全 文 ：N01／．2007
·60·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第5卷第4期
2007年11月
从酿酒酵母中分离纯化谷胱甘肽
林志兴，吕永琴，丁轲，周 鑫，谭天伟
(北京化工大学 生命科学与技术学院生物加工过程重点实验室，北京100029)
摘要：为了提高酵母发酵生产谷胱甘胜的提取率．采用热水直接抽提的方法，并通过正交实验优化厦单因素实验
优化．得到优化务件：鲜酵母的质量与去离子水体积的比倒为1：12：抽提温度90℃；搅拌转速350r／min；当抽提液
温度达到90℃就停止抽提，并进行了热水抽提的放大实验。同时在抽提时加氮气保护，防止GSH部分氧化。抽提
渍离心除茵泥，经截流相对分子质量为104的超滤膜超滤后，除去大量杂蛋白，便于后续GSH的精制分离。通过对
饱和操作吸附容量厦解吸得率的研究。确定强酸型阳离子交换树脂D061为分离介质。
关键词：谷胱甘肤；正变实验；优化；超滤；离子变换树脂
中图分类号：TQ028．8 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)04—0060一05
Separationandpurificationofglutathionefr mSaccharomycescerevi iae
LINZhi—xing，LVYong—qin，DINGKe，ZHOUXin，TANTian—wei
(BeijingBioprocessK yLaboratory，CollegeofLifeScienceandTechnology
BeijingU ivers畸ofChemicMTeclmology。B蜘ing100029，China)
Abstract：Glutathione(GSH)ispmdu edbyyeastfermentation．Inordertogethighel"yieldofGSH．M-
tereentrifugatingthebroth，thefreshyeast．Anewmethodf rextractingghtathionewithotwaterwas
studied．Conditionsga nedwithorthogonalexperimentwere90℃，12mL／g，350r／rain，andstopping
extraction∞tlleextractionemperaturereached90℃．anda largerscalewasproceeded．Atthesame
timeitwa$necessarytoprotectglutathionew thN2fromoxidationintheprocess．Theextractionsolution
WaScentrifugated，thenultra-filtratedwithm mbraneof10KMWCO(molecularw ishtcut．off)tore．
movetheimpuritiesofproteins．Afterthiss p，theextractionwasuitableforthefollowingpurificationof
glutathione．Throughthestudyoftotaloperationexchangecapacityandtheratioofdesorption，D601WaS
determinedastheseparatingresin．
Keywords：glutathione；orthogonal-experiment；optimize；Ultra—filtration；ion-exchange；resin
谷胱片肽(Glutathione，GSH)是谷氨酸、甘氨酸
和半胱氨酸组成的具有重要生理功能的天然活性
三肽，在自然界中以氧化型(GSSG)和还原型
(GSH)的形式广泛存在于动物、植物和微生物细胞
中。经研究发现还原型的谷胱甘肽在生物体内有
着重要的生理功能”-2]，谷胱甘肽在l临床应用上作
为重要的解毒药物，在肿瘤，眼角膜病治疗，抑制艾
滋病病毒等方面应用广泛阻“，同时在食品添加剂、
收稿日期：2006·12一18
基金项目：国家自然科学基仝资助嘎目(20325622，20576013．50373003)；博士点基仝资助项目(20030010004)；国家“十五”虚关资助项
目(2004BA411805)
作者简介：林志井(1981一)，男．山东蓬幕人．硕士研究生，研究方向：生物分离。
联系人：谭天伟，教授，博士生寻师，教育部长江学者，E．mall：tantw@mail．bueteduc L
