全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
·41·
纤维素硫酸钠一聚二甲基二烯丙基氯化铵微胶囊
固定化Candidakrusei产甘油条件优化
陈 国1，姚善泾2，方柏山1，彭益强1
(1．华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室，泉州362021；
2．浙江大学 化学工程与生物工程学系，杭州310027)
摘要：研究了利用一种新型的纤维素硫酸钠／聚二甲基二烯丙基氯化铵(NaCS／PDMDAAC)中空微胶囊包埋Can-
didakruseiZJU5205制备甘油的过程。通过摇瓶培养过程中对初始包茵量、胶囊和胶珠、初始甘油浓度、胶囊大小、
胶囊体积／发酵液体积等关键固定化参数和培养条件的优化，确立了NaCS／PDMD从c微胶囊固定化Cand／dakrusei
的最佳工艺参数为包茵量为0．6g／L，发酵初加入20g／L甘油，胶囊体积／发酵液体积为0．4。
关键词：Candidakrusei；发酵；固定化细胞；微胶囊；优化
中图分类号：Q939．7 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)01—0041—06
Optimizationofcapsuleparametersandcultivationconditionsofe capsulated
CandidakruseiforproducingglycerolinNaCS／PDMDAACcapsules
CHENGu01，YAOShan-jin92，FANGBai．shanl，PENGYi．qian91
(1．KeyLaboratoryofIndustrialB otechnology，Huaqi∞University，Quanzhou362021，China；
2．DepartmentofBiochemicalandChemicMEngineering，ZhejiangUniversity，Hangzhou310027，China)
t
Abstract：TheproductionofglycerolfromglucosebyCandidakruseiZJU5205encapsulatedinsodium
cellulosesulfate／poly[dimethyl(dially)ammoniumchloride]capsuleswitllaliq idcorewasinvestiga-
ted．Optimizationofthecapsuleparametersandcultivationconditionsincludingtheinitialce lloadingat
0．6g／L，initialglycerolconcentrationat20s／L，diameterofcapsule，ratioofcapsulevolumetomedium
volumeusingshakeflaskwascarriedout．
Keywords：Candidakrusei；fermentation；immobilizedcell； icrocapsule；optimization
甘油是一种重要的化工产品，在医药、化妆品、
食品、化工等领域都有着重要的用途。使用生物发
酵法¨1生产甘油是一条环境友好的生产途径，随着
甘油用途的扩展和可持续发展的需求，该方法越来
越受到重视。国内主要有江南大学旧。31和清华大
学【4。1长期从事发酵法生产甘油的研究。
采用固定化细胞M一71生产有用的化学物质是生
物工程领域研究的一个重要内容。通过固定化不仅
可重复利用蔚体，缩短发酵时间，提高生产强度；而且
便于连续操作和后续分离的进行。NaCS—PDMDAAC
胶囊哺一¨是一种用于细胞固定化的新型微胶囊，本
实验室已进行过多年的研究(包括NaCS的制备、微
收稿日期：2007-03-29
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20576118)；福建省青年人才资助项目(2006F3080)；华侨大学高层次人才科研启动基金资助项
目(06BS214)
作者简介：陈国(1978一)，男，安徽巢湖人，博士，讲师，研究方向：生物化工。E—mail：chenguo@china．com．cn
万方数据
·42· 生物加工过程 第6卷第1期
胶囊的制备过程、扩散性能、截留相对分子质量、生物
相容性、固定化培养都进行过系列的研究)。
文献中尚未见到有固定化细胞生产甘油的报道。
考虑到底物葡萄糖和产物甘油都是相对分子质量较
小的物质，可自由通过微胶囊。本文拟研究用NaCS．
PDMDAAC胶囊固定化Cand／dakrusei产甘油的过
