全 文 ：第９卷第５期
２０１１年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０５．００４
收稿日期：２０１１－０５－１６
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０９７６０１４）；教育部博士点基金资助项目（２００９１１０１１１００３６）；北京市自然科学基金资助项目（２１１２０３５）
作者简介：陈金燕（１９８３—），女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：生物催化与酶工程；李 春（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｈｕｎ＠ｂｉｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
含离子液体体系中固定化细胞转化甘草酸
生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸
陈金燕１，刘桂艳２，黄 申２，童延斌１，李 春１，２
（１．石河子大学 化学化工学院，石河子 ８３２００３；２．北京理工大学 生命学院，北京 １０００８１）
摘 要：研究疏水性离子液体１丁基 ３甲基咪唑六氟磷酸盐（［ＢＭＩＭ］ＰＦ６）与醋酸 醋酸钠缓冲液两相体系中，
固定化产紫青霉ＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍＬｉ３细胞转化甘草酸（ＧＬ）生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸（ＧＡＭＧ）的反
应，并与缓冲液单相体系作为对照。确定了在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液两相体系中，最适离子液体加入比例、缓冲液
ｐＨ、反应温度、底物浓度分别为１０％、５８、３５℃和６０ｍｍｏｌ／Ｌ，在此条件下反应５８ｈ，甘草酸转化率为８７０３％，比
缓冲液单相体系提高了１５０２％。离子液体循环使用８次后，回收利用率维持在８５２８％。主产物 ＧＡＭＧ和副产
物甘草次酸（ＧＡ）在两相体系中得到有效分离，为后续产物分离带来便利。
关键词：葡萄糖醛酸苷酶；甘草酸；甘草次酸；离子液体；固定化细胞
中图分类号：Ｑ８１４２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０５－００１７－０５
Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｃａｃｉｄ３ＯｍｏｎｏβＤｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｂｙ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｅｌｓｗｉｔｈｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ
ＣＨＥＮＪｉｎｙａｎ１，ＬＩＵＧｕｉｙａｎ２，ＨＵＡＮＧＳｈｅｎ２，ＴＯＮＧＹａｎｂｉｎ１，ＬＩＣｈｕｎ１，２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎ（ＧＬ）ｔｏｇｌｙｃｙｒｈｅｔｉｃａｃｉｄ３ＯｍｏｎｏβＤｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＧＡＭＧ）
ｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｅｌｉｎｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１ｂｕｔｙｌ３ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
（［ＢＭＩＭ］ＰＦ６）ｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／ｂｕｆｅｒｂｉｐｈａｓｉｃｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ，ｃｏｍ
ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｎｏｐｈａｓｉｃｂｕｆｅｒｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｉｎ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／ｂｕｆｅｒｂｉ
ｐｈａｓｉｃｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｂｕｆｅｒｐＨ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗｅｒｅ１０％，５８，３５℃，ａｎｄ６０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎ
