全 文 ：第 １２卷第 １期
２０１４年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０１􀆰 ０１０
收稿日期：２０１３－１１－１８
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７０７４００）
作者简介：邹　 根（１９８０—），男，浙江慈溪人，博士，副研究员，研究方向：真菌遗传学；严　 兴（联系人），副研究员，ｙａｎｘｉｎｇ＠ ｓｉｂｓ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎ
木质纤维素酶基因资源挖掘及真菌酶系改造
邹　 根，刘　 睿，魏勇军，周志华，严　 兴
（中国科学院 上海生命科学研究院 植物生理生态研究所 合成生物学重点实验室，上海 ２０００３２）
摘　 要：简述了木质纤维素酶基因资源挖掘的策略和方法及其在丝状真菌酶系改造中的应用。 从候选基因的获取
（木质纤维素酶基因资源的挖掘和高效利用）、外源基因的表达、酶系的复配和重构等方面综述了丝状真菌酶系改
造的最新进展，并提出了丝状真菌酶系改造中亟须解决的关键问题。
关键词：木质纤维素；酶系；丝状真菌
中图分类号：Ｑ９３８􀆰 １　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０１－００６３－０９
Ｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ
ＺＯＵ Ｇｅｎ，ＬＩＵ Ｒｕｉ，ＷＥＩ Ｙｏｎｇｊｕｎ，Ｚｈｏｕ Ｚｈｉｈｕａ，ＹＡＮ Ｘｉｎｇ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ􀆰 Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ
ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ，ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｇｅｎｅｓ，ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｓｓｕｅｓ ａｂｏｕｔ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ􀆰 Ｋｅｙ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ
ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ；ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ
　 　 木质纤维素是地球上蕴藏太阳能量最大的部
分，具有可再生和储量丰富等优点，仅把每年再生
的木质纤维素折合成能量就相当于目前人类每年
消耗化石能量的 ２０ 倍［１］。 充分利用木质纤维素作
为工农业生产的原材料是我国经济社会可持续发
展的必然选择。 木质纤维素必须经过不同程度的
水解后才能转化为农业（动物饲料）、工业（溶剂及
其他化学品，造纸和纺织原料）及能源（燃料乙醇）
等行业所需的生产原料。 采用生物酶系降解木质
纤维素来取代原有酸碱水解的方法，不仅可以提高
木质纤维素原料的利用率，而且可以极大地减少对
环境的污染［２］。 因此，如何构建高效的纤维素降解
酶系以适应不同行业的需求，是未来发展绿色生产
工艺所需的核心技术。
工业上木质纤维素酶主要由丝状真菌生产，但
是其酶系存在种类不均衡、最适 ｐＨ 偏酸性、耐热性
较差等问题，限制了其应用范围和效果。 例如，在
燃料乙醇和丁醇的制造过程中，工艺要求将木质纤
维素中的纤维素和半纤维素都尽可能地降解为容
易发酵的单糖，但常用的里氏木霉 （ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｒｅｅｓｅｉ）的自身酶系（主要以外切酶为主）将纤维二糖
转化为单糖的速度很慢，所以往往需要加入 β 葡萄
糖苷酶，以加快单糖的转化。 又如，在造纸工艺中，
要求降解木质纤维素中的木质素和半纤维素而保
留其中的纤维素，因此要求丝状真菌的酶系具有比
较低的内切葡聚糖酶活性和比较高的半纤维素酶
活性。 由于不同工艺对于酶系的耐热性和 ｐＨ 特性
有不同的要求，并且不同种类和来源的原材料在木
质纤维素的组成上差别很大，因此要求对酶系的组
成作相应调整。 为了适应不同原料和不同工艺的
需求，经常要对工业菌株的酶系进行改造，复配甚
至重构。 而实现工业菌株酶系的改造，首先要了解
高效木质纤维素酶系的一般规律；其次，需要收集
丰富的木质纤维素酶基因资源作为候选基因；最
后，如何在丝状真菌中实现外源基因的高效表达并
精确调控酶系中不同成分的丰度也是酶系改造、复
配和重构亟须解决的关键技术问题［３］。
１　 自然界木质纤维素高效转化微生物
系统的酶系组成解析
　 　 木质纤维素由纤维素，半纤维素和木质素组
成，具有组成成分复杂、异质、结构高度聚合的特
性。 纤维素是 Ｄ 葡萄糖以 β １，４ 糖苷键组成的
长链，在这些长链之间通过氢键与范德华力等作用
形成高度有序的结晶聚合物（纤维素束） ［４－５］。 半纤
维素的主链主要由木糖和甘露糖构成，侧链由阿拉
伯糖和半乳糖等单糖和很多非糖基团构成［４－５］。 木
质素则是含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的
芳香性高聚物。 虽然木质纤维素的结构复杂，一般
情况下在自然界中很难被降解，但是自然界也存在
着非常高效的纤维素降解微生菌 （如 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ和 Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ 等）或者微生物群落（如白
蚁肠道微生物群落等）。 对这些高效的微生物系统
进行解析，了解其中的木质纤维素降解机制，将会
为工业菌株的酶系改造、复配甚至重构提供坚实的
理论基础和指导。
真菌及放线菌的纤维素酶游离酶系统和厌氧微
生物的纤维小体系统被认为是微生物所常用的木质
纤维素降解机制。 但在一些高效纤维素降解菌中（如
Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ），既没有发现纤维
小体相关结构，也没有发现游离酶系统的外切纤维素
酶，这说明微生物中还存在其他的高效木质纤维素降
解机制［６－７］。 近些年，随着研究工作的深入，人们对
于木质纤维素降解机制的多样性有了更多的认识。
在细菌研究方面，通过对 Ｃ􀆰 ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ
８９０３和同属其他 ７ 株菌（具有不同的纤维素降解能
力）的泛基因组分析，确定一个含有 ＧＨ９、ＧＨ４８ 和
ＣＢＭ３结构域的纤维素酶对于菌株的高纤维素降解
能力起关键作用［８］。 敲除纤维素降解菌 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ一个属于 ＧＨ９ 家族的纤维素酶
Ｃｐｈｙ３３６７（基因）之后，该菌就不能在以纤维素为唯一
Ｃ 源的培养基上生长，这说明该纤维素酶在
Ｃ􀆰 ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ的酶系中起到了关键作用［９］。
在丝状真菌研究方面，通过对里氏木霉的工业
菌株 Ｒｕｔ Ｃ３０和其野生菌株的基因组学、转录组学
和蛋白质组学的比较研究［１０－１３］，深入阐述工业菌株
高产纤维素酶的机制。 首先，工业菌株中碳代谢阻
遏因子 Ｃｒｅ１的部分缺失使其木质纤维素酶合成不
再受到葡萄糖的阻遏。 同时，该菌株还缺失了 ８５ ｋｂ
的大片段，其中包含和分泌途径中糖基化修饰有关
的蛋白等，这些是工业菌株能够高效分泌纤维素酶
的原因之一。 此外，还发现里氏木霉在纤维素诱导
下高表达的酶并局限于纤维素酶和半纤维素酶，如
Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ、Ｃｉｐ１和 Ｃｉｐ２等辅助蛋白都是高表达的蛋
白，表明这些辅助蛋白在木质纤维素降解过程中也
起着重要作用。 草酸青霉是由山东大学曲音波教
授分离到的一株纤维素酶高产菌株，经过长期的诱
变获得了产酶能力进一步提高的突变株 Ｊｕ Ａ１０
Ｔ。 笔者所在课题组和曲音波教授课题组合作，对
草酸青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）的野生株（１１４ ２）