程，并对由固定化引起的一系列影响因素(包菌量，胶
囊直径，胶囊量等)进行考察。细胞通过微胶囊包埋
后，一方面可截留细胞，得到囊外澄清的发酵液，简化
后续甘油的分离和纯化步骤；另一方面，囊外的发酵
液也可直接用于微生物发酵生产1，3．丙二醇的原料，
省去了料液处理的步骤，简化了两步发酵法由葡萄糖
直接生产1，3一丙二醇工艺步骤。
1材料与方法
1．1 实验菌种和培养基组成
酵母CandidakruseiZJU5205由浙江大学生物
工程研究所保存。
产甘油假丝酵母培养基组成：葡萄糖200g／L、玉
米浆3．0g／L，尿素2．5g／L、磷酸二氢钾3．5g／L。
1．2固定化方法
NaCS—PDMDAAC微胶囊是由纤维素硫酸钠
(NaCS)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDMDAAC)
两种水溶性高分子聚电解质反应构成。实验中采
用的制备微胶囊装置如图l所示。
图1胶囊的自动滴制示意图
Fig．1Schematicdiagramof utomaticpreparation
equipmentformicrocapsules
胶囊制备方法：把种子液用无菌水稀释一定倍
数后，加入NaCS，使其分数为4．0％，搅拌至NaCS
全部溶解。将含Candidakrusei的NaCS溶液滴入
7．0％PDMDAAC溶液中，同时不断搅拌，反应40—
60min后，待成膜反应基本完成之后，用去离子水
冲洗3—6次，除去胶囊表面残余PDMDAAC。所用
试剂均经灭菌处理，操作在无菌工作台进行。
胶珠制备方法：配置含酵母种子液的海藻酸钠
溶液(质量分数为1％)，搅拌均匀后，用注射器将其
滴入氯化钙溶液(质量分数为0．9％)，反应20rain
后，用无菌水洗涤3次，得到待培养的胶珠。
1．3培养方法
胶囊与发酵液按一定比例(如无说明均为3：5)
置于摇瓶中，摇瓶的装液量为10％。培养条件为
35℃，150r／min，定时取样检测葡萄糖和甘油浓度。
1．4分析方法
生物量的测定采用比浊法，利用预先建立的
650nm下浊度与细胞干质量之间的关系计算细胞
干质量。葡萄糖质量浓度采用DNS法测定【12|。甘
油含量测定采用改进的高碘酸氧化滴定法【l3|。
2结果和讨论
2．1 不同初始包茵量的影响
测定种子液菌浓，根据需要制备含不同初始菌浓
的胶囊。在同样条件下，考察不同初始包菌量对固定
化发酵过程的影响，测定葡萄糖浓度和甘油浓度随发
酵时间的变化。从图2可看出，当包菌量为6g／L
时，葡萄糖消耗最陕，在培养前64h内迅速下降，64h
后葡萄糖基本消耗完全；当包菌量为0．6s／L时，葡
萄糖消耗最慢，在培养124h后仍有约18g／L的残留
葡萄糖；包菌量为0．06g／L时，初期葡萄糖消耗迅
速，培养20h以后，葡萄糖浓度与包菌量0．6s／L时
几乎平行下降，在124h后，残留葡萄糖浓度约为15
g／L。从图3可得，在发酵的前20h，包菌量为0．6
g／L与6s／L时，发酵生成的甘油量几乎相同，之后包
菌量为6g／L的甘油量几乎没有增加，而包菌量为
0．6g／L的摇瓶中甘油浓度继续上升，在40～100h
之间经历一个平稳期后，继续增长，且在124h后仍
保持上升趋势。包菌量为0．06s／L时，由于菌体生
长需消耗一定时间，故在发酵开始阶段，葡萄糖消耗
较快，甘油增长较慢，可推断菌体在此时间内生长旺
盛，同样在40～100h经历了一个平稳期后，甘油浓度
继续增加，124h后仍有上升趋势。根据游离培养的
经验，糖耗慢，则终甘油浓度高，与图3的实验现象相
符。通过对不同的包菌量对固定化Candidakrusei发
酵的产甘油影响的考察。结果表明，包菌量为0．6
g／L时，发酵最为成功，所以在后续的固定化研究中均
采用了0．6g／L的包菌量。
万方数据
2008年1月陈国等：纤维素硫辩聚二甲基二烯丙基氯戡鳓虢礓固定化饧，斌如b乱se／产甘油剩斗优化-43·
150
100
O 20 40 60 80 100 120140
珈
图2初始包菌量对葡萄糖消耗的影响
Fig．2Effectofimtialce lconcentrationin
capsuleonglucoseconsumption
图3初始包菌量对发酵产甘油的影响
Fig．3Effectofin“iMcellconcentrationin
capsuleonglycerolproduction
2．2胶囊和胶珠的对比
分别采用NaCs／PDMDAAC微胶囊和海藻酸钙
胶珠固定化Cand／da／cruse／，在相同的初始包菌量下，
比较了发酵产甘油过程中葡萄糖消耗和甘油生成情
况。从图4可看出，海藻酸钙胶珠固定化的细胞发酵
过程，培养110h后，葡萄糖基本消耗完全；而以