ｄｉｔｉｏｎｓ，８７０３％ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅｏｆＧＬｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄａｆｔｅｒ５８ｈｉｎ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／ｂｕｆｅｒｂｉｐｈａｓｉｃｓｙｓｔｅｍ，
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｎｏｐｈａｓｉｃｂｕｆｅｒｓｙｓｔｅｍ，ｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１５０２％．Ｔｈｅｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ［Ｂｍｉｍ］ＰＦ６ａｌｓｏ
ｒｅｍａｉｎｅｄａｔｈｉｇｈｅｒｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｏｆ８５２８％ ｄｕｒｉｎｇｒｅｐｅａｔｅｄｕｓｅｆｏｒ８ｒｅａｃｔｉｏｎｃｙｃｌｅｓ．Ｔｈｅ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６
ｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｃａｔａｌｙｔｉｃｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓａｎｄｂｒｉｎｇｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；ｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎ；ｇｌｙｃｙｒｈｅｔｉｃａｃｉｄ；ｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｅｌ
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８
单葡萄糖醛酸基甘草次酸（ｇｌｙｃｙｒｈｅｔｉｃａｃｉｄ３Ｏ
ｍｏｎｏβＤｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ，ＧＡＭＧ）是通过甘草酸（ｇｌｙｃｙｒ
ｒｈｉｚｉｎ，ＧＬ）水解失去外端葡萄糖醛酸基的产物，其反应
式如图１所示。与甘草酸相比，ＧＡＭＧ具有更高的抗
炎、抗过敏、抗癌等活性［１］，且毒性低、溶解性好，便于
体内运输［２］。另外，ＧＡＭＧ的甜度是甘草酸的５倍，是
蔗糖的１０００倍，是一种高甜度低热量的功能性甜味
剂［２］。对甘草酸进行改性合成ＧＡＭＧ具有重要的研究
价值。目前，ＧＡＭＧ的合成主要有化学法和生物法，由
于生物转化法具有反应条件温和、反应速率高、能耗
低、环境友好和无需功能基团保护等优点，使其成为制
备ＧＡＭＧ较具优势的方法。
图１ 固定化细胞转化甘草酸生成ＧＡＭＧ的反应式
Ｆｉｇ．１ ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓＧＡＭＧｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｅｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ
微生物细胞固定化比游离细胞和固定化酶具
有更多的优点，省去制备酶的过程，可重复利用，具
有广阔的应用前景［３］。但如果反应的底物不易溶
于水，则需要用有机溶剂作为反应介质［４］。而有机
溶剂本身的毒性会对细胞膜造成破坏，影响其催化
能力，采用生物相容性更好的离子液体（ｉｏｎｉｃｌｉｑ
ｕｉｄ，ＩＬ）是一种新的选择。研究表明［５－６］：离子液体
不但可替代传统的有机溶剂，而且能提高细胞的相
对活性和稳定性，并能够改善细胞膜通透性等，尤
其是离子液体可回收利用。
笔者课题组前期从新疆甘草种植区的土壤中
分离筛选出 １株产紫青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｐｕｒｐｕｒｏｇｅ
ｎｕｍ）Ｌｉ３，能够转化甘草酸生成ＧＡＭＧ且伴有少量
的副产物甘草次酸（ｇｌｙｃｙｒｈｅｔｉｃａｃｉｄ，ＧＡ）生成［７］。
本研究中笔者以重要的生物活性物质 ＧＡＭＧ为目
标化合物，在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液两相体系中利用
固定化 ＰｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍＬｉ３细胞催化甘草酸生成
ＧＡＭＧ，同时与缓冲液单相体系进行比较，研究在含
离子液体体系中固定化细胞的催化特性，旨在为建
立高效的全细胞转化甘草酸合成 ＧＡＭＧ的反应体
系奠定理论基础。
１ 材料和方法
１１ 菌株和试剂
ＰｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍＬｉ ３菌株由北京理工大学生
命学院生物转化与微生态实验室保存。高效液相
色谱测定用甲醇为色谱纯，反应所用的离子液体为
市售分析纯。
