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生物加工过程 第5卷第2期
能性甜味剂；GAMG作为药物具有和甘草酸同样的
抗炎症、抗病毒等疗效。而甘草次酸(Glycyrrhetinic
—d．GA)址甘草酸生物转化后的另活’盹物质(转
化原理见蚓1)，是生物体直接吸收利Ⅲ的活7阵成
分，具有与甘草酸同样的药弹作用“，同时，可以利
用甘草次酸为底物生成更具药用价值的H。草次酸
类衍生物。
生物台成(；AMG和GA的原理
目前，口一D一葡葡精醛酸甘酶(卢一D—GlL-cumr·i—
dase，Ec3．21．31)作为撤告基因已广泛应用于高
等植物的分子克隆，饮用水和食晶中E co“的榆
验，蚓叫该酶还可被用于肿瘤的前体药酶导向治疗
方面“。而不同生物中的口一D—Glucuronidase作为催
化剂在甘草酸的转化中具有以下4种催化特性“：
(1)甘瞽酸一甘草次酸；(2)甘草酸—叩一D一单葡萄糖
醛酸基甘单次酸(Glvoy玎he面icacidmonoglucu—
ron·de，cAMG)_甘草次酸；(3)甘草酸一GAMG；
(4)cAMc—H草次酸。因此，围外学者认为该酶
具有外切式和内切咸水解酶之分4，然而至今元相
关文献予以详细阐述。
本实验窒自行筛选获得3株菌：nn”趔一；
Jp，Ⅱ-3、以印erg埘f廿5P．Ll一20和A掣ergi盯¨叩．Li-62催
化甘草酸分别生成【溃MG、GAMG和甘草次酸、甘草
次酸。冈此，本文研究了来自小同微生物tp卢一D—
Glucuronidase的酶学性质，从催化甘草酸形成产物
多样性的角度对卢上)一G1uct·m一·idase进行分析。
1材料与方法
1．1菌株
尸bn赴Ⅲ；Ⅱm印．L】_3、A中e嗤珊W印¨-20和As一
胛r胃i髓Ⅻ印．Li-62为北京理T大学生命科学与技术
学院生物催化研究室保存菌种。
l，2培养基与培养方法
参照文献[5—6J的方法。
1．3试剂
口．，)．单葡萄糖醛酸基甘草次酸标准品由南京工
业大学赠送，H草酸誓铵盐标准品和甘草次酸标准
，昂均岣自sigtna公司．H草酸币铵盐r}『新疆天山制
药有限公司提供，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分
析纯。
1．4代谢产物分析
薄层层析(TLc)：标准I帚及摇瓶发酵液经离心
后的上清液在硅胶板(G心54，青岛海洋化工集团干
燥剂厂)上点样，在展开剂(P(Bu0H)：y(cHf：lt)：
r(AcOH)：v(H，O)=4：l：4：1)中展开约13cm后
取出晾十，在254㈣·紫外灯r观察斑点。
1 5粗酶的制备
参照文献[5，7]的方法，其中nn制池m掣．Li一
3、^sPer埘zz瑚5P．Ⅱ-20和A印8曙洲Ms叩．Li_62的卢一D—
G1ucl，mn嗣ase制备用的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液
(50mm01／T。)的pH分别为42，5．8和6．2。
1．6 8一D—G1ucum州dase活力的测定
准确移取lmL粗酶液力¨人到2mL含有甘草酸
质量浓度2mg／mT，、pH为5．4的磷酸氢二钠-柠檬
酸缓冲液t50mn·oL，L)中，45℃条件下，反应30min
历，沸水浴使酶失活，取o．5mL反应液用甲醇定容
李lOmL，样液进高效液相色谱仪榆测，酶活以甘草
酸的消耗量表征。高效液相色谱仪的检测方法参
照文献[8—9]。
B—D—Glucuron-dase活力定义为在上述条件下，
每小时消耗l雌的目草酸所需要的酶量为一个活
力单位(u／mL)。
2结果与讨论
2，l 发酵产物多样性分析
以甘草酸为唯一碳源从新疆主要甘草产区的
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2007年5月 王小艳等：真菌产3种肛D-Glueuronidase酶学性质·2
Aspergillus即．Li一20和Aspergillus印．Li一62而言，Ag+
和cl，“对口一D—Ghmlnonidase的活性均有抑制作用，
J刊叫，低浓度的Mn“刘Aspergillus印．Li．62】8一D—Gla．
euronidase活性具有明显抑制作用，活力减少了
62％．而高浓度的Mn“刘Aspergilhassp．Li．20和4s—
pergillus印Li-62卢一D—Glueuronidase则有激活作用，
活力分别提高20％和26％，其他金属离子刘这两株
黼的酶活影响都不显著。3株阿的酶活均受一硫苏
糖醇(DTr)的抑制，剧时毓基乙醇(2-mereaptoetha-
n01)对PeniciⅡium印Li-3和Aspergillussp．Li一20口一
D—Glucuronidase酶活影响不显著，而刘Aspergillus
印．Li-62有明显的抑制作用，说明__二硫键有可能是
维持j3一D—Glucuronidase活性的必需基幽”，列维持
AspergillusspLi-62口一D—Glucuronidase的活性史为重
要；EDTA列Aspergillus印Li-20和Aspergillussp．Li一
62口一D—Glueuronidase有明显的抑制作用，这可能是