和突变株（ＪＵ Ａ１０ Ｔ）进行基因组、分泌蛋白组、
转录组等多方面研究，揭示了草酸青霉的酶系特点
和突变株高产纤维素酶的原因。 草酸青霉比里氏
木霉有着更加完善的酶系，例如，其 β 葡萄糖苷酶
不仅酶活高而且耐热性好，有良好的工业应用前
景。 而突变株与野生株相比，在纤维素和麸皮诱导
条件下分泌的酶系更加优化，野生株 １１４ ２中较多
的蛋白酶和淀粉酶在突变株 ＪＵ Ａ１０ Ｔ 中的表达
量明显下降，而木质纤维素酶比例则上升（图 １）。
进一步研究发现，突变株酶系的优化除了和一些转
录因子的突变有关外，还和一些纤维素酶本身的启
动子突变有关，这些研究无疑给进一步优化木质纤
维素酶系提供了极为有意义的指导作用［１４－１７］。
在微生物群落的研究方面，Ｐｏｐｅ 等［１８］在对袋鼠
肠道微生物群落进行元基因组学分析后，发现了一个
新的木质纤维素酶降解系统，其中负责水解产物（寡
糖）转运的基因（ ｓｕｓＣ 和 ｓｕｓＤ）与淀粉水解产物转运
系统非常相近。 中国科学院微生物研究所东秀珠教
授在牦牛瘤胃的元基因组研究中也发现了类似的木
质纤维素降解机制［１９］。 笔者所在课题组对培菌白蚁
４６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
的肠道微生物进行了元基因组测序，揭示了白蚁、真
菌和白蚁肠道微生物之间的共生关系，发现肠道微生
物在木质纤维素降解过程中也起到了重要的作用（水
解半纤维素的支链和纤维寡糖） ［２０］。
随着对木质纤维素降解机制研究的深入，人们
已经认识到木质纤维素的降解不仅需要纤维素酶
（内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β 葡萄糖苷酶）
和种类多样的半纤维素酶（糖基水解酶及糖酯酶），
还需要一些氧化还原酶等辅助蛋白的参与［２１］。 例
如，糖基水解酶 ＧＨ６１家族，最初被认为是一种糖苷
水解酶，但最新的研究表明它实际上是一类铜离子
依赖的多糖单加氧酶［２２－２３］，它通过氧化还原反应催
化纤维素结晶区的葡聚糖链断裂，形成氧化和非氧
化纤维糊精，提高纤维素的水解效率。 朱红秘孔菌
（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）来源的纤维二糖脱氢酶主
要通过氧化还原反应断裂纤维素链，产生氧化和非
氧化纤维糊精，为纤维素酶提供更多反应末端，使
得里氏木霉分泌酶系对麦秆的降解效率大幅提
高［２４］。 里氏木霉中发现的 Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ，可以破坏葡聚
糖链间的氢键，使大块纤维素聚团发生松团并有明
显解聚现象，造成木质纤维素结晶度下降从而提高
纤维素酶的吸附能力［２５－２６］。 充分利用这些木质纤
维素降解相关的辅助因子，将会极大提高对木质纤
维素的利用效率。
Ｇ—葡萄糖阻遏条件；Ｃ—纤维素诱导条件；ＣＷ—纤维素和麸皮共同诱导条件
图 １　 草酸青霉主要胞外蛋白的表达情况和组成比例
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ
２　 木质纤维素酶的分类和 ＣＡＺｙ 数
据库
　 　 很多序列差异很大的糖基水解酶可能催化同
样的酶反应，同时同一种酶又往往能够催化多种不
同类型的酶反应，所以基于酶的催化反应类型和作
用底物的 ＥＣ分类方法在糖基水解酶的分类上具有
明显的缺陷。 人们后来还发现，即使三维结构相似
的糖基水解酶也会具有完全不同的催化特性，并且
很多其他的木质纤维素酶也有类似的特点。 由于
木质纤维素酶的结构与功能之间存在复杂的对应
关系，所以建立一个能够体现结构和功能关系的分
类系统，是实现木质纤维素酶基因资源高效挖掘和
利用的关键。
１９９１年法国科学家 Ｂｅｒｎａｒｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ提出按照
氨基酸序列的相似性来对糖基水解酶进行分类的
方法。 随后，他将类似的方法扩展到了其他参与糖
及糖基复合物的合成、降解和修饰相关酶的分类
上，并于 １９９８ 年正式发布了在线的 ＣＡＺｙ 数据库，
其中包括糖基水解酶（ＧＨ）、糖酯酶（ＣＥ）、糖裂解酶
（ＰＬ）和糖基转移酶（ＧＴ）（统称为碳水化合物活性
酶，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ，ＣＡＺｙｍｅ）以及碳水
化合物结合结构域（ＣＢＭ） ［２７］。 ２０１３ 年，ＣＡＺｙ 数据
库把木质纤维素降解所需的辅助蛋白 （ ａｕｘｉｌｉａｒｙ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ＡＡｓ）也收录进来，其中主要包括了木质纤
维素降解所需的氧化还原酶［２８］。 目前，ＣＡＺｙ 数据
库已成为注释碳水化合物活性酶并进行功能预测
的重要依据，几乎所有分析微生物基因组与元基因
组的研究工作都会参考此数据库［２９］。 随着基因组
和元基因组测序的开展，ＣＡＺｙ 数据库已收集糖基
水解酶序列超过 １３ 万余条（分为 １３１ 个家族，但其
中 ５ 个家族已经被取消），多糖裂解酶序列超过
５６　 第 １期 邹　 根等：木质纤维素酶基因资源挖掘及真菌酶系改造
３ ０００条（分为 ２２ 个家族），糖酯酶序列超过 １ 万条
（分为 １６ 个家族） ［２７］。 其中有 ４９ 个糖基水解酶家
族、１０个糖酯酶家族及 ３个多糖裂解酶家族与木质
纤维素降解相关。
随着序列数量的增多，基于 ＣＡＺｙ 数据库的分
类系统也遇到了一些问题和挑战。 首先，新增的序
列中大多数都没有进行酶活性分析。 到 ２００７ 年底，
只有不到 １０％ 的序列做过酶学活性分析，现在这一
比例还在不断降低，这导致 ＣＡＺｙ 数据库在序列功
能预测和注释方面越来越不可靠［２７］。 其次，随着序
列数量的增多，ＣＡＺｙ 数据库分类已经显得越来越
粗糙，通常仅包括了 ｃｌａｎ 和 ｆａｍｉｌｙ２ 个基本的层次，
只有少数家族进行了 ｓｕｂｆａｍｉｌｙ 划分，这样粗层次的
分类造成了同一家族内包含了多种不同活性和底
物特异性的酶，不一致的功能信息还会影响新序列
的功能预测［３０－３１］。 针对以上问题，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ
团队对 ＣＡＺｙ数据库中的 ＧＨ５、１３和 ３０家族做了进
一步的亚家族分类。 以与木质纤维素的降解密切
相关的 ＧＨ５家族为例，它是整个 ＣＡＺｙ 中最大的家
族之一，通过亚家族分类，其 ８０％的基因被划分到
５１个不同的亚家族中。 有 ３１ 个亚家族做过酶学分
析，其中的 １７个亚家族都只对应了一种酶活性，剩
余的 １４个亚家族虽然对应 ２种以上的酶活性，但是
往往以一种酶活性为主［３０］。 ＧＨ５ 家族的亚家族划
分也与其来源菌种所处的系统发育地位一致。 这
些结果说明：对 ＣＡＺｙ 数据库收录基因做进一步的
整理与系统分类，可以更好地反映基因序列结构与
其功能、来源物种和系统发育地位之间的相关性，
而一个优良的分类系统对于木质纤维素酶基因资
源的挖掘和应用是非常关键的。
由于需要进行大量的序列精确比对以及应用
多种方法来构建可靠的系统进化树，所以亚家族的
划分费时费力，这也是相关工作进展缓慢的重要原
因。 最近， Ｂｕｓｋ 等［３２］ 提出了一种肽段模式识别
（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ） 算法来进行亚家族的划
分。 这种方法首先需要建立每个亚家族的保守肽
段库，然后根据糖基水解酶所具有的保守肽段的数
量来确定亚家族的归属。 因为不用进行大量的序
列比对和建树的工作，所以这是一种简单快速的方
法，而且也获得了很好的分类结果［３２］。 相信这种方
法在将来不仅会用于糖基水解酶的分类，而且也有
可能应用于其他的木质纤维素酶的分类。
木质纤维素酶往往都具有多个结构域，以上所
述的分类方法，基本上都只考察了催化结构域的序
列，而对非催化结构域则基本不予考虑。 最近的研
究表明，非催化结构域对于酶的功能也有很明显的
作用［３３］，所以非催化结构域在木质纤维素酶的精细
分类方面可能也会起到一定的作用。
３　 木质纤维素酶基因资源的挖掘
３􀆰 １　 通过基因组和元基因的序列注释
随着测序技术的进步，已经有越来越多的微生
物基因组、转录组和元基因组被测序。 目前，已经
有 ２３ ９１０个细菌基因组、６４９个古菌基因组和 ５ ８１８
个真核生物基因组或转录组已经完成测序或正在
测序［３４－３５］， 其 中 包 括 了 Ｃ􀆰 ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＡＴＣＣ
