全 文 ：第6卷第5期
2008年9月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Sep．2008
· 55·
幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选及鉴定
纪 卿1一，丁虎生1，杨 炼1，王铁斌1’2，张灏1’2，陈 卫1
(1．江南大学食品学院，无锡214122；2．江南大学生物工程学院，无锡214122)
摘要：为了获得幽门螺旋杆菌特异性单链抗体scFv，通过噬茵体展示技术，首次直接用幽门螺旋杆菌细胞Hp对
噬菌体单链抗体文库Tomlinson进行单链抗体的筛选，经5轮筛选后．通过ELISA方法检测。从随机挑选的96个克
隆中获得了8株阳性克隆。再分别将阳性克隆与10种常见茵进行El。ISA的交叉反应，最终得到l株特异性表达
抗Hp的scFv的噬菌体JHl。随后又进一步对JHI所表达的scFv基因进行PCR扩增，分别得到scFv的VH片段、
VL片段，全长基因分别为527bp、368bp和935bp，这些包含着部分载体序列的DNA片段与理论值相符。通过对
scFv全长基因进行测序，在NCBI中进行基因序列比对，与已报道的一种植物RNA病毒的复制酶单链抗体基因序
列有96％同源性。
关键词：幽门螺旋杆菌；噬茵体展示；seFv；细胞筛选；ELISA
中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0055—05
Screeningandidentificationofsinglechaina tibody
fragmentagainstHelicobacterpylori
JIQin91一，DINGHu．shen91，YANGLianl，WANGTie．binl一，ZHANGHa01一，CHENWeil
(1．SchoolfFoodScienceandTechnology，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China；
2．SchoolfBioteehnology，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Aphage—displayedsingle-chainvariablefragmentisselected(scFv)tospecificallybindHeli—
cobacterpriori(Hp)．TheintactHpcellswerepannedagainstthehumanscFvlibraries(Tomlinson)．
Eightpositivecloneswereobtainedfrom96randomclonesafterfiveroundscreeningandELISAassay．
Finally，onlyasinOecloneJHl，whichexpressescFvpecificallybindingtoHp，wasselectedforno
crossreactionwith10differentbacteria．PCRofVH，VLandscFvgenefromJHlshowedthatthesizeof
VH，VLandscFvgenewere527bp，368bpand935bp，respectively．SequencingforscFvandthe
BLASTinNCBIindicatedthgenewas96％homologouswithaknownscFv，whichwaspecifictothe
replicaseofaplant(+)RNAvirus．
Keywords：Helicobacterpriori；phagedisplay；scFv；cellscreening；ELISA
早在一个世纪前，就有人胃内存在细菌的报
道⋯。1983年，医学家从慢性胃炎患者胃黏膜中成
功分离出幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，Hp)后，
引起了国际上的广泛关注‘2|。幽门螺旋杆菌是一
种革兰氏阴性螺旋状杆菌，在胃上皮细胞定居繁
殖。大量研究证实，Hp是慢性胃炎、消化性溃疡及
收稿日期：2008-01-23
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(NCET-06-0482)
作者简介：纪卿(1982一)，男，河北石家庄人，硕士。研究方向：微生物学。