万方数据
2007年11月 林志兴等：从酿酒酵母中分离纯化谷胱甘肽
化妆品和运动营养学中的应用也成为研究热点。
GSH的生产方法主要有直接溶剂萃取法”1、发酵
法”1、酶法”。及化学合成等4种方法，目前主要以
酵母发酵法制取，也最具发展潜力，日本和欧洲一
些国家已实现了工业化生产，但国内一直未实现工
业化，主要难题是谷胱甘肽的分离纯化。在日本有
沸水提取的相关报道”40，国内周捕迪等””对热水
抽提进行了研究，发现热水提取在95—100℃之间，
抽提10min，收率达到90％；安贤惠等”1。“1也使用
多种抽提方法进行了研究，都认为热水提取在不超
过95℃时，提取率高，耗时短，经济且无污染，但只
是研究初步提取GSH，尚未建立一条工艺路线。目
前在工业生产中仍采用混合有机溶剂的方法来提
取，该方法时间长，溶剂用量大，成本较高““。本文
对热水抽提条件进行了正交优化及单因素优化，得
到了最佳的热水抽提条件，并进行了热水抽提放大
实验，放大实验结果显示本实验所采用的热水抽提
无放大效应，可应用于工业化生产。
1材料与方法
1．1材料与仪器
1．1．1材料
酿酒酵母菌体，本实验室发酵组提供。
1．1．2仪器
Alltech高效液相色谱(美国Alltech公司)；超
滤杯(中科膜技术公司)；台式离心机(上海安亭科
学仪器厂)；WFZUV-2000紫外可见分光光度计(尤
尼柯(上海)仪器有限公司)。
1．2方法
1．2．1谷胱甘肽分析方法
采用高压液相色谱法"1，并经本实验室改进。色
谱柱：Cjs250nm·×4．6mm加保护柱；流动相：缓冲液
A：0．1％TFA，H20；缓冲液B：O．1％TFA，CH3CN；缓
冲液c：y(A)：V(B)=96．25：3．75；柱温：29．8oC；流
速：n8mL／min；紫外检测器检测波长：214nm。
1．2．2蛋白质含量测定
Bradford检测法”“。
蛋白质含量测定采用分光光度法检测595n／n
的光吸收值大小计算蛋白质含量，用牛血清白蛋白
作为标准蛋白。
1．2．3工艺流程
酵母菌体——热水抽提——调pH至3．O——
离一b(4800r／min，8min)——上清液超滤(截流相
对分子质量104)——谷胱甘肽澄清液——离子交
换法分离谷胱甘肽。
lt2．4热水抽提
称取一定质量的新鲜酵母菌与定量的去离子
水混合，在一定的条件下进行抽提，迅速冷却至室
温，测定上清液中GSH的含量。
(a)去离子水体积倍数的单因素优化
实验采取了6个不同的水平，即取19鲜酵母分
别加入3mL、5mL、8mL、10mL、12mL、15mL的煮
沸的去离子水，其他条件固定为：抽提温度90℃，搅
拌转速350r／rain，抽提液刚达到抽提温度即停止继
续抽提，离心取上清液测定其csH含量。
(b)抽提温度的单因素优化实验
抽提温度取85、90、94、96、98oC5个不同的水
平，其他条件固定为：1g新鲜酵母菌，12mL煮沸的
去离子水，搅拌转速350r／min，抽提液刚达到抽提
温度即停止继续抽提，离心取上清液测定其GSH
含量。
1．2．5正交实验方法
实验采用了如表1所示的以每克新鲜酵母中的
GSH抽提量为评价指标的4因素4水平的正交实
验，详细考察了抽提温度、抽提时间、去离子水体积
倍数以及搅拌转速对抽提效率的影响。
表1热水抽提GSH的4周素4水平正交设计表
Table1 Thedesignchart0ffourfactorandfourlevels
0fex”aetionofCSHbyhotwater
A B C D
水平抽提温度／抽提时间／去离子水体积／搅拌转速／
屯 min
’
mL (r·rainll)
注：此处抽提时间是从抽提渡温度达到设定的抽提温度
起计算的时间，故0mia指抽提液刚达到抽提温度即停止继
续抽提
1．2．6抽提过程的N：保护措施
实验过程中为了防止抽提过程中GSH的氧化。
对有无N：保护的抽提条件进行对照研究。
1．2．7热水抽提的放大实验
取2蝇菌体按照最佳抽提条件进行抽提，计算
万方数据
·62· 生物加工过程 第5卷第4期
GsH回收率。
1．2．8超滤实验方法
采用截留相对分子质量为3×103，6×103，104，
3×104，6X104的聚砜纤维膜过滤离心得到的上清
液，记录超滤所用的时间、测定过滤液中GsH浓度
和杂蛋白浓度，从中选择一个合适的截留相对分子
质量的膜。
1．2．9谷胱甘肽稳定性实验
用GSH纯品配制浓度为5mmol／L的溶液，各
取30mL分别用浓HCl调pH值至1．93，2．90，
4．03，5．01，5．97，6．95，8．98，11．00；在20～25℃室
温下．敞口放入水浴振荡器中以50r／rain轻微晃