２７４０５、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ １１Ｂ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒ⁃
ｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ８９０３、 Ｃ􀆰 ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ
ＩＳＤｇ和丝状真菌 Ｔ􀆰 ｒｅｅｓｅｉ、Ｐ􀆰 ｏｘａｌｉｃｕｍ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ 等高效降解木质纤维
素的微生物［３６］。 Ｍｅｄｉｅ 等［３７］发现大约 ４０％的细菌
基因组中至少含有 １ 个纤维素酶基因，而在纤维素
降解菌的基因组中木质纤维素酶基因的数量更高。
这些基因组序列是获取新的木质纤维素酶基因资
源的重要来源。
在元基因组测序方面，目前已完成 ３９６ 个测序
项目（包含 ３ ０７０ 个试样），包括了瘤胃、白蚁肠道、
厌氧沼气发酵系统等许多木质纤维素高效降解系
统的元基因组数据［３５］。 Ｈｅｓｓ等［３８］对牛瘤胃中柳枝
稷上黏附的细菌进行了元基因组测序分析，共发现
了 ２７ ７５５个新的碳水化合物活性酶基因（主要是木
质纤维素降解基因）。 这些获得的新基因极大地扩
展了碳水化合物活性酶基因的数量，同时也表明元
基因组是获取新的木质纤维素酶基因资源的重要
来源［３８］。 但是由于元基因测序大多数使用二代高
通量测序技术（４５４、Ｓｏｌｅｘｓａ 或者 ＳＯＬｉＤ），序列较短
且多数未能拼接，所以大部分都是不完整的基因序
列。 随着测序技术的进步（读序更长、序列更多）和
拼接技术的完善，可以预期通过对元基因组注释获
得数量更多、质量更高的木质纤维素酶基因资源。
如何对这些大量的基因组、转录组和元基因
组数据进行高通量的、准确的注释，是进行木质纤
维素酶基因资源挖掘所需要解决的关键技术问
题。 对木质纤维素降解基因进行注释的基本方法
是通过 ｂｌａｓｔ 和 ｈｍｍ⁃ｓｅａｒｃｈ，通过找到相似序列来
进行家族分类和功能预测。 目前，ｄｂＣＡＮ 数据库
６６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
（ｈｔｔｐ：∥ｃｓｂｌ􀆰 ｂｍｂ􀆰 ｕｇａ􀆰 ｅｄｕ ／ ｄｂＣＡＮ ／ ）可以在线对
用户提交的基因组数据进行自动而全面的碳水化
合物活性酶注释（涵盖了木质纤维素酶基因） ［２９］ ，
并且 ｄｂＣＡＮ数据库还对很多元基因组来源的木质
纤维素酶进行了自动注释和收集。
由于木质纤维素酶基因序列的多样性和模块
化的结构以及（元）基因组测序产生的持续增加的
数据量，使得 ＣＡＺｙ 数据库在功能物种预测方面的
准确性大幅下降。 要确定一个新发现的木质纤维
素酶基因的功能，往往需要对几个甚至十几个底物
进行催化反应分析后才能确定，这严重地制约了资
源的利用效率。 所以，要提高木质纤维素酶基因注
释的准确性和效率，则有待于在 ＣＡＺｙ 数据库分类
的基础上做进一步的完善，建立一个更加能体现结
构与功能关系的分类系统。
３􀆰 ２　 通过（元）基因组文库的功能筛选
通过（元）基因组文库的功能筛选是获得木质
纤维素酶基因资源的另外一种途径，由于这种方法
不依赖于已知序列的相似性，因此可以与序列注释
的方法互补，理论上有可能筛选到更为新颖的木质
纤维素酶基因。 国内外的研究者通过对（元）基因
组文库的功能筛选已经从各种环境试样中筛选到
了大量新颖的木质纤维素酶基因［３９］。
利用功能筛选的方法从环境试样中筛选木质
纤维素酶，需要构建高质量的元基因组文库，但是
由于某些环境下微生物群落的生物量特别低（例如
白蚁肠道），所以很难构建出高质量的、插入大片段
的元基因组文库。 笔者所在课题组从 ２个方面对白
蚁肠道微生物试样的 ＤＮＡ提取方法进行了优化：一
方面，建立了以胰酶解离法结合差速离心的方法，
有效降低了肠道微生物 ＤＮＡ 提取过程中来自白蚁
基因组 ＤＮＡ 的污染；另外一方面，将多重置换扩增
技术（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＤＡ技术）
应用于白蚁肠道元基因组 ＤＮＡ的全基因组扩增，可
以在群落结构不发生明显变化的基础上获得足够
的高质量元基因组 ＤＮＡ［４０］。 这些技术方法的建
立，为元基因组学方法应用于白蚁肠道微生物群落
的研究打下了坚实的基础，并为其他生物量低的环
境试样进行元基因组研究提供了借鉴。 利用这套
技术方案，笔者所在课题组成功地构建了一个培菌
白蚁和一个食木白蚁的肠道微生物元基因组 ｆｏｓｍｉｄ
文库并对内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β 葡萄糖
苷酶和木聚糖酶进行了功能筛选，获得了几百个木
质纤维素酶阳性克隆，并克隆和表达了一些具有工
业应用前景的木质纤维素酶，其中一个 β 葡萄糖苷
酶（Ｂｇｌ ｇｓ１）的最适温度达到 ９０ ℃，在 ７５ ℃保温
２ ｈ，仍然能保留 ７０％以上的酶活性［４１］。
另外，笔者所在课题组还构建了沼气发酵群落
的元基因组 ｆｏｓｍｉｄ 文库，并对内切葡聚糖酶、外切
葡聚糖酶、β 葡萄糖苷酶和木聚糖酶进行了功能筛
选，获得了上千个阳性 ｆｏｓｍｉｄ 克隆。 优化了对这些
ｆｏｓｍｉｄ 克隆进行批量测序的方案，从中获得了大量
有活性的木质纤维素酶基因，将部分基因在丝状真
菌 Ｒｕｔ Ｃ３０中表达后，显著优化了丝状真菌中 Ｒｕｔ
Ｃ３０的酶系组成［４２－４３］。 例如，将来自沼液元基因组
文库的纤维素酶基因 ｅｘｏ２ｂ 的催化区和里氏木霉的
ｃｂｈ１基因通过 ｌｉｎｋｅｒ 融合，并用优化后的 ｃｂｈ１ 启动
子 ｐｃｂｈ１ｍ２［４４］和 ｔｒｐＣ终止子组成表达盒［４２］在里氏
木霉中表达后，和出发株相比，转化子的发酵液水
解预处理玉米秸秆所产生的葡萄糖增加了 １９􀆰 ８％
（图 ２） ［４２，４４］。
图 ２　 从沼气厌氧发酵群落筛选到的内切葡聚糖酶
基因 ｅｘｏ２ｂ和里氏木霉自身 ｃｂｈ１基因融合
表达示意
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｘｏ２ｂ （ａｎ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ
ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｇａｓ
ｄｉｇｅｓｔｅｒ） ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｃｂｈ１
因为（元）基因组文库的构建往往是在大肠杆
菌中进行的，所以目前功能筛选往往是以大肠杆
菌为宿主来进行的。 但是由于大肠杆菌存在如密
码子偏好性和调控元件的缺失等问题，功能筛选
不一定筛选到所有的具有相应功能的基因。 据
Ｇａｂｏｒ等［４５］的研究，元基因组文库中的基因大约
只有 ４０％可以在大肠杆菌中表达，据此估计很多
的木质纤维素酶基因在以大肠杆菌为宿主大肠杆
菌中并没有表现出功能。 为了解决这一问题，可
以将一些宽宿主的复制元件（例如 ＲＫ２ 载体的复
制元件）加入文库构建载体中，这样构建好的元基
因组文库就可以从大肠杆菌中转移到其他宿主
（包括多数革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌）中
进行功能筛选［４６］ 。
７６　 第 １期 邹　 根等：木质纤维素酶基因资源挖掘及真菌酶系改造
４　 丝状真菌中木质纤维素降解基因的
异源表达
　 　 因为丝状真菌具有丰富的木质纤维素酶酶系，
且胞外蛋白的分泌水平相比其他微生物具有很大
的优势，所以用于工业化生产的纤维素酶大多来自
于真 菌， 比 较 典 型 的 生 产 菌 株 有 木 霉 属
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ） ［１３］、曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） ［４７］和青霉属
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ） ［１４，１７］等。 用于纤维素酶生产的丝状真
菌往往经过了长期的诱变，蛋白分泌量达到了非常
高的水平，例如里氏木霉 Ｒｕｔ Ｃ３０ 胞外蛋白水平可
达 １００ ｇ ／ Ｌ以上［１４，４８］。
由于这些丝状真菌自身的酶系往往不能满足
不同工艺和原材料的要求，所以需要对酶系做进一
步的完善。 近年来随着丝状真菌遗传操作系统的
不断完善，通过表达外源的木质纤维素酶基因，可
以弥补丝状真菌自身酶系的不足［４７］。 但由于木质