NaCS／PDMDAAC微胶囊固定化Candidakrusei发酵
时，葡萄糖浓度在发酵124h后仍有近20g／L，与前
面的研究结果一致。图5显示了用海藻酸钙胶珠固
定化Candidakrusei发酵得到的甘油浓度是NaCS／
PDMDAC微胶囊固定化Candidakrusei时的两倍多
(前者为26g／L，后者为12g／L)。以此来看，海藻酸
钙胶珠固定化Candidakrusei发酵优势明显。其实不
然，在发酵开始几小时后，海藻酸钙胶珠便开始发生
酵母的泄漏，发酵液变浑浊，镜检表明为游离的Can-
didakrusei。以上现象说明，海藻酸钙胶珠固定化
Candidakrusei发酵是游离培养和固定化培养的混合
模式培养，难以获得所需的澄清发酵液。因此，在后
续的研究中，采用NaCS／PDMDAAC微胶囊固定化
Candidakrusei作为考察的重点。
芎
蠢
蓬
乜
图4固定化方法(胶囊和胶珠)对葡萄糖消耗的影响
Fig．4Effectofimmobilizationme h ds(capsule
andbead)ongluco肫consumption
O 20 40 60 80 100120140
ah
图5固定化方法(胶囊和胶珠)对发酵过程中
甘油产量的影响
Fig．5Effectofimmobilizationme h ds(capsule
andbead)onglycerolproduction
2．3 不同胶囊大小对Candidakrusei发酵过程的影响
胶囊的大小会影响到氧及底物的传质¨4|，从而
影响发酵的结果。因此，通过实验室自制的气流微
囊发生器制备平均直径分别为2．6mm、1．6mm和
1．0mm的胶囊，考察了胶囊大小对发酵过程的影
响。包菌量均为0．6s／L，初试葡萄糖质量浓度为
300s／L。从图6和图7可以看到，胶囊直径越小，
葡萄糖消耗越快，发酵液中甘油浓度越高。由于采
用了300s／L的底物葡萄糖质量浓度，在发酵进行
了160h后，残留葡萄糖浓度仍然有50～70g／L。
一I．1．∞)／(黎籽粒一q
笱
加
：2
m
5
O
—1．1．掌一雳皂q
万方数据
．44· 生物加工过程 第6卷第1期
发酵160h后，直径为2．6am、1．6mm、1．0mm的
NaCs／PDMDAAC微胶囊的甘油质量浓度分别为23
∥L、33g／L和36g／L。通过对图6和图7的分析，
可清楚地看到小胶囊的传质优势。在总胶囊体积
不变的情况下，胶囊体积变小，比表面积增大，囊外
发酵液与胶囊接触的面积增大，在胶囊本身扩散系
数不变的情况下，单位时间进入胶囊内的底物变
多，可改善囊内底物限制的影响，从而提高甘油的
转化率和最终甘油浓度。
图6胶囊大小对葡萄糖消耗的影响
Fig．6EffectofcapsulesizeondUCOSeconsumption
40
35
30
，25
÷20
詈15
lO
5
0 20 40 60 80 100120140160
t／h
图7胶囊大小对发酵产甘油的影响
Fig．7Effectofcapsulesizeonglycerolproduction
2．4 初始甘油浓度对Cand／dakrusei发酵过程的影响
根据先前的研究¨5‘，不同初始甘油浓度对发酵
过程有显著影响，这里比较了初始甘油浓度为0g／L
和20g／L对微囊化Candidakrusei发酵过程的影
响。图8和图9分别为初始甘油20g／L与不加甘
油的发酵过程，葡萄糖消耗与甘油生成的对比。两
者葡萄糖消耗曲线几乎重叠，在发酵160h后，残留
葡萄糖浓度分别为6s／L和10g／L。但甘油生成曲
线存在较大差别，发酵160h后，加入初始甘油的发
酵液产生的甘油(除去初始甘油)的浓度达到了40
g／L，是没加初始甘油的2倍。添加初始甘油诱导
Candidakrusei高产甘油原因可能是由于加入了甘
油作为渗透压调节剂，产生较高的渗透压，诱导耐
高渗假丝酵母产甘油关键酶的Gpdlp和Gpp2p(均
为渗透压诱导型)合成【l6I，从而获得较好的发酵效
果。因此，细胞微囊化后，添加渗透压调节剂，仍然
能有效提高甘油产量。
，
■
●
芒
垂
橱
琶
q
图8初始甘油量对发酵过程中葡萄糖消耗的影响
Fig．8Effectofinitialglycerolconcentration
onducoseconsumption
O 20 40 60 80 100120140160
t／h
图9初始甘油量对发酵产甘油的影响
Fig．9Effectofinitialglycerolconcentration
onglycerolproduction
2．5不同胶囊发酵液体积比
胶囊与发酵液的体积比也是影响发酵结果的
一个重要因素，这里考察了胶囊与发酵液体积比为
0．4，0．6和0．8三个水平上的发酵结果。即在装有
