全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ００２
收稿日期：２０１４－０４－０３
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１７００）
作者简介：朱玲燕（１９８８—），女，江苏海门人，硕士研究生，研究方向：菌种选育；刘　 洋（联系人），工程师， Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｙｙｘ２０１２＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
培养基组分对枯草芽胞杆菌产表面活性素的影响
朱玲燕１，刘　 强１，刘　 洋２，李　 霜１
（１． 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００；
２． 南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：表面活性素（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）中的 Ｃ１５组分是表面活性素 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ异构体混合物中的重要活性组分，在表面活性、
溶血活性、抗病毒活性和抑菌活性方面都有突出的表现。 考察培养基 ｐＨ、碳源、氮源、碳氮比、金属离子以及氨基
酸等主要参数对枯草芽胞杆菌发酵产物 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ中 Ｃ１５组分的影响，利用优化后的培养基（葡萄糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、ＮＨ４ＮＯ３
２ ｇ ／ Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ ｇ ／ Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４ １０ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ、Ｌｅｕ １ ｇ ／ Ｌ 和 ｐＨ ８􀆰 ５），枯草芽胞杆菌 ＢＳ ３７ 发酵 ２４ ｈ，
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量达 ７５０ ｍｇ ／ Ｌ，其中 Ｃ１５组分达 ５１０ ｍｇ ／ Ｌ，占 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总量的 ６８％。
关键词：生物表面活性剂；表面活性素；脂肽；发酵优化
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－０００８－０６
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＺＨＵ Ｌｉｎｇｙａｎ１，ＬＩＵ Ｑｉａｎｇ１，ＬＩＵ Ｙａｎｇ２，ＬＩ Ｓｈｕａｎｇ１
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃ１５ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ；ｉｔ ｈａｓ ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ，
ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ， ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ， Ｃ ／ Ｎ ｒａｔｉｏ， ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ Ｃ１５
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ ２４ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ ｇ ／ Ｌ，ＮＨ４ＮＯ３ ２
ｇ ／ Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ ３ ｇ ／ Ｌ，ＮａＨ２ＰＯ４ １０ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ，Ｌｅｕ １ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ｐＨ ８􀆰 ５），ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
ｖａｒｉａｎｔｓ ｗａｓ ７５０ ｍｇ ／ Ｌ， ｉｎ ｗｈｉｃｈ Ｃ１５ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｗａｓ ５１０ ｍｇ ／ Ｌ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ６８％ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＳ ３７􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ；ｓｕｒｆａｃｔｉｎ；ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　 　 表面活性素（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）是一类环脂肽生物表面
活性剂，主要由芽胞杆菌属细菌产生，在医药、食
品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前