联系人：陈卫，教授，E-mail：weichen@jiangnan．edu．cn
万方数据
· 56· 生物加工过程 第6卷第5期
胃肠道淋巴瘤的主要致病因素，并与胃癌发生密切
相关，国际癌症研究中心(IARC)于1994年将Hp
列为I类致癌因子旧J。目前消化性溃疡患者根除
Hp的主要策略是依靠三联治疗，包括铋剂合用两种
抗生素或质子泵抑制剂加一种／两种抗生素。但是
抗生素治疗在体内的效率较低、复发率高，并且还
会出现耐药菌株等因素而限制药物的疗效。因此
获得能够特异性抗幽门螺旋杆菌的抗体成为现在
众多学者研究方向。
噬菌体展示技术(phagedisplay)于1985年由
Smith最早提出MJ。1994年McCaffery等¨o最先构
建了噬菌体多肽库和抗体展示技术库。噬菌体展
示技术建立了基因型(genotype)和表型(phenotype)
之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效，人类
跨入噬菌体技术广泛应用的新时代。现在，越来越
多的研究人员将噬菌体展示技术应用于幽门螺旋
杆菌抗体的研究中，目前报道的已经证实的幽门螺
旋杆菌抗原包括VacA、Ure、CagA、过氧化氢酶和Hp
GroES蛋白等。6J 2000年，Cao等"1从鼠杂交瘤中
筛选出抗Hp的scFv；2001年，Houimel等【8‘从噬菌
体抗体库中筛选出了Hp脲酶的人源单链抗体；
2002年，Reiche等一。筛选出HpUre的人源scFv。
但直接采用Hp细胞对噬菌体单链抗体文库筛选特
异性单链抗体scFv．还未见报道。本文通过噬菌体
展示技术，首次用Hp细胞直接对单链抗体文库进
行细胞筛选，获得对Hp特异性的scFv，并进行PCR
鉴定和基因序列分析。
1材料与方法
1．1主要材料和仪器
1．1．1材料
人单链抗体文库Tomlinson、辅助噬菌体
KMl3、E．coliTGl(Tr)均购自剑桥大学MRC分子
生物学实验室；国际标准菌株幽门螺旋杆菌SSl，
上海消化病研究所提供；大肠杆菌HB2151、辣根
过氧化酶标记的抗鼠二抗(SABC)和辣根过氧化
酶耦联的抗M13抗体，购自AmershamPharmacia；
蛋白胨、酵母抽提物、哥伦比亚琼脂和幽门螺旋杆
菌选择添加物，购自OXOID公司；酶标板，购自
Nunc公司；脱脂乳、琼脂糖、质粒抽提试剂盒和
DNA回收试剂盒，购自BBI公司；其他试剂均为国
产分析纯。
1．1．2仪器
凝胶成像系统GelDocXR(美国BIO—RAD公
司)和核酸电泳仪(北京六一仪器厂)，PCR仪
G—Strom(英国GRI公司)，酶标仪ThermoMuhiskan
MK3(美国Thermo公司)，CO：培养箱HERAcell
240(德国Heraeus公司)
1．1．3培养基
(1)改良哥伦比亚琼脂选择性培养基
取哥伦比亚琼脂39g加到lL双蒸水中，经过
121℃灭菌20min后冷却至50℃，加入预温的脱纤
维绵羊血和Hp选择性添加物分别至终体积分数
7％和4％，浇制哥伦比亚血平板，待培养基凝固后，
倒置于4℃过夜。本改良培养基是将文献[10]报
道中马血换为脱纤维绵羊血。
(2)Tomlinson文库扩增基础培养基
液体培养基(2XTY)：胰蛋白胨16g；酵母抽提
物10g；氯化钠5g；双蒸水1L。于灭菌锅中121℃
灭菌20min。
固体培养基(rⅣE)：琼脂15g；氯化钠8g；胰蛋
白胨10g；酵母抽提物5g；双蒸水1L。于灭菌锅中
121℃灭菌20min。
(3)Tomlinson文库筛选培养基
筛选液体培养基：在基础液体培养基中添加氨
苄青霉素至终质量浓度为100峙／mL，添加葡萄糖至
终质量分数为1％。
筛选固体培养基：在基础固体培养基中添加氨苄
青霉素至终浓度为100彬rIlL，添加葡萄糖至终质量分
数为1％。
1．2实验方法
】．2．1幽门螺旋杆菌的培养
将Hp菌液涂布于哥伦比亚血平板上，置于
CO：培养箱中，37℃微氧环境(O：体积分数5％、
cO：体积分数10％、N：体积分数85％)活化24h¨0|，
再经反复活化两次后，转接于新配制的哥伦比亚血
平板上，37℃微氧环境培养36h。
1．2．2噬菌体文库的扩增以及滴度测定
噬菌体文库的扩增和滴度测定参照文献[11]。
1．2．3scFv单链抗体的筛选
取1．5mL5％脱脂乳加入EP管封闭过夜。用
磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次。取100ILL浓度约为
1．73X10”个／mL的单链抗体文库和200ILL质量