１２ 培养基
种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５，ＮａＮＯ３３，Ｋ２ＨＰＯ４１，
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５，ＫＣｌ０５，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００１。
产酶诱导培养基（ｇ／Ｌ）：甘草酸 ３，ＮａＮＯ３３，
Ｋ２ＨＰＯ４１，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０５，ＫＣｌ０５，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ００１。
以上培养基均用蒸馏水配制，１２１℃灭菌
２０ｍｉｎ。
１３ 固定化细胞催化剂的制备
将ＰｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍＬｉ３接种到１００ｍＬ种子培
养基中，３０℃、１７０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ，然后以１０％
的接种量接种于产酶诱导培养基中，３０℃、１７０ｒ／ｍｉｎ
振荡７２ｈ。过滤收集菌体，用去离子水洗去发酵残留
物，１００００ｒ／ｍｉｎ离心收集菌体。取２ｇ湿菌体用１０
ｍＬ蒸馏水制备菌悬液，并与２０ｍＬ１２１℃灭菌２０
ｍｉｎ的２５％海藻酸钠溶液混匀。用注射器（５号针
头）吸取海藻酸钠菌悬液，从２０ｃｍ高处逐滴滴入置
于低速运行的磁力搅拌器上的２％ＣａＣｌ２溶液中进行
固定化。将固定化颗粒于冰箱中４℃冷藏过夜，取出
并保存在０９％的生理盐水中备用。
１４ 固定化细胞转化甘草酸的反应
在５０ｍＬ三角瓶中分别加入离子液体、甘草酸、
不同ｐＨ的醋酸 醋酸钠缓冲液，总反应体系１０ｍＬ，
８１ 生 物 加 工 过 程 第９卷
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８
向该体系中加入１８ｇ固定化细胞，于一定转速和
温度的恒温水浴摇床中进行催化反应。反应结束
后，主产物ＧＡＭＧ和副产物ＧＡ及未反应的底物ＧＬ
的浓度均采用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）分析检测。
１５ 高效液相色谱分析方法
日本岛津公司ＬＣ １０ＡＶＰ型液相色谱仪。色
谱柱：Ｓｈｉｍｐａｃｋ，ＶＰ ＯＤＳ（１５０ｍｍ×４６ｍｍ）；检
测波长：２５４ｎｍ；检测器：ＳＰＤ；工作站：ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ；
流动相：甲醇与重蒸水（加入适量醋酸，ｐＨ２８５）体
积比为 ８１∶１９；进样量：１０μＬ；流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；柱
温：４０℃。ＧＬ、ＧＡＭＧ和 ＧＡ的保留时间分别为
７５、１５９和２２７ｍｉｎ，测定方法参考文献［８］。
１６ 两相中的分配系数Ｋ
底物和产物在两相中分配系数的定义：一定温
度下各物质分别在下层离子液体相（ｃＩＬ）和上层缓
冲液相（ｃｂ）中的浓度之比，即 Ｋ＝ｃＩＬ／ｃｂ，其浓度通
过ＨＰＬＣ测定。
１７ 离子液体回收利用
催化反应结束后，静置５ｍｉｎ。用移液器缓慢移
除离子液体／缓冲液两相体系中的上层缓冲液相，
收集下层离子液体相并过滤，滤液旋转蒸发（８０℃）
得到无色透明黏稠状液体，真空干燥４８ｈ，即得离子
液体。
２ 结果与讨论
２１ ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６加入比例对甘草酸转化率的影响
在编号为１～５的５０ｍＬ三角瓶中，分别加入
０、０５、１０、２０、３０和 ４０ｍＬ离子液体，将 １７５
ｍｍｏｌ／Ｌ的室温膏冻状甘草酸加热溶解，向每瓶中各
加２０ｍＬ，再分别加入 １８ｇ固定化细胞，用 ｐＨ
５０的乙酸 乙酸钠（ＨＡｃＮａＡｃ）缓冲液定容至总体
系１０ｍＬ，使甘草酸终浓度为 ３５ｍｍｏｌ／Ｌ。在
３０℃、１７０ｒ／ｍｉｎ的水浴摇床中反应５８ｈ，取样进行
液相分析，结果如图２所示。
由图２可知：随着离子液体比例的增加，反应的
转化率先增后减，当离子液体相加入比例为１０％时
转化率最大（８２６％），且比缓冲液单相体系中的甘
草酸转化率提高了６３１％。确定离子液体加入比
例为１０％。离子液体添加比例过低则影响底物和
产物在两相中的有效分配，进而影响转化率。当离
子液体的添加比例过高时则因离子液体的黏度影
响了传质速率，从而使转化率降低。在甘草酸转化
反应体系中加入一定比例的离子液体［ＢＭＩＭ］ＰＦ６
图２ 离子液体的加入比例对反应转化率的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｔｅｎｔｏｆ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６ｏｎ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＧＬ
有助于甘草酸转化率的提高。为证实此结果是否