纤维素酶来源丰富多样，其中一些异源蛋白在真菌
表达系统存在表达量较低或者难以表达的情况。
为了解决这个难题，研究人员进行了多方面的尝
试，并取得了很多有益经验，主要集中在表达宿主、
表达载体、外源基因优化等几方面。
在宿主的改造方面，主要基于早期一些通过传
统诱变方法选育出的优良菌株作进一步优化［１０］。
特别是这些优良菌株基因组的解析，对表达宿主的
定向进化提供了很大的帮助。 笔者所在课题组和
山东大学曲音波教授实验室合作对草酸青霉基因
组、转录组和分泌蛋白组解析发现，转录调控因子
（ＣｒｅＡ、ＡｍｙＲ等）的相关突变是菌株纤维素酶活提
高的关键所在［１５－１７］。 因此，根据这些研究发现的调
控因子，对表达宿主进行遗传改造后来表达异源蛋
白，可以获得较高的产量［１１］。 此外，还可以利用全
局性转录激活因子（如 Ｘｙｒ１）的敲除来构建无背景
的表达宿主，再通过组成型表达启动子可以获得较
纯的目标纤维素酶［４９－５０］。 宿主分泌途径中一些蛋
白酶体会降解不能够正确折叠的异源蛋白，对这些
蛋白酶体进行敲除可以提高异源蛋白的分泌量，同
时该途径中的 Ｐｄｉ等分子伴侣的过表达也可以提高
蛋白的表达量［５１］；异源蛋白分泌到胞外以后，还有
可能被胞外蛋白酶降解，也有研究者通过敲除胞外
蛋白酶来提高异源蛋白的成功率［４７，５２］。 笔者所在
课题组通过对里氏木霉和毕赤酵母的分泌途径进
行研究发现，木霉分泌途径的糖基化水平更加适合
真菌来源的 ＢｇｌＳ的表达，可以获得更高的活性和稳
定性［５３］，这和 Ｒｕｔ Ｃ３０在诱变过程中导致的分泌能
力增强有关。 木霉中独特的 ＥＮＧａｓｅ ｅｎｄｏ Ｔ 起了关
键作用，它不仅可以用于其他容易过糖基化的表达
系统的改造，也可以进一步调控其表达量，将木霉
改造成适合不同糖基化程度的表达宿主，这些都说
明里氏木霉作为一个表达宿主具有很大的应用
前景。
表达载体方面最主要是启动子的优化。 微生
物表达系统中的启动子主要分为组成型启动子和
诱导型启动子。 丝状真菌表达系统组成型启动子
常用的有 ｇｐｄＡ、 ｔｒｐＣ、 ｐｄｃ、 ｐｋｉ 等强组成型启动
子［４９－５０］，一般用于不需要诱导的发酵条件。 诱导型
启动子，在某些诱导条件下比 ｇｐｄＡ 等组成型启动
子效果要好很多，而木质纤维素酶的发酵本身就是
诱导条件，因此选用如 ｃｂｈ１ 等强诱导型启动子是表
达纤维素酶的首选［５４］。 但是这些启动子上的很多
诱导和阻遏因子（Ｘｙｒ１、Ｃｒｅ１、ＡＣＥ１ 等）的结合位点
影响着外源基因的转录水平，笔者曾通过在 ｃｂｈ１ 启
动子上用激活因子 ＡＣＥ２ 和 Ｈａｐ２ ／ ３ ／ ５ 蛋白复合体
的结合位点取代阻遏因子 Ｃｒｅ１ 的结合位点成功提
高了启动子的活性［４４］。
制约外源基因表达最关键的因素是基因本身。
基因转录、翻译、再到分泌，均存在一些内源基因不
会遇到的问题。 首先，不同生物对各种密码子的使
用频率不同，丝状真菌使用频率高的密码子可能在
原核细胞中被用得很少。 因此必须根据宿主密码
子改造基因的编码序列，才能得到高表达的蛋白。
此外，真核生物基因含有内含子，因此真核表达系
统在表达外源基因时可能会存在由于错误剪切而
导致 ｍＲＮＡ不稳定的情况，目前已能根据宿主预测
酶切位点再利用人工合成 ＤＮＡ 或基因的定点突变
来解决问题［３４］。 通过对序列优化外源基因能够翻
译成蛋白，但是真核表达系统还需进一步通过分泌
途径才能成功将蛋白分泌到胞外，分泌途径中会对
一些错误折叠蛋白进行标记，然后进入解内质网相
关的蛋白质降解 （ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＥＲＡＤ），而异源蛋白往往会被标志而进
入到 ＥＲＡＤ 途径。 笔者所在课题组在里氏木霉中
直接表达元基因组来源的纤维素酶基因 ｅｘｏ２ｂ 未获
成功，和木霉中高表达的 ｃｂｈ１ 基因通过 ｌｉｎｋｅｒ 融合
后可以成功表达，这可能是因为内源蛋白作为
Ｃａｒｒｉｅｒ可以成功通过分泌途径防止异源蛋白被识别
８６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
进入 ＥＲＡＤ［４２］。 上述这些方法并不是对所有的异
源木质纤维素降解基因都有效。 因此，如何进一步
提高异源木质纤维素降解基因表达的成功率和表
达量，是实现木质纤维素酶基因资源高效利用和酶
系改造中亟待解决的关键技术问题之一。
５　 真菌木质纤维素酶的复配和重构
在工业应用中，研究人员尝试将不同微生物来
源的酶进行复配来优化构建“鸡尾酒”酶系，许多复
合酶制剂都是在里氏木霉分泌酶系的基础上复配
了其他微生物来源的木质纤维素降解酶［５，５５］，这是
优化木质纤维素酶系的重要方法。 里氏木霉酶系
存在 β 葡萄糖苷酶酶活低（仅为 ３ ＩＵ ／ ｍＬ）、半纤维
素酶类少、热稳定性不佳、最适 ｐＨ 偏酸性等问题，
这极大地限制木霉纤维素酶的应用［５６］。 因此，根据
不同用途在木霉酶系的基础上复配合适的其他来
源的木质纤维素酶是十分必要的。
Ｍａ等［５７］在里氏木霉发酵液基础上额外添加草
酸青霉来源的 β 葡萄糖苷酶（Ｐｂｇｌ１）处理玉米秸秆，
还原糖产量提高 ８０％，添加来自白蚁肠道的 β 葡萄
糖苷酶则可以使还原糖产量提高 ８７％［４１］。 通过元基
因组测序从牛瘤胃微生物群落中获得了 ４个活性较
好的 β 葡萄糖苷酶，将其中一个 β 葡萄糖苷酶低剂
量地添加到商品化木霉纤维素酶中，可使水解玉米秸
秆的效率提高 ２０％［５８］。 其次，半纤维素酶在木质纤
维素降解中也发挥重要作用，它们通过降解半纤维素
使内部的纤维素暴露出来，增加其与酶的接触面积，
提高降解效率。 Ｇａｏ 等［５９］对温泉和草料堆肥试样进
行菌群富集和筛选，获得了一批耐热性良好、酶活较
高的半纤维素酶，其中包括木聚糖酶、β 木糖苷酶、α
葡糖醛酸酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。 在里氏木霉的纤
维素酶中额外添加这些新发现的酶，可使水解木质纤
维过程中的木糖产率提高近 ７０％，同时酶系的耐热性
和稳定性也获得了很大提升。 近年来，越来越多研究
表明木质纤维素降解过程中除了水解反应外，同样存
在氧化还原反应，虽然在里氏木霉中也有多糖裂解单
加氧酶，但是添加其他真菌来源的多糖裂解单加氧酶
可以提高木霉酶系的水解效率［６０ ６２］。 而 Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ、
Ｃｉｐ１和 Ｃｉｐ２等辅助蛋白则可以改变木质纤维素的结
构，增加木质纤维素酶的作用效果［１０，２５］。 在酶系复
配的过程中，除了根据工艺和原料找到适当的候选
酶，还需要进行大量的实验对酶系中不同酶的组成比
例进行优化，以达到最佳的组成比例。 酶系复配在商
品化纤维素酶方面已经获得了应用，诺维信和杰能科
利用这种“鸡尾酒”式的酶系复配方法成功弥补了真
菌酶系的自身不足，而且避免了生产菌株异源表达多
种基因的种种问题。 目前，此方法成功应用于他们的
商品纤维素酶制剂 Ｃｅｌｌｉｃ® ＣＴｅｃ２ 和 Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１５００
生产中。
利用复配的方法尽管可以获得更完善的酶系，
但是需要通过不同菌种发酵并根据用途进行配比，
这会导致工业生产的步骤增多和成本升高。 近年
来，随着丝状真菌遗传操作系统的完善，在技术上
已经可以做到在一个宿主中表达一个或者多个本
身欠缺的木质纤维素酶或辅助酶，并且可以进一步
敲除一些不需要的酶，从而重构出一个全新的酶
系，这将为木质纤维素酶的酶系优化和生产带来新
的技术变革。 要在一个丝状真菌宿主中合成一个
能够适应不同工业用途的全新酶系，其关键在于如
何精确地调控酶系中不同成分的比例，这是研究者
下一步努力的目标。
６　 展　 望
木质纤维素酶在食品、纺织、医疗、能源等领域
都有着广泛的应用，但是这些酶的生产菌株还有进
一步优化空间来降低生产成本。 今后，随着木质纤
维素酶基因资源的挖掘和功能表征，丝状真菌遗传
操作系统的完善以及近年发展起来的合成生物技
术方法，我们将能够完全按照生产工艺和原材料的
要求，对调控元件和木质纤维素酶标准元件进行编
程式组装，在丝状真菌中实现精确可控的表达，从
而利用丝状真菌“合成”出适合不同工业应用的酶
系［６３］。 可以预见，不久的将来丝状真菌“合成”的
木质纤维素酶系可以为人们的生活提供更加健康、
环保和便捷的条件。
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Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，７３（１９）：６０９８⁃６１０５􀆰