景，已成为研究开发的热点。 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 由亲水的肽
链和亲油的脂肪烃链两部分组成，其中，肽链部分
由 ７个 α 氨基酸按照 ＬＬＤＬＬＤＬ 手性顺序组成 １ 个
七肽，脂肪烃链部分连接 １ 个 Ｃ１２－１６的 β 羟基脂肪
酸长链［１］。 由于氨基酸的种类、位置和脂肪酸链的
长度不同，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ有很多同系物异构体［２］。
在 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ同系物中，Ｃ１３、Ｃ１４和 Ｃ１５组分是主
要成分，其中 Ｃ１５组分具有一些显著的活性特征：
表面活性强，比传统的化学表面活性剂十二烷基
磺酸钠（ＳＤＳ）高 １ ０００ 多倍［３］ ；溶血活性好［４］ ；协
同抗菌活性高［５］ 。 因此，如何提高 Ｃ１５组分在
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ同系物中的比例成为了亟待解决的问题。
以往针对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的发酵工艺优化研究，主要关注
培养基组分以及发酵工艺如泡沫移除、添加活性
炭载体等对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量的影响［６－９］ 。 Ａｂｄｅｌ
Ｍａｗｇｏｕｄ 等［７］通过响应面优化，得到 １３４􀆰 ２ ｍｇ ／ Ｌ
Ｃ１５组分；Ｌｉｕ 等［８］通过添加不同的氨基酸来改变
Ｃ１５组分的百分比，发现半胱氨酸 （ Ｃｙｓ）、组氨酸
（Ｈｉｓ）、异亮氨酸 （ Ｉｌｅ）、亮氨酸 （ Ｌｅｕ）、蛋氨酸
（Ｍｅｔ）、丝氨酸（ Ｓｅｒ）和苏氨酸（ Ｔｈｒ ）可以增加奇
数碳原子组分的比例，精氨酸 （ Ａｒｇ），谷氨酰胺
（Ｇｌｎ）和缬氨酸（Ｖａｌ）可以增加偶数碳原子组分的
比例。 但是，目前通过培养基优化来同时考察
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量和 Ｃ１５组分在 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 同系物中比
例的研究很少。
笔者主要通过摇瓶发酵考察枯草芽胞杆菌
ＢＳ ３７产 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ各组分的营养影响因素，以期通
过改变发酵培养基的营养组成来提高 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产
量和 Ｃ１５组分的比例。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 菌株
Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ高产菌株 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＳ ３７，笔者
所在实验成员 Ｚｈｕ等［１０］诱变选育获得。
１􀆰 ２　 培养基
１􀆰 ２􀆰 １　 种子培养基（ＬＢ培养基，ｇ ／ Ｌ）
蛋白胨 １０，酵母粉 ５，ＮａＣｌ １０。 ｐＨ ７􀆰 ０。
１􀆰 ２􀆰 ２　 发酵基础培养基 （ｇ ／ Ｌ）
葡萄糖 ２０，酵母粉 ０􀆰 ２，ＮＨ４ＮＯ３ ２，Ｋ２ＨＰＯ４ ３，
ＮａＨ２ＰＯ４１０，ＭｇＳＯ４０􀆰 ０２，ＦｅＳＯ４０􀆰 ０２。 ｐＨ ７􀆰 ２。
１􀆰 ２􀆰 ３　 不同营养组分的培养基
１）碳源　 以质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ的柠檬酸三钠、
玉米糊精、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油和甘露醇替
换基础培养基碳源。
２）氮源　 以质量浓度为 ３ ｇ ／ Ｌ 的单一有机氮源
（牛肉膏、蛋白胨和酵母粉）和无机氮源（（ＮＨ４）２ＳＯ４、
ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＮＯ３和尿素），替换基础培养基中
的混和氮源。
３）氮源浓度　 保持碳源质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ，控
制氮源的质量浓度分别为 １、１􀆰 ５、２，３和 ４ ｇ ／ Ｌ，其他
条件保持不变。
４）金属离子 　 将基础培养基中的金属离子替
换为 ＦｅＳＯ４、 ＦｅＣｌ３、 ＭｇＣｌ２、 ＭｇＳＯ４、 ＣａＣｌ２、 ＭｎＣｌ２和
ＭｎＳＯ４，质量浓度为 ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ，以不添加金属离子的
培养基作为空白对照。
５）氨基酸添加物的影响　 根据 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的七肽
环结构所含有的 ５ 种氨基酸（Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ 和
Ｉｌｅ），分别在基础培养基中添加 １ ｇ ／ Ｌ 上述氨基酸，
以不添加氨基酸的培养基作为空白对照。
以上实验每组设 ３个平行样。
１􀆰 ３　 培养方法
１􀆰 ３􀆰 １　 种子培养
从斜面上取 １环 ＢＳ ３７菌株接种，２５０ ｍＬ摇瓶
的装样量为 ５０ ｍＬ，在 ３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ下培养 ２４ ｈ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 发酵培养
将种子培养液按照体积分数 ５％的接种量接种
到装有 ５０ ｍＬ 发酵培养基的 ２５０ ｍＬ 摇瓶中，在