是因为离子液体［ＢＭＩＭ］ＰＦ６催化糖苷键水解而引
起的，设计实验如下：反应体系中不加固定化细胞
只加底物甘草酸和离子液体［ＢＭＩＭ］ＰＦ６，考察
［ＢＭＩＭ］ＰＦ６对转化反应的影响，发现［ＢＭＩＭ］ＰＦ６并
不能作为该反应的催化剂水解糖苷键。推断在含
［ＢＭＩＭ］ＰＦ６反应体系中甘草酸转化率提高的原因
可能是１ 丁基 ３ 甲基咪唑阳离子结合亲核性的
阴离子影响了底物甘草酸功能基团的离子化状态，
从而使底物糖苷键更易与酶活性中心结合。也可
能是因为反应介质影响酶的柔性构象状态使其与
甘草酸糖苷键更易形成酶底物中间络合物，从而有
利于ＧＡＭＧ的形成。离子液体物化特性对酶构象
的影响及该体系中酶促反应机制还有待于进一步
研究。
２２ 缓冲液ｐＨ对甘草酸转化率的影响
在编号为１～８的５０ｍＬ三角瓶中，加入离子液
体比例为１０％，其他反应条件如２１所述，并用不
同ｐＨ的ＨＡｃＮａＡｃ缓冲液补至总体系１０ｍＬ，以缓
冲液单相体系做对照。在３０℃、１７０ｒ／ｍｉｎ的水浴
摇床反应５８ｈ，实验结果如图３所示。由图３可知：
缓冲液ｐＨ对甘草酸转化反应影响较大，在缓冲液
单相体系中，当ｐＨ低于５０时，转化率随 ｐＨ的增
大而增大；而当ｐＨ高于５０时，转化率随 ｐＨ的增
大而减小，该反应体系最适ｐＨ为５０。
在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液两相体系中，当ｐＨ低于
或高于５８时，转化率在一定程度上均降低，两相体
系中最适ｐＨ为５８，转化率为８２９％，高于缓冲液
体系中的对应值。缓冲液 ｐＨ影响酶活性位点的极
性，改变反应中底物和带有电荷的酶的离子状态，
同时可能对离子液体的解离状态也有一定影响。
９１ 第５期 陈金燕等：含离子液体体系中固定化细胞转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８
图３ ｐＨ对转化反应转化率的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＧＬ
２３ 温度对甘草酸转化率的影响
转化反应条件同 ２２，不同的是用 ｐＨ５８的
ＨＡｃＮａＡｃ缓冲液补至总体系为１０ｍＬ，并以 ｐＨ为
５０缓冲液单相体系做对照。在不同温度、１７０ｒ／ｍｉｎ
的水浴摇床反应５８ｈ，结果见图４。
图４ 反应温度对反应转化率的影响
Ｆｉｇ．４ ＥｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＧＬ
由图４可知：无论在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液两相
体系中还是在缓冲液单相体系中，在 ２５～３５℃范
围内，转化率都随着温度的升高而加快，其对应最
高转化率分别为８４７８％和８１０２％。当反应温度
为４０℃时，单相体系中转化率下降显著，而两相体
系中转化率维持在８３％。温度会影响生物催化剂
的催化活力与稳定性，结果表明固定化细胞在含离
子液体体系中热稳定性增强。适当的温度可以使
传质速率加快、细胞膜对底物和产物分子通透性增
大。而温度过高时，则可能使细胞中酶系失活，不
利于催化反应的进行。确定离子液体两相体系和
缓冲液单相体系最适反应温度均为３５℃。
２４ 底物浓度对甘草酸转化率的影响
转化反应条件参见２３，考察不同浓度的底物
对甘草酸转化率的影响，并与 ｐＨ为５０缓冲液单
相体系作对比。在３５℃、１７０ｒ／ｍｉｎ的水浴摇床中
反应５８ｈ，结果见图５。
图５ 底物浓度对反应转化率的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＧＬ
由图５可知：在缓冲液单相体系中，浓度高于或
低于３６ｍｍｏｌ／Ｌ时，转化率均下降，单相体系中最
适底物浓度为３６ｍｍｏｌ／Ｌ。在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液
两相体系中，底物浓度为６０ｍｍｏｌ／Ｌ时，转化率最
大（８５０３％），而继续增加底物浓度，转化率则下
降，因此在两相体系中，最适的底物浓度是 ６０
ｍｍｏｌ／Ｌ。适当的底物浓度会提高反应的速率，过高
的底物浓度可能导致底物抑制［９］，降低反应速率，
同时也会影响酶的活性中心和底物之间的传质，从
而影响反应转化率，在甘草酸转化反应体系中加入
一定比例的离子液体有助于最适底物浓度的增大，
从而有利于转化效率的提高。
２５ 两相体系中底物和产物的分配
离子液体不仅提供了两相界面而且可以作为
萃取副产物 ＧＡ的溶剂，有效及时地将生成的 ＧＡ
从反应的水相中移去，解除产物抑制。表１列出了
不同温度下，未反应底物 ＧＬ和产物 ＧＡＭＧ及副产
物ＧＡ在离子液体／缓冲液两相中的分配系数。
表１ 底物和产物在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液两相体系中的分配
Ｔａｂｌｅ１ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｉｎ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／ｂｕｆｅｒｂｉｐｈａｓｉｃｓｙｓｔｅｍ
温度／℃ Ｋ（ＧＬ） Ｋ（ＧＡＭＧ） Ｋ（ＧＡ）