分数5％脱脂乳加入封闭好的EP管中，冰浴1h，取
3300g离一L,10min，取上清液加入200斗L细胞浓度
万方数据
2008年9月 纪卿等：幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选及鉴定 ·57·
约为106-@／mL混合菌液中(含10种常见菌，由沙门
氏菌、酿酒酵母、枯草杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、
瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、乳链球菌、鼠李糖乳杆
菌、双歧杆菌按照等比例混合)，37℃水浴30min，
取3300g离心10rain，上清液转移到200斗L细胞
浓度约为106个／mLHp细胞悬液中，37℃水浴30
min。取3300gN心10min，弃上清液，分别用含体
积分数1％Tween-20的PBS和PBS各洗涤5次。
用1mLTBS一胰蛋白酶(10斗g／mL)重新悬浮Hp细
胞，37℃洗脱30min。对洗脱下的噬菌体进行滴度
测定和噬菌体的扩增，详细过程参照文献[11]。如
此反复进行5轮筛选，计算每轮噬菌体的回收率。
1．2．4单克隆scFv的挑选及ELISA检测
随机挑取最后一轮筛选后得到的噬菌体浸染过的
EcoliTGl的单菌落，分别培养并扩增单克隆scFv，用
于做单链抗体的ELISA检测。单克隆的挑取、培养以
及单克隆scFv的扩增与制备过程参照文献[11]。
将新鲜的Hp细胞悬浮于PBS中，用PBS以10
倍梯度进行稀释，镜检后取100斗L浓度约为
106个／mL的Hp细胞加入到酶标板中，取l800g离
心10min，轻轻吸去上清液，每孔加入100灿体积
分数0．25％戊二醛，37℃孵育2h，固定细胞。对固
定后的Hp细胞进行ELISA检测，检测方法参照文
献[11]。实验中采用将100斗LPBS加人到酶标板
中与Hp细胞相邻一排的孔中，作为阴性对照。
1．2．5测定阳性克隆交叉反应
用100“L体积分数0．25％戊二醛分别将10
种常见菌中的每一种菌细胞和新鲜培养的Hp细胞
固定于酶标板中，进行ELISA检测，检测方法参照
文献[11]。实验中分别将10种常见菌作为阴性对
照，加入到酶标板中与Hp相邻一排的孔中。
1．2．6阳性克隆的scFv基因的PCR鉴定
挑选无交叉反应阳性克隆，接入到文库筛选液
体培养基中，37℃培养过夜。第2天，用质粒抽提
试剂盒抽提质粒，将抽提后的质粒进行PCR扩增，
PCR扩增引物序列和反应条件参照文献[11]，抗体
重链可变区VH上游引物：5’-CAGG ACAGCT
ATGAC一3’，VH下游引物：5’一CGAC CGCCACC
GCCGCTG-3’；抗体轻链可变区VL上游引物：5’一
CATCTGTAGAGACAGAGTC一3’，VL下游引
物：5’一CTAGCGGCCCATrCA一3’：scFvDNA上
游引物： ’．CAGAACAGCTATGAC-3’．scFv
DNA下游引物：5’一CTATGCGGCCCA1rrCA一3’。
扩增条件：95oC变性60s，55oC退火45s，72oC延伸
120s，循环30次后，72℃保温10min，用质量分数
为2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。
1．2．7scFv基因测序
将经PCR扩增后的scFvDNA片段送往上海生
工测序部进行DNA测序，测序引物为：5’．CAG
GAACAGCTATGAC一3’和5’一CTATGCGGC
CCCA"ITCA-3’．
2结果与讨论
2．1从Tomlisom噬菌体文库中筛选Hp的单链抗体
Tomlisom噬菌体文库，经过扩增后文库的浓度
约为1．73x1013个／mL。经5轮筛选，每轮筛选结
果都由洗脱得到的噬菌体的滴度来评定。从表1中
可明显得知，每轮经过洗脱后的噬菌体回收率从
3．28×10“逐渐上升到3．50×10～，在第四、五轮中
噬菌体的回收率基本趋近于平衡，表明筛选已经趋
近于饱和。富集倍数也由1上升至106．71，证明噬
菌体得到了特异性的富集。由于本实验是第一次
采用Hp细胞筛选噬菌体文库，为了筛选到特异性
高的单链抗体，在Hp细胞与噬菌体文库吸附之前，
先将噬菌体文库与混合菌液进行预吸附。此方法
可以在一定程度上有效地去除Hp非特异性吸附的
噬菌体，同时也大大提高了筛选效率。
表1筛选过程中噬茵体的选择性富集
TableSelectiveenrichmentofscFvfromthelibrariesduringpanning