３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 下培养 ２４ ｈ。 每个组分做 ３ 个平
行，取平均值。
１􀆰 ４　 发酵液中 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ组分的测定
将发酵液离心，取上清液 ０􀆰 ５ ｍＬ，添加 １􀆰 ５ ｍＬ
甲醇，混匀后离心，取上清液为待测样品。 Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
的测定使用高效液相色谱（戴安 Ｐ６８０）。 色谱柱为
Ａｍｅｔｈｙｓｔ Ｃ１８ Ｐ ｃｏｌｕｍｎ （５ μｍ，４􀆰 ６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）；
流动相为 ９０％甲醇和 １０％水（含有 ０􀆰 ０５％的三氟乙
酸）；进样量 ２０ μＬ；流速 ０􀆰 ８ ｍＬ ／ ｍｉｎ；柱温 ３０ ℃；采
用紫外检测器检测，波长选择 ２１４ ｎｍ。 以 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
标准品 （ Ｓｉｇｍａ 公司，纯度 ９８％）及 ＨＰＬＣ 质谱
（ＭＳ）进行定量、定性分析［１０］，通过比较各组分峰面
积获得占比情况。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 培养基 ｐＨ对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ积累的影响
考察培养基 ｐＨ 对微生物生长和 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 积累
的影响，结果如表 １所示。 由表 １可知：芽胞杆菌属
细菌多偏好中性及微碱性环境。 与中性环境（ ｐＨ
７􀆰 ０）相比，偏酸性环境（ ｐＨ ６􀆰 ５）中，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 的合
９　 第 ５期 朱玲燕等：培养基组分对枯草芽胞杆菌产表面活性素的影响
成、Ｃ１５组分和生物量都下降；微碱性环境中 （ ｐＨ
７􀆰 ５～８􀆰 ５），ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的总产量较高，但 Ｃ１５组分的占
比相对较低，碱性环境中（ ｐＨ ９􀆰 ０ ～ ９􀆰 ５），ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
的产量和生物量也有明显下降，但 Ｃ１５组分的占比达
到 ６０％左右。 综合考虑，ｐＨ ８􀆰 ５ 时 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量
和 Ｃ１５组分产量都是最高的。
表 １　 ｐＨ对生物量、ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量和 Ｃ１５组分产量的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５ ｙｉｅｌｄ
ｐＨ ＯＤ６００ ρ（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ） ／ （ｍｇ·Ｌ－１） ρ（Ｃ１５ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ） ／ （ｍｇ·Ｌ
－１） ｗ（Ｃ１５组分） ／ ％
６􀆰 ５ ６􀆰 ６±０􀆰 １３ １１１􀆰 １±２􀆰 ７８ ５８􀆰 ３±１􀆰 １７ ５２􀆰 ５
７􀆰 ０ ７􀆰 ３±０􀆰 １５ ４３４􀆰 ３±１０􀆰 ８６ ２４９􀆰 ７±４􀆰 ５０ ５７􀆰 ５
７􀆰 ５ ６􀆰 ５±０􀆰 １３ ５５６􀆰 ５±１３􀆰 ９１ ２４９􀆰 ３±４􀆰 ５０ ４４􀆰 ８
８􀆰 ０ ７􀆰 ２±０􀆰 １４ ５８７􀆰 ８±１４􀆰 ７０ ２３６􀆰 ３±４􀆰 ７３ ４０􀆰 ２
８􀆰 ５ ６􀆰 ４±０􀆰 １３ ５９０􀆰 ８±１４􀆰 ７０ ２７８􀆰 ３±５􀆰 ７５ ４７􀆰 １
９􀆰 ０ ６􀆰 ０±０􀆰 １２ ３４４􀆰 ４±８􀆰 ６１ ２１６􀆰 ３±４􀆰 ３３ ６２􀆰 ８
９􀆰 ５ ５􀆰 ８±０􀆰 １２ ２７０􀆰 １±６􀆰 ７５ １６０􀆰 ４±３􀆰 ２１ ５９􀆰 ４
２􀆰 ２　 碳源对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ积累的影响
芽胞杆菌是以水溶性底物为原料来生产表面活
性剂的菌株［１１］，因此在选择碳源时考虑水溶性碳源。
实验结果见图 １。 由图 １可知：当以糖类（玉米糊精、
蔗糖、葡萄糖和麦芽糖）为碳源时，菌体的生长差异不
明显。 葡萄糖作为碳源时，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量和 Ｃ１５组
分的产量都是最高的。 当选择非糖类碳源如柠檬酸
钠为碳源时，生物量差异不显著，但几乎不积累
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ。 值得注意的是，以甘油为碳源时，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
总产量较高，但 Ｃ１５组分产量略低于葡萄糖为碳源的
结果。 因此，适合 Ｃ１５组分发酵的最佳碳源是葡萄糖。
图 １　 碳源对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量、Ｃ１５组分产量和
细胞生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ ｙｉｅｌｄ，
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