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ａｌ􀆰 Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｃｏｒｅ ａｎｄ ｐａｎｇｅｎｏｍｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ
ｆｏｒ ｎｏｎｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍａｌ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｂｉｏｍａｓｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２０１２，１９４（１５）：４０１５⁃４０２８􀆰
［ ９ ］ 　 Ｔｏｌｏｎｅｎ Ａ Ｃ， Ｃｈｉｌａｋａ Ａ Ｃ， Ｃｈｕｒｃｈ Ｇ Ｍ􀆰 Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ
ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ９ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｃｐｈｙ３３６７ ［ Ｊ］ ． Ｍｏｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，７４（６）：１３００⁃１３１３􀆰
［１０］ 　 Ｂａｋｅｒ Ｓ Ｅ，Ｌｅ Ｃｒｏｍ Ｓ，Ｓｃｈａｃｋｗｉｔｚ Ｗ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ
ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｈｙｐｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｕｓｉｎｇ
ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［ Ｊ］ ． ＰＮＡＳ，２００９，１０６（３８）：
１６１５１⁃１６１５６􀆰
［１１］ 　 Ｋｕｂｉｃｅｋ Ｃ Ｐ，Ｍｉｋｕｓ Ｍ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｙｐｏｃｒｅａ
ｊｅｃｏｒｉｎａ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２００９，ｄｏｉ：１０􀆰 １１８６ ／ １７５４⁃６８３４⁃
２⁃１９􀆰
［１２］ 　 Ｓｅｉｄｌ Ｖ，Ｇａｍａｕｆ Ｃ，Ｄｒｕｚｈｉｎｉｎａ Ｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｔｈｅ Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ） ｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｍｕｔａｎｔ ＲＵＴ Ｃ３０ ｌａｃｋｓ ａ
８５ ｋｂ （２９ ｇｅｎｅ⁃ｅｎｃｏｄｉｎｇ） ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ ｇｅｎｏｍｅ［ Ｊ］ ．
ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，ｄｏｉ：１０􀆰 １１８６ ／ １４７１⁃２１６４⁃９⁃３２７􀆰
［１３］ 　 Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｄ，Ｂｅｒｋａ Ｒ Ｍ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ
（ｓｙｎ􀆰 Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ） ［ Ｊ］ ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６ （ ５）：
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［１４］ 　 Ｇｕｓａｋｏｖ Ａ Ｖ􀆰 Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｉｎ ｂｉｏｆｕｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，２９（９）：４１９⁃４２５􀆰
［１５］ 　 Ｌｉｕ Ｇ， Ｑｉｎ Ｙ， Ｌｉ Ｚ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ： ｆｒｏｍ ｓｔｒａｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｏ ｓｙｓｔｅｍｓ
ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２０１３，４（５）：５２３⁃５３４􀆰
［１６］ 　 Ｌｉｕ Ｇ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｑｉｎ Ｙ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｓｔｒａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ
ｈｙｐｅｒ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ［ Ｊ］ ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１３，ｄｏｉ：
１０􀆰 １０３８ ／ ｓｒｅｐ０１５６９􀆰
［１７］ 　 Ｌｉｕ Ｇ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｗｅｉ Ｘ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ
ｒｅｖｅａｌ ｕｎｉｑｕｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ［Ｊ］ ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（２）：ｅ５５１８５􀆰
［１８］ 　 Ｐｏｐｅ Ｐ，Ｄｅｎｍａｎ Ｓ，Ｊｏｎｅｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｅｒｂｉｖｏｒｙ ｂｙ ｔｈｅ
Ｔａｍｍａｒ ｗａｌｌａｂｙ ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ ［ Ｊ ］ ． ＰＮＡＳ， ２０１０， １０７
（３３）：１４７９３⁃１４７９８􀆰
［１９］ 　 Ｄａｉ Ｘ， Ｚｈｕ Ｙ， Ｌｕｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ
ｆｉｂｒｏｌｙｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎ Ｙａｋ Ｒｕｍｅｎ ［ Ｊ ］ ． ＰｌｏＳ Ｏｎｅ， ２０１２， ７
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［２０］ 　 Ｌｉｕ Ｎ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｚｈｏｕ Ｈ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ａ ｆｕｎｇｕｓ⁃ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ
ｔｅｒｍｉｔｅ （ Ｏｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ） ［ Ｊ］ ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１３， ８
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［２１］ 　 Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ Ｂ􀆰 Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｆｕｅｌｓ［ Ｊ］ ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