1)回收率(％)=(噬菌体回收量×100)／(噬菌体加入量)；
2)富集倍数：将第一轮的回收率定为1，后几轮的回收率分别与第一轮回收率的比值。
万方数据
· 58· 生物加工过程 第6卷第5期
2．2单克隆scFv的挑选及ELISA检测 面存在与Hp具有相同或相似的抗原‘61，因此对上述得
经5轮筛选后，在经最后一轮筛选得到的噬菌 到的噬菌体阳性克隆进行交叉反应实验是十分必要
体浸染的E．coliTGl在筛选固体培养基平板上生长 的，从而可进一步获得具有更高特异性的噬菌体。
的单菌落中，随机挑选96株单克隆于2块酶标板做 通过ELISA方法对这8株阳性克隆与10种常
ELISA鉴定，将PBS作为阴性对照，加入到酶标板中见菌进行交叉反应实验。从表2中可以明显得知，
与Hp相邻一排的孔中。ELISA鉴定结果得到8株只有阳性克隆JHl与所反应的10株常见菌均无任
阳性克隆，分别命名为：JA9，JC4，JF3，JFll，JG7，何交叉反应现象，而另外7株阳性克隆与这10株菌
JHl，JH6和JHl2。 有不同程度的交叉反应现象。交叉反应现象的发
2．3 测定阳性克隆交叉反应 生也从侧面证实Hp细胞表面也存在着与其他常见
采用Hp细胞对噬菌体文库进行筛选，由于细胞表 菌相似的表面抗原。因此，阳性克隆株JHl所表达
面的抗原位点繁多，据报道，一些常见菌(如最co／i)表的scFv对Hp具有较高的特异性。
表2阳性克隆与不同茵的交叉反应
Table2 Positiveclonecrossreactionwithdifferentbac eria
一。 阳性克隆
困名—面■—面■—丽—1而广—面-_■而—■而—1面厂
沙门氏菌(Salmonella) 一 + + 一 一 一 一 +
酿酒酵母(S．cerevisiae) 一 一 十 一 + 一 一 一
枯草芽孢杆菌(B．subtilu) 一 一 一 一 一 一 十 一
大肠杆菌(E．coli) 一 一 一 一 一 一 一 一
嗜酸孚L杆菌(厶acidophilus)+ 一 一 一 + 一 + +
瑞士孚L杆菌(Lhelvetic哪) 一 一 一 一 一 一 一 一
植物孚L杆菌(Lplantrum) 一 一 一 + 一 一 一 一
干酪孚L杆菌(Lcasei) 一 + 一 一 + 一 一 一
鼠李糖孚L杆菌(￡．rhamnose)+ 一 一 一 一 一 一 +
巫丝主上笪!里型!尘!竺!!型兰里2 = = = = = = = ±
2．4阳性克隆株JHlscFv的PCR鉴定
为了进一步鉴定阳性克隆株JHl所插入的
scFv的片段是否正确，需对JHl所插入的scFv进行
PCR鉴定。测序引物序列由Invitrogen生物技术公
司合成。PCR扩增片段经质量分数为2％琼脂糖凝
胶电泳分析。从图1可以明显得知，位于第二泳道
的scFv的VH链大小约为527bp；第三泳道的scFv
的VL链大小约为368bp；第四泳道的scFv基因大
小约为935bp，这些包含着部分载体序列的DNA片
段与理论值相符。表明筛选到的噬菌体阳性克隆
JHl所插入的scFv的片段大小是正确的。
2．5阳性克隆JHlscFvDNA片段测序
JHI所表达的scFv的DNA测序，得到序列如下：
5’．ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCT
GGATrGTrATTACTCGCGGCCCGC GCCATGGCC
GAGGTGCAGCTGTFGGAGTCTGGGGGAGGC‘ITGGT
ACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGl’GCAG
CCTCTGGATYCACClrrrAGCAGCTATGCCATGAGCT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG
GGTCTCATCAl『rI，IATACTATGGTFGGATACAACTTA
1一DNAmarker；2--VH；3一VL；4一∞Fv
图1 JHI的VH，VL和seFv基因的PCR鉴定
Fig．1PERidentificationofVII，VLandscFvDNAfromJHl
CGCAGACTCCGTGAAGGGCCGG7IfllCACCATCTCCA
GAGACAATYCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATG
AACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATA刀彳