动，开始计时；在0，1，3，6，10，15，21，28，36，46h分
别取样测定不同pH值的GSH溶液中的GSH浓度。
1．2．10分离介质的选择与确定
在pH4．0下吸附谷胱甘肽，5％的blaOH溶液
解吸谷胱甘肽。比较各种树脂的操作吸附容量和
解吸得率，确定合适的分离介质。
2结果与讨论
2．1热水抽提正交实验及单因素实验结果与讨论
实验采用了以每克新鲜酵母中的GSH抽提量
为评价指标，通过单因素实验详细考察了抽提温
度、抽提时间对抽提效率的影响，并通过4因素4水
平的正交实验，考察了抽提温度、抽提时间、去离子
水体积倍数以及搅拌转速对抽提效率的协同影响。
2．1．1去离子水体积的单因素优化
由图l可以看出随着水体积倍数的提高，酵母
细胞释放出来的GSH越多，因而抽提效果也就越
好。推断其原因是抽提过程中酵母细胞内外的
GSH浓度存在某种平衡。当GSH浓度达到平衡时，
圈1去离子水体积优化
ng．1Ovfimizationofvolumeofdeionizedwater
酵母细胞内的GSH就会停止释放，因而在一定范围
内增加水体积可以不断提高GSH从酵母内释放的
总量 但当水体积增大到足够大时，GSH的释放总
量将不再增加，此时GSH抽提的得率达到最大，对
应的水体积与酵母质量之比为12。所以在菌体破
碎抽提时去离子水体积与酵母质量之比为12。
2．1．2抽提温度的单因素优化
图2中可以看出随着抽提温度的升高，从单位
质量酵母中提取到的GSH量先增大后减小，在90
℃下达到最大值。这说明温度在一定范围内升高
由于增加了细胞壁的通透性，有利于GSH从胞内向
外释放。由于GSH对温度敏感，在温度继续增加的
情况下，GSH易氧化或分解，故抽提的GSH的总量
会下降，所以抽提温度不应过高。通过优化得出，
最佳的抽提温度为90℃。
图2抽提温度优化
Fig．2Optimizationofextractionemperature
2．1-3正交优化的结果进行极差分析
由表2极差R可以看出，4个因素对抽提浓度
指标影响的主次顺序为因素C的影响最大．以因素
A与D的影响相当，因素B的影响最小．故根据极
差分析确定最佳的热水抽提条件：鲜酵母的质量与
去离子水体积的比例为1：12；搅拌转速为350r／min
时接近D因素的最佳状态；抽提温度取90℃；至于
抽提时间，由于极差值相对最小，其趋势不太明显，
仍然只选择抽提液刚达到90气即停止继续抽提。
2．2热水抽提放大实验
热水抽提具有操作简便，提取率高，成本低，无
污染等优点，为了将该方法应用于工业生产。取2kg
的鲜酵母菌体。应用已得到的热水抽提条件进行放
大实验，实验结果如表3所示，GSH的收率为
90．7％。实验结果表明热水抽提的放大效应不明
显，适宜工业化放大生产。
万方数据
2007年11月 林志皋等：从酿酒酵母中分离纯化谷胱甘肽
表2正交实验结果
Table2 R髓ults0fo^hogond—experiment
A B C D 仲
实验号 抽提 抽提 去离子水搅拌转速／(GSH)／
温度／℃时扫l／min体积／mLr／nlin ％
表3热水抽提试验放大结果
Table3 The陀suh0fexIracfionw thotwaterinnlagerscale
2．3抽提过程氯气保护措施
结果如图3所示，有N：保护的抽提较没有N：保
护的抽提的效果好，表明在抽提过程中的确会有少
量GSH发生氧化，所以抽提过程中加以氮气保护可
以防止部分GSH被氧化，从而提高抽提得率。
0455
0450
《o．445
量0440
0435
0430
protectinghyN2 啪tllompr0缸mI喀byN2
方式
图3有无氮气保护的抽提效果比较
Fig．3Comparison0fextractionmsuhsruth
and耐thoutpmtectingbyN2
2．4超滤实验结果
菌体破碎经离心除菌泥后，上清液中有少量残存
的菌泥以及大量的水溶性蛋白，为了后续的精制分
离，需将上清液进行超滤以除去这些杂质。从图4可
以看出随着截流相对分子质量的增加，滤过液中GSH
的含量呈现递增趋势，但当膜截留相对分子质量为
104时，再增加膜截留相对分子质量，对GSH的透过
无明显改善，这表明当截留相对分子质量为104时，
GSH已经可以自由透过了；而在截流相对分子质量大
干104的超滤膜滤过液中杂蛋白的含量突然猛增，这
是由于膜的截流相对分子质量逐渐增大，能通过膜的
杂蛋白迅速增多所引起的。考虑到应尽可能多地去
除杂蛋白，并且能保持很高的GSH透过率，超滤时应
选择截流相对分子质量为104的膜。
图4不同截留相对分子质量的超滤膜超滤
GSH抽提液对比