３５ ００５０ ００１８ ４８５６
４０ ００４５ ００２７ ５６２９
４５ ００３０ ００３５ ６２２０
５０ ００４８ ００２１ ５９７０
注：反应条件为１０％［ＢＭＩＭ］ＰＦ６、１８０ｇ／Ｌ固定化
细胞、６０ｍｍｏｌ／ＬＧＬ、１７０ｒ／ｍｉｎ。
由表１可知：在所考察的温度范围内，产物ＧＡＭＧ
和未反应的底物ＧＬ主要存在于水相。而副产物ＧＡ
０２ 生 物 加 工 过 程 第９卷
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８
主要分布在离子液体相（Ｋ（ＧＡ）≥４８５６）。这可能是
因为葡萄糖醛酸基是一种亲水性基团，主产物ＧＡＭＧ
与底物ＧＬ中都有这个基团，而［ＢＭＩＭ］ＰＦ６是疏水性离
子液体，因此葡萄糖醛酸基的存在就影响了ＧＡＭＧ和
ＧＬ在离子液体中的溶解，而ＧＡ由于没有葡萄糖醛酸
基亲水性基团，本身就是疏水性的，因而能很好地溶解
到［ＢＭＩＭ］ＰＦ６相中，导致较高的Ｋ（ＧＡ）值。
２６ 固定化细胞和离子液体的重复利用
有效回收并反复利用离子液体和固定化细胞
是降低成本的关键，因此考察［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液
两相体系在优化条件下离子液体和固定化细胞的
重复利用性，结果见图６。
图６ 离子液体和固定化细胞的重复利用
Ｆｉｇ．６ Ｒｅｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆ［ＢＭＩＭ］ＰＦ６ａｎｄ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｅｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ
由图６可知：离子液体循环使用８次后其回收率
为８５２８％。据固定化细胞操作稳定性考察得知，随
着固定化细胞重复利用次数的增加，甘草酸转化率逐
渐降低。固定化细胞在离子液体／缓冲液两相体系中
重复利用３次后，甘草酸转化率仍能维持在７７３６％，
当重复利用４次时，转化率为６２７６％。相关报道［１０］
表明固定化细胞在含离子液体体系中重复使用１０次
后其相对催化活性保持在９３％，说明本研究固定化
细胞的操作稳定性有待于进一步提高。
３ 结论
在［ＢＭＩＭ］ＰＦ６／缓冲液两相体系中，研究了固
定化ＰｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍＬｉ ３转化甘草酸的反应，结
果表明在甘草酸转化体系加入一定比例的离子液
体，可以简化产物分离过程，增加反应物溶解度，进
而提高甘草酸转化率。而且离子液体具有较好的
稳定性和重复使用性，从而降低生产成本，但固定
化细胞重复使用性有待于进一步提高。随着固定
化细胞操作稳定性的提高，成本的逐渐降低，反应
体系的逐渐完善，在含绿色溶剂离子液体体系中生
物转化合成ＧＡＭＧ，具有重要的工业应用潜力。
参考文献：
［１］ ＯｈｔａｋｅＮ，ＫｉｄｏＡ，ＫｕｂｏｔａＫ，ｅｔａｌ．Ａｐｏｓｓｉｂｌｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆ３
ｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌｇｌｙｃｙｒｈｅｔｉｎｉｃａｃｉｄ，ａｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｏｆｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎ
（ＧＬ），ｉｎＧＬｉｎｄｕｃｅｄｐｓｅｕｄｏａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｉｓｍ［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，
２００７，８０（１７）：１５４５１５５２．
［２］ ＭｉｚｕｔａｎｉＫ，ＫｕｒａｍｏｔｏＴ，ＴａｎａｋａＯ，ｅｔａｌ．Ｓｗｅｅｔｎｅｓｓｏｆｇｌｙｃｙｒｈｅｔ
ｉｃａｃｉｄ３ＯｂｅｔａＤｍｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ
［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９４，５８（３）：５５４５５５．
［３］ ＡｒａｉＳ，ＮａｋａｓｈｉｍａＫ，ＯｇｉｎｏＣ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌｆｕｅｌ
ｆｒｏｍｓｏｙｂｅａｎｏｉｌｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｆｕｎｇｕｓｗｈｏｌｅｃｅｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓｉｎ
ｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｓ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍＭｉｃｒｏｂＴｅｃｈｎｏｌ，２０１０，４６（１）：５１５５．
