪器
重组E．coli由本实验中心基因工程实验室
提供。
LDZX-40灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；SZ-
cJ一1超净工作台(苏州市百神科技有限公司)；THZ．
c恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)；HH一2水
浴锅(常州国华电器有限公司)；KF-5L发酵罐(713-
12．Kozan—Dong．Namdong—Ku．Inchon．Korea)’；J2一HS
高速冷冻离心机(Beckmann公司)；高效液相色谱
仪(HPLC，Alhech公司)；752紫外可见分光光度计
(上海精密科学仪器有限公司)。
发酵培养基：富马酸(Fuma)10g／L，玉米浆30
mL／L，MgS040．5g／L，KH2P040．5∥L，NaCl1 g／L；
pH值为7．0～7．5。
1．2实验方法
1．2．1菌体的培养及收集
重组E．coli发酵产酶方法：从平板挑菌接入摇
瓶37℃，200r／min培养7h，再以2％接种量接入装
有3L培养基的5L机械搅拌罐中，培养10h；待发
酵完成后，离心，获得湿菌体，用灭菌水洗涤湿菌
体，保存于一4℃冰箱中。所有培养基均在121oC、
0．1MPa下灭菌20min。
1．2．2双酶催化制备FPhe
利用产双酶的大肠杆菌基因工程菌，选取
NH。C1作为氨基供体，两个酶的最适温度37℃，pH
+
00
H
C
／＼
C一
。
C
＼／
C
H
O0H
F伞+
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· 54· 生物加工过程 第5卷第3期
8．0，FPPA质量浓度约lO∥L，n((NH。)：Fuma)：
凡(FPPA)=2．0：1．0，菌体最终质量浓度25g／L作
为基本条件来对下列转化反应条件进行考察，每次
实验只对考察因素做相应变化，其余条件保持不
变，然后检测FPPA和FPhe的质量浓度，计算FPPA
的转化率和FPhe的得率。FPPA分析用Fe¨显色
法和HPLC，FPhe分析用HPLC，Fe3+显色法参见文
献[12]，HPLC分析方法参见1．2．3。
1．2．3FPPA和FPhe的高效液相检测方法
用反相C18键合硅胶柱(250mm×4．6mm，
5汕m)，色谱条件为：流动相为70％的0．05mol／L
的磷酸二氢钠(含0．008mol／L三乙胺)和30％的
甲醇，流速为1．0mL／min，检测波长为206nm。
2结果与讨论
2．1 温度对双酶催化反应的影响
￡．天冬氨酸酶和￡一天冬氨酸转氨酶的最适反应
温度均为37℃，高于该温度时虽然酶催化反应速率
加快，但同时也加速了酶的失活速率，所以，理论上
37℃为最佳反应温度。由图2可见，在37℃下
FPhe的得率最高与理论估计一致。而FPPA的转
化率随着温度的升高持续增大可能是由于酮酸的
不稳定，温度升高分解速率加快所致。
堡术
壁旃
耍萼
萑萑
图2温度对转化反应的影响
Fig．2Effectofreactiontemperaturevalue
2．2 pH对双酶催化反应的影响
酶结构中具有催化活性离子基团的解离形式
随着pH值的变化而发生改变，因而随着pH的变
化，酶的催化能力也不一样。据报道天冬氨酸酶的
最适反应pH值是8．0_l3|，天冬氨酸转氨酶的最适
反应pH值范围是8．0—8．5Ll引。但由图3可见，pH
在4．5—8．5时，FPhe的得率与FPPA的转化率都相
对较高，这可能是酶与底物结合的特异性和反应体
系的特异性造成的。因此，转化最适pH值范围较
广，有利于对转化反应条件的控制。
冰零
塞基
《∞
台毒
k目
图3 pH对转化反应的影响
Fig．3EffectofreactionpHvalue
2．3 菌体量对双酶催化反应的影响
菌体量(即为酶量)的大小，一般随着菌体浓度
(即酶的浓度)的增加，酶与底物结合的几率就增
大，有利于底物转化成产物，但浓度过高会增加成
本，且不利于后提取。由图4可见，随着菌体浓度的
增加，FPPA的转化率和FPhe的得率都升高，在菌
体与FPPA质量浓度比1．5时达到最大，之后无明
显变化。因此，菌体与FPPA质量浓度比为1．5是
最佳的菌体用量。
璧冰
蕤
墓蓖
图4菌体量对转化反应的影响
Fig．4Effectofreactioncellweight
2．4表面活性剂对双酶催化反应的影响
表面活性剂的作用是增大菌体细胞的通透性，
从而有利于底物的吸收及产物的释放。在转化体
系中加入的非离子型表面活性剂吐温80(Tween80)
和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵
(CTAB)来考察其对转化反应的影响，质量分数为
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2007年8月 陈美娟等：一菌双酶法制备L4一氟苯丙氨酸的研究 ·55·
0～0．12％。
如图5，相对于空白样可见，添加吐温80后，对
FPhe得率提高没有帮助，当添加CTAB质量分数为