50mL培养基的500mL摇瓶中分别加入具有相同
初始包菌量(0．6s／L)的胶囊20mL，30mL和40
mL后，培养160h，检测葡萄糖浓度和甘油浓度随时
一_-1．蠢糖浆一q
∞
∞
∞
∞
加
m
—l-1．誓一察扛一q
万方数据
2008年1月陈国等：纤|魉翮黼聚二甲基二烯丙基刘撬磁晦溪固定化Cand／da／们use／产甘油剩斗．忧化·45·
间的变化情况。从图10可看出，胶囊与发酵液体积
比为0．6和0．8时的葡萄糖消耗曲线几乎重叠，培
养160h后，残留葡萄糖约为10g／L。而当胶囊与
发酵液体积比为0．4时，葡萄糖消耗始终慢于胶囊
与发酵液体积比为0．6和0．8时的情况，培养160h
后残留葡萄糖浓度仍有50g／L。从图11可以发现，
在发酵开始的前60g内，胶囊与发酵液体积比对甘
油质量浓度几乎没有影响，60h过后，胶囊与发酵
液体积比越小，发酵产生的甘油浓度越大。发酵
160h后，胶囊与发酵液体积比为0．4、0．6和0．8时
甘油质量浓度分别为30g／L、24∥L和20g／L。在
一定范围内，胶囊与发酵液体积比越小，发酵产生
的最终甘油浓度越大。其主要原因可能是胶囊量
少，胶囊内部的氧分压相对较大，从而有利于甘油
的合成。
图lO胶囊与发酵液体积比对葡萄糖消耗的影响
Fig．10F_强feetofvolumeratioofcapsuletobulk
— mediumonglucoseconsumption
O 20 40 ∞ 80 loo120l加160
t／h
图11胶囊与发酵液体积比对发酵产甘油的影响
Fig．1lEffectofvolumeratioofcapsuletobulk
mediumonglycerolproduction
3结论
从固定化方法角度对固定化Candidakrusei细
胞产甘油过程进行了单因素优化，具体结果如下：
(1)考察不同包菌量对固定化Candidakrusei发
酵过程的影响，结果表明，包菌量为0．6g／L时，发
酵的最终甘油浓度较高。
(2)海藻酸钙胶珠固定化Candidakrusei发酵不
可避免的发生了酵母菌的泄漏，是游离培养和固定
化培养的混合培养模式，难以得到澄清的发酵液，
并不能简化后续的分离纯化步骤。而利用胶囊固
定化，虽然发酵时间较长，但可得到澄清的发酵液，
便于后续的分离和利用。
(3)用NaCS-PDMDAAC胶囊包埋Candidakm-
肥i发酵时，胶囊直径越小，葡萄糖消耗越快，发酵液
中甘油浓度越高，因此小胶囊传质优势明显，可改
善底物抑制和产物抑制的影响。
(4)NaCS／PDMDAAC微胶囊固定化Candida
krusei发酵过程中，加人20g／L的初始甘油确实可
以提高甘油的浓度与收率，且不会对残糖浓度产生
影响，因此细胞微囊化后，添加渗透压调节剂，仍可
有效促进甘油的生成。
(5)通过胶囊体秽发酵液体积比例的调节，结
果表明比例越小，越有利于甘油的生成，实验中，胶
囊体秽发酵液体积比为0．4时，得到较好的结果。
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加拿大EPI开发出环保氧化一生物降解塑料添加剂
加拿大EPI公司开发的氧化一生物降解塑料添加剂技术应用于传统聚烯烃塑料制品，不改变或影响塑料
传统加工制造过程；制品寿命可根据用途在生产中“编程”制造；制品强度和其他特性与传统塑料一样；制品
同样可以再生和循环加工使用；制品无论是堆肥、掩埋还是随意抛弃、最终都可变为CO：、水和生物量。并
且，氧化一生物降解塑料添加剂符合美国FDA和欧盟针对食品应用的EFSA。
巴西使用脂肪酶使棕榈油反酯化为生物柴油
巴西研究人员使用脂肪酶，将不同来源乙醇高产率地与棕榈油反酯化为生物柴油，其质量符合D6751
规格。该法使用反酯化的酶法工艺而不采用通常所用的碱催化工艺。
通常将三甘油酯反酯化为的商业化工艺，使用碱以得到高转化率和缩短反应时间。然而，该工艺相对
能量密集，副产物甘油回收困难，碱催化剂必须从产品中去除，并且水会影响反应。采用脂肪酶的酶法反酯
化可克服这些缺陷，反应温度很低，甘油回收较简单，且废水处理时不耗费催化剂。另外，废油和脂肪中的
游离脂肪酸可完全转化为烷基酯。酶也可回收再用。然而，与酶法反酯化有关的问题是反应速度、产率、产
品质量以及产品成本。
研究人员采用不同来源的脂肪酶使之固定在混合支撑的聚硅氧烷-聚(乙烯基醇)上。反应功能随酶不
同而有所变化。获得的最佳结果是，采用Pseudomonas∥∞麟∞瑚脂肪酶，反应小于24h，几乎可达到完全转
化(超过98％)。脂肪酸乙酯的纯度高，无甘油键。其他性质如水含量低(0．02％)、密度(O．8kg／L)、粘度
(4．97×10～Pa·S)，符合ASTMD6751规格。
(张春鹏)
万方数据