［４］ ＳｕｒｅｓｈｋｕｍａｒＭ，ＬｅｅＣＫ．Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉ
ｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｓ［Ｊ］．ＪＭｏｌＣａｔａｌＢ：Ｅｎｚｙｍ，２００９，６０（１／２）：
３１０３１６．
［５］ ＷｅｕｓｔｅｒＢｏｔｚＤ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ
ｗｉｔｈｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍＲｅｃ，２００７，７（６）：３３４３４０．
［６］ ＨｅＪｕｎｙａｏ，ＺｈｏｕＬｉｍｉｎ，ＷａｎｇＰｕ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅｔｏｅｔｈｙｌ（Ｒ）３ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅｉｎａｎｉｏｎｉｃｌｉｑ
ｕｉｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ，２００９，４４（３）：
３１６３２１．
［７］ 冯世江，李春，李晖，等．葡糖酸苷酶生产菌株的筛选及其酶
学特性的研究［Ｊ］．
!
校化学工程学报，２００７，２１（６）：
９７７９８２．
［８］ 邹树平，张琦，李春，等．水／有机溶剂体系中产紫青霉全细胞
催化合成单葡糖醛酸基甘草次酸［Ｊ］．化工学报，２００９，６０
（８）：２０４０２０４５．
［９］ ＨａｂｕｌｉｎＭ，ＫｎｅｚＺ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆ（Ｒ，Ｓ）１ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌｋｉ
ｎｅｔｉｃｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｖｅｒＣａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａｌｉｐａｓｅＢｉｎｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｓ
［Ｊ］．ＪＭｏｌＣａｔａｌＢ：Ｅｎｚｙｍ，２００９，５８：２４２８．
［１０］ ＬｏｕＷｅｎｙｏｎｇ，ＷａｎｇＷｅｉ，ＬｉＲｕｉｆｅｎｇ，ｅｔａｌ．Ｅｆｉｃｉｅｎｔｅｎａｎｔｉｏｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ４′ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅｗｉｔｈｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｓｐ．ＡＳ２．２２４１ｃｅｌｓｉｎａｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｃｏｎ
ｔａｉｎｉｎｇｃｏｓｏｌｖｅｎｔｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，１４３（３）：
１９０１９７．
［１１］ ＨｅＤｏｎｇｍｅｉ，ＫａｌｅｅｍＩ，ＱｉｎＳｉｙｉｎｇ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｇｌｙｃｙｒ
ｒｈｅｔｉｃａｃｉｄ３ＯｍｏｎｏβＤｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙβＤｇｌｕｃｕ
ｒｏｎｉｄａｓｅｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｂｏｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｉｎｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ／ｂｕｆｅｒｂｉ
ｐｈａｓｉｃｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ，２０１０，４５（１２）：１９１６１９２２．
［１２］ ＭａｔｓｕｉＳ，ＭａｔｓｕｍｏｔｏＨ，ＳｏｎｏｄａＹ，ｅｔａｌ．Ｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ
ＩＬ８ａｎｄｅｏｔａｘｉｎ１ｉｎａｈｕｍａｎｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｉｎｅ［Ｊ］．Ｉｎｔ
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００４，４（１３）：１６３３１６４４．
１２ 第５期 陈金燕等：含离子液体体系中固定化细胞转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８