0．04％时，FPhe得率最高，可能是由于CTAB是离
子型表面活性剂，使反应体系的电荷发生了变化，
有利于酶的催化。且由图可见，添加CTAB的效果
要比吐温80好，所以选择CTAB的添加量
为0．04％。
袋
＼
料
赡
o
l
山
[-
图5 表面活性剂对转化反应的影响
Fig．5Effectofreactionofsurfactant
2．5 FPPA的浓度对双酶催化反应的影响
当底物质量浓度比较低时，酶反应速率随着底
物质量浓度的升高而增大，反应速率越快底物发生
分解的几率越小，越利于转化的进行；而底物质量
浓度过高则可能产生底物抑制作用，从而抑制了酶
的活性。如图6所示，反应物系的最适FPPA质量
浓度为11．28g／L，这时FPPA的转化率和FPhe的
得率均最高。
2．6底物配比对双酶催化反应的影响
根据可逆反应原理，反应物过量有利于反应的
窆誉
壁谆
菠睫
矗毒
山k
图6 FPPA浓度对转化反应的影响
Fig．6EffectofreactionofconcentrationofFPPA
正向进行，所以使转氨反应中的氨基供体过量有利
用反应向FPhe方向进行，所以选取n(NH。+)：凡
(Fuma)：n(FPPA)=2．0：1．0：1．0～12．0：6．0：1．0
且口为n((NH。)：Fuma)：n(FPPA)=1．0：1．0～
6．0：1．0的配比范围来考察对反应的影响。由图7
可见，凡((NH。)：Fuma)：n(FPPA)=4．5：1时FPhe
得率最高，且摩尔比增大，FPPA的转化率和FPhe
得率均变化不大。因此理论最佳的底物摩尔比为
n((NH。)：Fuma)：凡(FPPA)=4．5：1，但从减少成本
的方面考虑，n((NH。)：Fuma)：n(FPPA)=3．0：1实
际底物摩尔比。
堡冰
整谆
菱熙
差毒
图7底物配比对转化反应的影响
Fig．7Effectofreactionsubstratetio
of(NH4)2FumaandPPA
2．7金属离子对双酶催化反应的影响
L一天冬氨酸酶除了催化位点外还有激活位点，
两价金属离子对它具有激活作用。综合考虑选择
对￡．天冬氨酸转氨酶也具有激活作用的金属离子
来考察金属离子对转氨反应的影响，金属离子的最
终浓度为1mmol／L。
由图8可见，与空白样(Blank即无金属离子添
加)相对比添加金属离子使FPPA转化率均有所提
高，添加c02+、Zn2+、M92+、Fe2+后FPhe得率都相应
提高，而添加Fe2+后，效果最明显；添加Mn2+的反
应中，FPPA转化接近完全，但FPhe得率却相对降
低，造成这种结果的原因可能是Mn2+促进了FPPA
的分解，使分解速率在一定程度上超过了催化速率。
2．8 L．Asp对双酶催化反应的影响
L—Asp既对￡．天冬氨酸酶有激活作用，又是L一
天冬氨酸转氨酶参与的转氨反应的氨基供体，因
此，理论上在转化体系中添加L—Asp定会对双酶转
化起到促进作用。如图9可见，在转化体系中加人
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Science：新催化工艺加快葡萄糖替代石油步伐
在最新的研究中，来自美国能源部西北太平洋国家实验室(PacificNorthwestNationalL boratory，简称
PNNL)的科学家找到了一种新的催化工艺，能够直接将糖类转换成某些石油产物的替代来源。
PNNL化学家ZhangZ．Conrad和同事尝试了多种金属催化剂，结果发现，离子液体(ionicl qu d)催化剂
能够有效地将葡萄糖等糖类转化成羟甲基糠醛(HMF)，他被认为石油化学中最有前途的代用品，能够容易
地转化为多种化学制品和塑胶。Zhang说，“葡萄糖能够直接从纤维素和淀粉得到，他是自然界最充足的碳
水化合物材料。而由果糖和葡萄糖产生的HMF是一个‘万能’的平台，他能够制造数百种其他化学物品。”
Zhang和同事通过实验证实，能够将质量分数70％的葡萄糖和接近质量分数90％的果糖转化为HMF。
新的研究成果有望成为生物质能(树木、秸秆、海藻等)转化为化学制品、塑胶和燃料的基础。Zhang的下一
步工作是要改进离子溶剂与金属卤化物化合物，看看是否能够增加葡萄糖的HMF产量，并同时减少分离、纯
化的成本。
美国科学家研究麦秆产生物T醇
美国农业部农业研究所ARS利用拜氏梭菌转化纤维素生物质为生物丁醇。生物丁醇能成为一个重要
的可再生运输能源，因为它拥有比乙醇更高的能含量。它可以用在现有的汽油供应，有更高的辛烷值，并能
和汽油以任何比例混合。
为了减少丁醇生产的成本，研究人员在将麦秆转化成丁醇之前，先将其水解成木质纤维素糖(葡萄糖、
木糖、树胶醛糖、半乳糖和甘露糖)。麦秆水解产物转化成了醇的产率超过葡萄糖。
研制经济可行的麦秆丁醇发酵法对于农民、丁醇生产企业和广大市民是有益的。由于汽油价格的持续
攀高，发展经济上可行的燃料生产过程是必要的。
日前，杜邦公司和BP宣布，生物厂醇成为合作生产燃料的头版信息，他们承诺在很长的一段时问内，生
物丁醇可作为汽油的替代品。另一家生物技术公司GreenBiologics，也获得大量的资金(855000欧元)，用于
研究纤维素生物质生产燃料的发展战略。
(张春鹏)
万方数据