由于激活这两株阿口一D—Glucuronidase的活件需要有
金属离r的参与””1。
表1 金属离子及抑制剂对口一D一(；hleuronidase活性的影响
FableI Effectofmetalionsandinhibitorsontheactivityof8一D—gllmuronidase
2．5 3株菌卢一D—Glucuronidase的动力学常数(K。和
U。)的测定
3株菌均采用其酶催化反应最适pll的磷酸氢
■钠一柠檬酸缓冲液配置不耐质量浓度的甘争酸底
物，依次为0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，12，l4和1．6
mg／m1．的甘草酸溶液，3株菌所产伊D—Glucuroni—
dase与不同质量浓度的底物分别在其最适温度下
测定酶活力。采用双倒数作图法””(1,ineweaver—
Burk)计算口-D—Glucuronidase的k和％。结果见
幽9～11。在一定酶浓度下，在底物质量浓度较低
时，该反应与米氏方程的拟合度较好，Peaicillium
印．Li一3卢一D—Glucuronidase对甘草酸催化反应的米氏
常数K为0．328mmol／I．，最大反应迷度V⋯为
00035 inlll01／(L-min)；AspergillusspLi一20口．D．
Glucuroaidase的米氏常数墨。为3．61mmol／L，■。
为0034retool／(L’min)；Aspergillussp．Li一628一D-
G1ucuronids。．se的米氏常数K。为0．43mmol／L，r。。为
0106mlnol／(L·min)。
3结论
据目前围内外研究撤道，口．D—Glucuronidase的
表达多存侄于人体、老鼠和大肠杆茼中，存真荫和
植物中却未见该酶的表达，而本文筛选⋯了3株能
表达／3一D—Glueuronidas的真菌，并且在催化同-一底物
甘草酸时却表现出』，不吲的催化特性，列来源于3
种不同菌株中表达的卢一D—Glucuronidase的酶学性质
和反应动力学常数进行r研究，研究结果表明：nn—
icilliumsp．Lid产的口一t『)一Glucuronidase催化反应最
适pH4．2，最适温度为50℃，Mg“对其催化活力有
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22·
生物加工过程图9PeniciIliumspLi一3口一D—G[ueuronidase
Lineweaver—Burk双倒数图Fig．9
Lineweaver—tjurk plotofthe
Penieilliu．m sp．Li一3
口一D—glucuronidKse activity
—lUuLli800● j600，{400
。／
呈
R=0．995+8，／^
卜200x
—JJ．一
204嗍／(mmol·L6810rain-1J_图 0AspergillusspLi一20fl—D·Glucuronidase
Lineweaver—Burk双倒数图 FigIOLin we v r—Burkplotfthe
Aspegilhas spLi一20口一D—glueuronidaseactivity图】1Aqoergillussp
Li4华一D—Glucuronidase Lineweaver．Burk双倒数图Fig
l1LJneweaver—Burkplotf heAspergillussp
Li一62口一D—ghmuronidaseactivhy
促进作用lAspergillu*sp．15—20口一D—Glucuronidase催 化反应最适 H为58，最适温度为45℃，高浓度的
Mn2+能提高其酶活；而A印ergillus妒．Li452卢一D-Glu— curonidase的最适pH为6．2，最适温度为55℃，高第5卷第2期
浓度的Mn“对其具有激活作用，而低浓度的Mn“和 巯基乙醇对催化活力则有明显的抑制作用；此外．cu“、Ag+和D1rF对3株菌的口一D—Glucuronidasc均有明显的抑制作用。从以上研究结果表明：3株菌所产
口一D—Glucuronidase的催化杼降存在着一定差异二 同时，PenicilliumspL 一3、Aspergill s印Li-20和Aspergiflus
sp．Li-62所产启一D—Glucuronidase对甘草 酸催化的臣。分别为0328p,mol／L、3．61retool／[．和0 43mmol／L，其催化反应的最大反应速率∥⋯分别
为0035mmol／(L-min)、0．034InfIl01／(L·min)和0106mmol／(L·rain)，浇明4i同微生物表达的口一D—
Glucuronidase性质差异较人，而催化同一种物质形 成产物多样性的3种J8一D—Glucuron dase还有待于进
一步从基凶序列及蛋白结构进行深入研究。参考文献：II)ongHyunKim，SeungWoLeeBiotransfo皿]atio．olgycvrdletinicacid-3-0_B-D
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