２􀆰 ３　 氮源对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ积累的影响
氮源是合成细胞物质的基本营养源，其种类和
浓度决定了细胞的生长情况，从而影响表面活性剂
的产量。 相比基础培养基中的 ２ 种氮源，考察了单
一氮源对发酵的影响，结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可
知：在有机氮源（牛肉膏、蛋白胨和酵母粉）中，菌体
生长旺盛，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量和 Ｃ１５组分产量也相对较
高。 在无机氮源（ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ Ｃｌ、ＮａＮＯ３、尿素和
（ＮＨ４） ２ＳＯ４）中，菌体的生物量相对较低。 但是，以
ＮＨ４ ＮＯ３ 为唯一氮源时， ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量达 ５００
ｍｇ ／ Ｌ，Ｃ１５组分接近 ３００ ｍｇ ／ Ｌ，占总产量的 ６０％左
右，与双氮源的培养基相比，更利于产物的积累。
综合考虑，选择 ＮＨ４ＮＯ３为最佳氮源。
图 ２　 氮源对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ产量、Ｃ１５组分含量和
细胞生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ ｙｉｅｌｄ，
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
２􀆰 ４　 ＮＨ４ＮＯ３ 浓度对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ发酵的影响
以 ＮＨ４ＮＯ３ 为氮源，考察其对发酵的影响，结果
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
如图 ３所示。 由图 ３ 可知：随着 ＮＨ４ＮＯ３ 浓度的增
高，菌株的生物量越来越高，当 ＮＨ４ＮＯ３ 质量浓度为
２和 ３ ｇ ／ Ｌ 时，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 的产量都达到最大值 ５００
ｍｇ ／ Ｌ左右。 当 ＮＨ４ＮＯ３ 质量浓度为 ２ ｇ ／ Ｌ 时，Ｃ１５组
分产量最高达到 ３３４ ｍｇ ／ Ｌ。 综合考虑， 选择
ＮＨ４ＮＯ３质量浓度为 ２ ｇ ／ Ｌ。
图 ３　 ＮＨ４ＮＯ３浓度对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ产量、Ｃ１５组分
含量和细胞生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＨ４ＮＯ３ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ
ｙｉｅｌｄ， ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
２􀆰 ５　 金属离子对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ发酵的影响
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 的发酵过程中，金属离子如 Ｍｎ２＋、
Ｆｅ２＋、Ｃａ２＋等对产物合成具有显著影响，这是研究的
热点之一。 笔者研究了金属离子对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 发酵的
影响，结果如图 ４所示。
图 ４　 金属离子对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量、Ｃ１５组分
含量和细胞生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ ｙｉｅｌｄ，
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
由图 ４可知：与不加金属离子的空白对照相比，
加入单一的金属离子如 Ｆｅ２＋、 Ｆｅ３＋、 Ｍｇ２＋、 Ｃａ２＋和
Ｍｎ２＋，对菌体的生长影响无显著差异；但是添加
Ｍｇ２＋能明显促进 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量和 Ｃ１５组分的积累，
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量和 Ｃ１５组分产量分别比不添加金属
离子的空白对照提高了 ８４％和 １１４％。 Ｃｏｏｐｅｒ 等［６］
研究金属离子对 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２１３３２生产 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
的影响，结果发现 Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋和 Ｍｎ２＋能够显著提高
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的产量；其中，Ｍｎ２＋的作用最为显著，添加
４×１０－６ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＭｎＳＯ４，在不影响生物量的情况下
可使 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 的产量大幅增加，从而证明 Ｍｎ２＋在
Ｂａｃｉｌｌｕｓ 属微生物的次级代谢产物合成中扮演重要
角色。 Ｗｅｉ等［１２］利用葡萄糖铵盐合成培养基发酵
Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２１３３２ 产 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ，发现添加 ０􀆰 ０１
ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｍｎ２＋能将 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 产量从 ０􀆰 ３３ ｇ ／ Ｌ 提高至
２􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ。 Ａｌ Ａｊｌａｎｉ 等［１３］研究发现，Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＺ７
在 Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ 培养基中的 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 产量约 ２２０
ｍｇ ／ Ｌ，添加 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｆｅ２＋时，脂肽产量可以提高
到 ３００ ｍｇ ／ Ｌ。 黄翔峰等［１４］通过在 ＭＭＳＭ培养基中
添加 Ｆｅ２＋使 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＩＣＣ２３６５９ 的 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ产量提
高了 ９􀆰 ５ 倍，达到 ２３４􀆰 ０８ ｍｇ ／ Ｌ。 在本文中，Ｃａ２＋、
Ｆｅ２＋和 Ｆｅ３＋对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总量的促进作用不明显，其中
Ｃａ２＋抑制了 Ｃ１５组分的积累，而 Ｆｅ３
＋对 Ｃ１５组分的积
累有一定促进作用。 最为特别的是，添加 ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ
Ｍｎ２＋（１􀆰 ２×１０－４ ｍｏｌ ／ Ｌ）时 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 产量为 ０，这与大
多数报道 Ｍｎ２＋能显著促进 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 积累的表现截
然不同。 因此，有必要进一步探讨 Ｍｎ２＋浓度对
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ合成的影响，笔者选取更低的 Ｍｎ２＋浓度如
２×１０－６、４×１０－６、８×１０－６、１􀆰 ２×１０－５、２×１０－５和 ５×１０－５
ｍｏｌ ／ Ｌ来考察其对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ合成的影响，结果如图 ５
所示。 由图 ５ 可以看出，以不添加 Ｍｎ２＋作为对照，
添加低浓度的 Ｍｎ２＋依然使得 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 产量有显著
的下降。 枯草芽胞杆菌 ＢＳ ３７ 菌株的 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 合
成受 Ｍｇ２＋促进、Ｍｎ２＋抑制的特性，使得有必要深入
解析该菌株的 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ合成途径。
图 ５　 Ｍｎ２＋浓度对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｎ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ ｙｉｅｌｄ
１１　 第 ５期 朱玲燕等：培养基组分对枯草芽胞杆菌产表面活性素的影响
２􀆰 ６　 添加氨基酸对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ发酵的影响
选择 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ七肽环结构部分的 ５ 种氨基酸
（Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ 和 Ｉｌｅ）作为外源添加氨基酸，
研究其对 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 发酵的影响，结果如表 ２ 所示。
表 ２ 表明：添加上述氨基酸对生物量没有显著影
响。 除 Ｉｌｅ 外，其余 ４ 种氨基酸都能通过促进
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产物的积累来增加 Ｃ１５组分的总量，但
对 Ｃ１５ 组分比例的影响不显著， Ｃ１５ 组分约占
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总量的 ５５％ ～ ６０％。 添加 Ｌｅｕ 时，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
总产量和 Ｃ１５组分的产量都能达到最大值。 Ｌｉｕ
等［８］考察了添加 １ ｇ ／ Ｌ氨基酸时，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＴＤ７ 在
葡萄糖铵盐合成培养基中发酵 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 各组分的
变化，结果发现 Ｉｌｅ和 Ｔｈｒ能使 Ｃ１５组分由 ４６％增加
到 ７５％ ～８０％，而 Ｖａｌ显著增加 Ｃ１４组分的百分比，
使之由 ４６％增至 ６６％。 我们的实验结果与 Ｌｉｕ