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［２２］ 　 Ｌａｎｇｓｔｏｎ Ｊ Ａ， Ｓｈａｇｈａｓｉ Ｔ， Ａｂｂａｔｅ Ｅ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ
ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ６１ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，７７（１９）：７００７⁃７０１５􀆰
［２３］ 　 Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｃ Ｍ， Ｂｅｅｓｏｎ ＩＶ Ｗ Ｔ， Ｃａｔｅ Ｊ Ｈ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ａ ｃｏｐｐｅｒ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａ［Ｊ］ ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２０１１，６（１２）：１３９９⁃１４０６􀆰
［２４］ 　 Ｂｅｙ Ｍ，Ｂｅｒｒｉｎ Ｊ Ｇ，Ｐｏｉｄｅｖｉｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［ Ｊ］ ．Ｍｉｃｒｏｂ
Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１１，１０（１）：１１３⁃１２８􀆰
［２５］ 　 Ｊäｇｅｒ Ｇ，Ｇｉｒｆｏｇｌｉｏ Ｍ，Ｄｏｌｌｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｈｏｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ
ｆｒｏｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ａｆｆｅｃｔｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ
ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｔｈｅｉｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２０１１，４（１）：
３３⁃４９􀆰
［２６］ 　 Ｗａｎｇ Ｙ，Ｔａｎｇ Ｒ，Ｔａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ⁃
ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１１，９１（５）：１３５３⁃１３６３􀆰
［２７］ 　 Ｃａｎｔａｒｅｌ Ｂ Ｌ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ Ｐ Ｍ，Ｒａｎｃｕｒｅｌ Ｃ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃
ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ （ ＣＡＺｙ ）： ａｎ ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ
ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］ ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００９，３７（Ｓ１）：２３３⁃２３８􀆰
［２８］ 　 Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ Ａ， Ｄｒｕｌａ Ｅ， Ｌｏｍｂａｒｄ Ｖ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＺｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｔｏ ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ａｕｘｉｌｉａｒｙ
ｒｅｄｏｘ ｅｎｚｙｍｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ， ２０１３， ｄｏｉ： １０􀆰 １１８６ ／
１７５４⁃６８３４⁃６⁃４１􀆰
［２９］ 　 Ｙｉｎ Ｙ， Ｍａｏ Ｘ， Ｙａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ􀆰 ｄｂＣＡＮ： ａ ｗｅｂ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ
ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１２，４０（Ｗ１）：４４５⁃４５１􀆰
［３０］ 　 Ａｓｐｅｂｏｒｇ Ｈ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ Ｐ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
ｆａｍｉｌｙ ５ （ＧＨ５）［Ｊ］ ．ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔ Ｂｉｏｌ，２０１２，１２（１）：１８６⁃２０２􀆰
［３１］ 　 Ｎａｕｍｏｆｆ Ｄ􀆰 Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ［Ｊ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃｏｗ），２０１１，７６（６）：６２２⁃６３５􀆰
［３２］ 　 Ｂｕｓｋ Ｐ Ｋ，Ｌａｎｇｅ Ｌ􀆰 Ｆｕｎｃｔｉｏｎ⁃ｂａｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃
ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ，ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ
［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１３，７９（１１）：３３８０⁃３３９１􀆰
［３３］ 　 Ｈａｎ Ｑ， Ｌｉｕ Ｎ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ＧＨ１０ ｘｙｌａｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｅｒｍｉｔｅ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａ
ｒｅｖｅａｌ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｉｇ⁃ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ［Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２０１３， １１０ （ １２ ）：
３０９３⁃３１０３􀆰
［３４］ 　 Ｕ􀆰 Ｓ􀆰 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ􀆰 Ｇｅｎｏｍｅｓ ＯｎＬｉｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ［ ＥＢ ／
０７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
ＯＬ］ 􀆰 ［ ２０１３⁃１１⁃１５］ 􀆰 ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ􀆰 ｇｅｎｏｍｅｓｏｎｌｉｎｅ􀆰 ｏｒｇ ／ ｃｇｉ⁃ｂｉｎ ／
ＧＯＬＤ ／ ｉｎｄｅｘ􀆰 ｃｇｉ􀆰
［３５］ 　 Ｐａｇａｎｉ Ｉ， Ｌｉｏｌｉｏｓ Ｋ， Ｊａｎｓｓｏｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ ＯｎＬｉｎｅ
Ｄａｔａｂａｓｅ （ ＧＯＬＤ） ｖ􀆰 ４： ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ
ｐｒｏｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｔａｄａｔａ［Ｊ］ ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，
２０１２，４０（Ｄ１）：５７１⁃５７９􀆰
［３６］ 　 Ｒｕｂｉｎ Ｅ Ｍ􀆰 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｂｉｏｆｕｅｌｓ［Ｊ］ ．Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５４
（７２０６）：８４１⁃８４５􀆰
［３７］ 　 Ｍｅｄｉｅ Ｆ Ｍ， Ｄａｖｉｅｓ Ｇ Ｊ， Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ Ｍ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ
ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ［Ｊ］ ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１２，１０（３）：２２７⁃２３４􀆰
［３８］ 　 Ｈｅｓｓ Ｍ， Ｓｃｚｙｒｂａ Ａ， Ｅｇａｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ
ｂｉｏｍａｓｓ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｗ ｒｕｍｅｎ ［ Ｊ ］ ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，３３１（６０１６）：４６３⁃４６７􀆰
［３９］ 　 Ｄｕａｎ Ｃ Ｊ， Ｆｅｎｇ Ｊ Ｘ􀆰 Ｍｉｎｉｎｇ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
ｇｅｎｅｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１０，３２（１２）：１７６５⁃１７７５􀆰
［４０］ 　 Ｌｉｕ Ｎ， Ｙａｎ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｏｆ ｆｕｎｇｕｓ⁃ｇｒｏｗｉｎｇ
ｔｅｒｍｉｔｅｓ：ａ ｎｅｗ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｆｏｒ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１１，７７（１）：４８⁃５６􀆰
［４１］ 　 Ｗａｎｇ Ｑ，Ｑｉａｎ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｘ Ｚ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ
ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ β⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｅｒｍｉｔｅ
ｇｕｔ［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，５１（６⁃７）：３１９⁃３２４􀆰
［４２］ 　 Ｇｅｎｇ Ａ，Ｚｏｕ Ｇ，Ｙａｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｅｘｏ２ｂ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ
ｉｍｐｒｏｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ［Ｊ］ ． Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，９６（４）：９５１⁃９６２􀆰
［４３］ 　 Ｙａｎ Ｘ，Ｇｅｎｇ Ａ，Ｚｈａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ （ ｈｅｍｉ⁃） ｃｅｌｌｕｌａｓｅ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｒｏｍ ａ ｂｉｏｇａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｒ ｕｓｉｎｇ ４５４
ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１３， ９７ （ １８）：
８１７３⁃８１８２􀆰
［４４］ 　 Ｚｏｕ Ｇ，Ｓｈｉ Ｓ， Ｊｉａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｈｙｐｅｒ⁃
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］ ． Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ， ２０１２， ｄｏｉ： １０􀆰 １１８６ ／ １４７５⁃
２８５９⁃１１⁃２１􀆰
［４５］ 　 Ｇａｂｏｒ Ｅ Ｍ， Ａｌｋｅｍａ Ｗ Ｂ， Ｊａｎｓｓｅｎ Ｄ Ｂ􀆰 Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ
ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］ ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，６（９）：８７９⁃８８６􀆰
［４６］ 　 Ａａｋｖｉｋ Ｔ，Ｄｅｇｎｅｓ Ｋ Ｆ，Ｄａｈｌｓｒｕｄ Ｒ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ａ ｐｌａｓｍｉｄ ＲＫ２⁃ｂａｓｅｄ
ｂｒｏａｄ⁃ｈｏｓｔ⁃ｒａｎｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ
ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ［ Ｊ］ ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｌｅｔｔ，２００９，２９６（２）：１４９⁃１５８􀆰
［４７］ 　 Ｌｕｂｅｒｔｏｚｚｉ Ｄ，Ｋｅａｓｌｉｎｇ Ｊ Ｄ􀆰 Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｓ ａ ｈｏｓｔ ｆｏｒ
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ， ２００９， ２７ （ １ ）：
５３⁃７５􀆰
［４８］ 　 Ｂｏｕｗｓ Ｈ， Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ Ａ， Ｚｏｒｎ Ｈ􀆰 Ｆｕｎｇａｌ ｓｅｃｒｅｔｏｍｅｓ： ｎａｔｕｒｅ ＇ ｓ
ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｗｈｉｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２００８，８０（３）：３８１⁃３８８􀆰
［４９］ 　 Ｕｚｂａｓ Ｆ， Ｓｅｚｅｒｍａｎ Ｕ，Ｈａｒｔｌ Ｌ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ⁃ｆｒｅｅ
ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１２， ９３ （ ４ ）：
１６０１⁃１６０８􀆰
［５０］ 　 Ｌｉ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｏｎｇ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ［ Ｊ］ ．
Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１２，ｄｏｉ：１０􀆰 １１８６ ／ １４７５⁃２８５９⁃１１⁃８４􀆰