Fig．4Comparison0fGSHextraction∞lution
2．5谷胱甘肽稳定性实验
GSH容易氧化，当它与树脂发生吸附作用时需
I■
一j．∞一，(t蚰)q
万方数据
·64· 生物加工过程 第5卷第4期
要选择一个最佳的pH值。考查GSH稳定条件，以
便于选择GSH与树脂发生吸附作用时的最佳pH
值，使得GSH在此pH下较为稳定而不易被氧化，从
而保证GSH充分与树脂发生作用。实验结果如图
5，当pH值>5时，GSH含量随时问的增加而减小，
pH值越大，趋势越明显。在pH2．0—4．0范围内，
GSH在室温下于46h后其检测量仍可稳定在90％
左右，因此选择在这个范围内的pH值下进行GSH
吸附实验。
0 10 20 30 40 50
dh⋯pHI93一pH290一pH403一一pH5OI
一一pH597一pH695⋯pH89 一pHI1．00
圈5溶液pH值对GSH氧化速度的影响
Fig5 EffectofpHofthesolutionontheoxidadonofGSH
2．6离子交换树脂的选择
各种树脂操作吸附容量的测定实验结果如表4
所示，由表可以看出在pH4．0时，不同树脂对GSH
的饱和操作吸附容量差异很大，但饱和操作吸附容
量均大于每克干树脂15m蜘SH。当进一步做解吸
研究时，各种树脂的解吸得率如表4所示，离子交换
树脂的解吸得率要比大孔吸附树脂的解吸得率高，
这可能是在pH4．0时谷胱甘肽带正电，呈阳离子状
表4各种树脂的饱和操作吸附容量殛解吸得率
Table4 Totaloperationexchangecapacity
andratioofdesorptionofresins
态，可与树脂发生交换吸附。离子交换树脂中强酸
性阳离子交换树脂13061的解吸得率最高，为
75．2％，所以在GSH精制纯化时采用强酸性阳离子
交换树脂D061。
3结论
通过正交优化及单因素优化得到最佳的热水
抽提条件：鲜酵母的质量与去离子水体积的比例为
I：12；抽提温度90℃；搅拌转速：350r／min；当抽提
液温度达到90qc就停止抽提，同时在抽提时加以氮
气保护防止GSH的部分氧化，热水抽提放大实验
GSH的平均收率为90．7％。抽提液经过离心除去
菌泥，再经截流相对分子质量为104的超滤膜过滤，
除去大量杂蛋白，便于后续GSH的精制分离。通过
对分离介质的饱和操作吸附容量及解吸得率研究，
确定选用强酸性阳离子交换树脂D061作为介质来
分离谷胱甘肽。
参考文献：
[1]MeisterA，AndersonME．Glutathione[J]．AnnRevBioehem．
1983，52：711-760
[2]Or№niusS，Molden*P-Themultipln,lesof山tathion￡indrug
metabolism『J]T1Ps，1984(5)：432-435．
【3]袁尔东，挥建仙．功能性食品基料一答耽甘肤的研究进展
[J]．食品与发酵工业，1999．25(5)：52-57．
[4]沈亚领，李爽，迟莉丽，等谷胱甘肚的应用与生产[J]．工业
微生物．2000，30(2)：41-45．
[5]潘飞，邱雁临，黄欣啤酒废酵母中谷胱甘肽的抽提新方法
的探讨[J]．生物技术，2005，15(4)：50-52
[6]刘娟，刘春秀，王雅琴．等发酵生产各胱甘肽的研究进展
[J】．微生物学通报，2G02，29(6)：72-75．
[7】陶锐，吴梧桐，许激扬．酶法制备谷胱甘肽工艺的研究[J]．
药物生物技术．1999．6(4)：203-207
[8]UotaniOsamlI，TaniI-Iid∞，MizushimasII ju。dd．Purification
ofG]utathione：Japan，Pn：52-073821[P]．1977416-21．
[9]KimlmHikari，InoueYoshiham，KokayaslfiSusuma．1h口ducfon
0rGIulathione：Japan，Pn：08．0708814『P]19964)3．19
【10]周楠迪．李寅。陈坚，等．从酵母中提取各胱甘肚的初步研究
[J]生物技术，1997，7(4)：30-33．
[11]安贤惠．还原型谷胱甘肽提取方法初探[J]．淮海工学院学
报，2003。12(2)：49-52．
[12]范崇东，王森，徐榕榕．热水提取酵母中答胱甘肽的条件优化
[J】．食品工业科技，2604，25(2)：132．134；145
[13]李建武．余瑞元，袁明秀．生物化学实验原理与方法[M]．北
京：北京大学出版社，2001：196-198．
"
舢
"
”
¨
帖
一H_1_l。口目J／(II∞。)。
万方数据