等［８］的结果有显著的差异。
表 ２　 添加氨基酸对细胞生长、ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量和 Ｃ１５组分的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
氨基酸 ＯＤ６００ ρ（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ） ／ （ｍｇ·Ｌ－１） ρ（Ｃ１５ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ） ／ （ｍｇ·Ｌ
－１） ｗ（Ｃ１５组分） ／ ％
对照 ７􀆰 ６±０􀆰 １５ ４７４􀆰 ３±１１􀆰 ８６ ２８７􀆰 ５±５􀆰 ７５ ６０􀆰 ６
Ａｓｐ ７􀆰 ３±０􀆰 １５ ６２１􀆰 ４±１５􀆰 ５４ ３４７􀆰 ４±６􀆰 ９５ ５５􀆰 ９
Ｌｅｕ ７􀆰 ５±０􀆰 １５ ６８１􀆰 ２±１７􀆰 ０３ ３８９􀆰 ０±７􀆰 ７８ ５７􀆰 １
Ｇｌｕ ７􀆰 ２±０􀆰 １４ ６２４􀆰 ８±１５􀆰 ６２ ３７１􀆰 ２±７􀆰 ４２ ５９􀆰 ５
Ｖａｌ ７􀆰 ４±０􀆰 １５ ５７４􀆰 ５±１４􀆰 ３６ ３２４􀆰 １±６􀆰 ４８ ５６􀆰 ４
Ｉｌｅ ６􀆰 ８±０􀆰 １４ ４７８􀆰 ４±９􀆰 ５７ ２９０􀆰 ３±５􀆰 ８１ ６０􀆰 ７
２􀆰 ７　 最适营养条件下的 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ发酵结果
通过上述单因素优化，综合考虑 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总产量
和 Ｃ１５组分的含量，优化后的发酵培养基组分为
（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０、ＮＨ４ＮＯ３ ２、Ｋ２ＨＰＯ４ ３、ＮａＨ２ＰＯ４１０、
ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ０２、Ｌｅｕ １和 ｐＨ ８􀆰 ５。 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＳ ３７发酵
２４ ｈ 后，通过高效液相色谱法测定产物含量，结果如
图 ６ 所示。 由图 ６ 可知： ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量达 ７５０
ｍｇ ／ Ｌ，其中 Ｃ１５组分达 ５１０ ｍｇ ／ Ｌ，占 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总量的
６８％。 这一结果与优化前相比，ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量提高
了 ５８％，Ｃ１５组分的产量提高了 ７７％，达到了相对较高
的水平。 黄翔峰等［１４］ 对 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＩＣＣ２３６５９ 产
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的发酵优化结果为总产量 ２３４􀆰 ０８ ｍｇ ／ Ｌ，其
中 Ｃ１５组分占 ７０％左右，也就是 １６３ ｍｇ ／ Ｌ。 Ａｂｄｅｌ
Ｍａｗｇｏｕｄ 等［７］优化了 Ｂ􀆰 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＭＢ１９９ 产
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１５组分的发酵条件，结果 Ｃ１５组分的产量仅
为 １３４􀆰 ２ ｍｇ ／ Ｌ。
３　 结论
经过摇瓶发酵优化，利用优化后的培养基（葡萄
糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、ＮＨ４ＮＯ３ ２ ｇ ／ Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ ｇ ／ Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４ １０
ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ、Ｌｅｕ １ ｇ ／ Ｌ 和 ｐＨ ８􀆰 ５），Ｂａｃｉｌｌｕｓ
图 ６　 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ的高效液相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ６　 ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＳ ３７发酵 ２４ ｈ 的 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ 总产量和 Ｃ１５组
分产量分别达到了 ７５０ ｍｇ ／ Ｌ和 ５１０ ｍｇ ／ Ｌ，Ｃ１５组分占
ｓｕｒｆａｃｔｉｎ总量的 ６８％。 这种兼顾 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ高活性组分
与总产量的发酵优化，为进一步开发应用 ｓｕｒｆａｃｔｉｎ
Ｃ１５组分的特殊生物活性特征（如高表面活性、抑菌活
性等）奠定了基础。
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２１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
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（责任编辑　 管　 珺）
３１　 第 ５期 朱玲燕等：培养基组分对枯草芽胞杆菌产表面活性素的影响