［５１］ 　 Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｋ Ｋ，Ｖａｇｏ Ｒ，Ｃａｌａｎｃａ Ｖ， ｅｔ ａｌ􀆰 ＥＤＥＭ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ
ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ
［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９（４３）：４４６００⁃４４６０５􀆰
［５２］ 　 ｔｅ Ｂｉｅｓｅｂｅｋｅ Ｒ， ｖａｎ Ｂｉｅｚｅｎ Ｎ， ｄｅ Ｖｏｓ Ｗ Ｍ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｉｎ ｓｏｌｉｄ⁃ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００５， ６７ （ １ ）：
７５⁃８２􀆰
［５３］ 　 Ｗｅｉ Ｗ，Ｃｈｅｎ Ｌ，Ｚｏｕ Ｇ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｎ⁃ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒ
ｆｏｌｄｉｎｇ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｇａｌ β ‐
ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１３，１１０（１２）：３０７５⁃３０８４􀆰
［５４］ 　 Ｍｏｒａｌｅｊｏ Ｆ Ｊ， Ｃａｒｄｏｚａ Ｒ Ｅ， Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｓ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｔｈａｕｍａｔｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ
ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｇｅｎｅ ｄｏｓａｇｅ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ
Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５（３）：１１６８⁃１１７４􀆰
［５５］ 　 Ｄｕｎｃａｎ Ｓ， Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｊ􀆰 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｒａｔｉｏｓ
ｄｕｒｉｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｏｄｙ ａｎｄ ｎｏｎ⁃ｗｏｏｄｙ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈ，２０１０，４７（７）：３６３⁃３７１􀆰
［５６］ 　 Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｒ， Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ Ｈ􀆰 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＲＵＴ⁃Ｃ３０： ｔｈｉｒｔｙ
ｙｅａｒｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ［ Ｊ］ ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１２， １５８ （ １）：
５８⁃６８􀆰
［５７］ 　 Ｍａ Ｘ Ｓ，Ｚｏｔｔｅｒ Ｓ，Ｋｏｆｌｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ
ｐｈｏｔｏｎｓ ｖｉａ ａｃｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ｐｈｙｓ Ｒｅｖ Ａ， ２０１１， ｄｏｉ：
１０􀆰 １１０３ ／ ＰｈｙｓＲｅｖＡ􀆰 ８３􀆰 ０４３８１４􀆰
［５８］ 　 Ｄｅｌ Ｐｏｚｏ Ｍ Ｖ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ⁃Ａｒｒｏｊｏ Ｌ， Ｇｉｌ⁃Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｊ， ｅｔ
ａｌ􀆰 Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ β⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｗ ｒｕｍｅｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ｅｎｈａｎｃｅ
ｔｈｅ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２０１２，ｄｏｉ：
１０􀆰 １１８６ ／ １７５４⁃６８３４⁃５⁃７３􀆰
［５９］ 　 Ｇａｏ Ｄ，Ｕｐｐｕｇｕｎｄｌａ Ｎ，Ｃｈｕｎｄａｗａｔ Ｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ
ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ
ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２０１１，ｄｏｉ：
１０􀆰 １１８６ ／ １７５４⁃６８３４⁃４⁃５􀆰
［６０］ 　 Ｍｂａ Ｍｅｄｉｅ Ｆ，Ｄａｖｉｅｓ Ｇ Ｊ，Ｄｒａｎｃｏｕｒｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ
ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ［Ｊ］ ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１２，１０（３）：２２７⁃２３４􀆰
［６１］ 　 Ｖａａｊｅ⁃Ｋｏｌｓｔａｄ Ｇ， Ｗｅｓｔｅｒｅｎｇ Ｂ， Ｈｏｒｎ Ｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ａｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ
ｅｎｚｙｍｅ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ［Ｊ］ ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３３０（６００１）：２１９⁃２２２􀆰
［６２］ 　 Ｈａｒｒｉｓ Ｐ Ｖ， Ｗｅｌｎｅｒ Ｄ， ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｋ Ｃ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｂｉｏｍａｓｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ
ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ６１：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ，ｅｎｉｇｍａｔｉｃ
ｆａｍｉｌｙ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４９（１５）：３３０５⁃３３１６􀆰
［６３］ 　 Ｓｅｏ Ｓ Ｗ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｍｉｎ Ｂ Ｅ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ
ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ ｆｕｅｌｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ａｄｖ，２０１３，３１（６）：８１１⁃８１７􀆰
（责任编辑　 管珺）
１７　 第 １期 邹　 根等：木质纤维素酶基因资源挖掘及真菌酶系改造