CTGTGCGAAAGCTGAl[℃CTAGTlTrGACTACTGGG
GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGA
万方数据
2008年9月 纪卿等：幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选及鉴定 · 59
GGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCG
GGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCC
TCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT
TACTIGCCGGGCAAGTCAGAGCATFAGCAGCTATT
TAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCC
TAAGCTCCTGATCTGTTCTGCATCCGCTnlGCAAAG
TGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTG
GGACAG众1TITrCACTCTCACCATCAGCAGTeTGCAA
CCTGAGATITITGCACITACTACTGTCACAGGCTGA
TATACTCCTGCTACG"ITCGGCCAAGGGACCAAGG
TGGAAATCAAACGGTGCGGCCGCA．3’
从上述DNA序列可看出，这个单链抗体基冈核
心区域序列(除掉载体序列部分)有789个碱基，将
基因序列提交由NCBI，用BLAST软件(http：／／
www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／Blast．cgi)进行同源性
搜索。比对结果与现在已报道的一种植物RNA病
毒的复制酶单链抗体H2’有96％基因序列同源性。
对应的抗体蛋白由263个氨基酸组成，翻译的
氨基酸序列如下：
MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAM
AEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA
ASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEW
VSSFILWLDTTYADSVKGRFTI SR
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY
CAKADASFDYWG0GTLVTVSSGG
GGSGGGGSGGGGSTD10MTOSPS S
LSASVGDRVTITCRASOSIS SYLNW
YQQKPGKAPKLLICSASALOSGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEILH
LLLSQADILLLRSAKGPRWKSNGA
AA
其中VH区域是从第39个氨基酸开始到第119
个氨基酸结束，有81个氨基酸残基组成；VL区域是
从第171个氨基酸开始到第235个氨基酸结束，有
65个氨基酸残基组成。
3结论
通过应用噬菌体展示技术，首次直接用Hp细
胞对噬菌体单链抗体库进行细胞筛选，经5轮筛选，
通过ELISA方法检测，从随机挑选的96个克隆中
获得了8个阳性克隆。再将阳性克隆与10种常见
菌进行ELISA的交叉反应鉴定，其中只有JHl与这
些菌均无交叉反应。随后又进一步对JHl所表达
的scFv基因进行PCR扩增，得到scFv的VH片段、
VL片段，全长基因分别为527bp、368bp和935bp，
这些包含着部分载体序列的DN 片段与理论值相
符，表明筛选到的噬菌体阳性克隆JHI所插人的
scFv的片段大小是正确的。通过对scFv全长基因
进行测序鉴定，之后将其在NCBI中进行基因序列
比对，与已报道的一种植物RNA病毒的复制酶单链
抗体有96％基因序列同源性。由于目前许多研究
者都是针对幽门螺旋杆菌的单一抗原进行抗体的
筛选及研究，对Hp细胞筛选的研究还未见报道，本
文首次采用幽门螺旋杆菌完整细胞通过噬菌体展
示技术进行单链抗体的筛选，为幽门螺旋杆菌的单
链抗体研究提供了新的思路。
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