全 文 ：第 35 卷第 6 期
2015年 3月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.6
Mar.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金(31172119, 31372220); 山东省自然科学基金(ZR2011CM009, ZR2010CL014); 高等学校博士学科点专项基金(博
导类)(20113705110001)
收稿日期:2013鄄05鄄22; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄04鄄25
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zhanghonghai67@ 126.com
DOI: 10.5846 / stxb201305221141
张洪海,窦海龙,陈磊,沙未来,赵俊杰.中国狼不同地理种群遗传多样性及系统进化分析.生态学报,2015,35(6):1869鄄1881.
Zhang H H, Dou H L, Chen L, Sha W L, Zhao J J.Genetic diversity and phylogenetic analysis of wolves from different geographical regions of China.Acta
Ecologica Sinica,2015,35(6):1869鄄1881.
中国狼不同地理种群遗传多样性及系统进化分析
张洪海1,*,窦海龙1,2,陈摇 磊1,沙未来1,赵俊杰1
1 曲阜师范大学生命科学学院, 曲阜摇 273165
2 北京师范大学生命科学学院, 北京摇 100875
摘要:为了解中国狼不同地理种群遗传多样性及系统发育情况,从中国境内狼的主要分布区青海、新疆、内蒙古和吉林 4个地区
采集样品,用分子生物学技术手段成功地获得 44个个体线粒体 DNA控制区第一高变区(HVR 玉)序列和 40个线粒体 Cyt b部
分序列。 线粒体控制区 HVR 玉共检测到 51个变异位点,位点变异率为 8.76%;线粒体 Cyt b部分序列发现 31 个变异位点,位
点变异率为 5.33%,未见插入及缺失现象,变异类型全部为碱基置换。 共定义了 16个线粒体 HVR 玉单倍型,其中吉林与内蒙
种群存在共享单倍型,估计这两地间种群亲缘关系较近。 4 个地理种群中新疆种群拥有较高的遗传多样性(0.94)。 中国狼种
群总体平均核苷酸多态性为 2.27%,与世界其他国家地区相比,中国狼种群拥有相对较高的遗传多样性。 通过线粒体 HVR 玉
单倍型构建的系统进化树可以看出,中国狼在进化上分为 2大支,其中位于青藏高原的青海种群独立为一支,推测其可能长期
作为独立种群进化。 基于青海种群与新疆,内蒙种群的线粒体 Cyt b遗传距离,推测中国狼 2 个世系可能在更新世冰川时期青
藏高原受地质作用急速隆起后出现分歧,分歧时间大约在 1.1 MY前。
关键词:狼; 中国; 遗传多样性; 系统进化
Genetic diversity and phylogenetic analysis of wolves from different geographical
regions of China
ZHANG Honghai1,*, DOU Hailong1,2, CHEN Lei1, SHA Weilai1, ZHAO Junjie1
1 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China
2 College of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 100875, China
Abstract: Wolves were once widely distributed throughout China. The number of Chinese wolves has drastically declined in
recent years as a result of environmental destruction and habitat loss. At present, wolves in China are mainly distributed in
sparsely populated western and northern regions of the country. To protect this species, an understanding of genetic diversity
and phylogenetic relationships of wolf populations in China is necessary. In this study, we analyzed the partial mitochondrial
DNA (mtDNA) D鄄loop region and the Cyt b ( Cytochrome b) gene of wolves originating from four distinct geographical
populations in Xinjiang, Qinghai, Inner Mongolia, and Jilin. Using standard molecular biology techniques, we generated
sequences of the mtDNA control region hypervariable region I (HVR I) from 44 wolves, and sequences of the Cyt b gene
from 40 wolves. The resulting 582鄄bp HVR I sequence alignment contained 51 variable sites, which corresponded to 8.76%
polymorphic loci. Similarly, 31 variable sites, all base substitutions, were identified in the aligned Cyt b sequence data set.
We detected 16 haplotypes among the 44 HVR I gene sequences. The Inner Mongolian population and the population from
Jilin were found to share the same HVR I haplotype. When this data set was combined with previously generated Chinese
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wolf sequences available in Genbank, a total of 28 haplotypes from approximately 91 Chinese wolves were identified. To
explore the genetic diversity of these geographic populations, we calculated nucleotide diversity and haplotype diversity from
the HVR I sequences. The population from XinJiang was found to have the highest genetic diversity. When we compared
these results with previously reported nucleotide diversities of wolves from other countries and regions, we found that
Chinese wolves had the highest nucleotide diversity. In the phylogenetic tree generated using the HVR I haplotypes, Chinese
wolves are primarily divided into two lineages. The first lineage comprises haplotypes of wolf populations from the Qinghai鄄
Tibet Plateau and surrounding areas. There is no obvious relationship with geographical structure among the remaining wolf
haplotype groups. Considering their high level of genetic diversity and restricted geographic distribution, we speculate that
the Qinghai鄄Tibet Plateau populations have evolved in isolation over a long period of time. To investigate the phylogenetic
position of Chinese wolves, we downloaded 123 mtDNA partial control region sequences from Genbank, which were
obtained from wolves primarily distributed in Eurasia and North America. In the phylogenetic tree generated from these
sequences, wolf populations from the Qinghai鄄Tibet Plateau are clearly separated from wolves from other regions of China.
The results of this phylogenetic analysis suggest that wolf populations in the Qinghai鄄Tibet Plateau of China comprise an
ancient lineage that is still extant in these higher elevation regions. Based on genetic distances calculated using Cty b
sequence data, we estimate that the two lineages diverged about 1.1 million years ago, corresponding to the time period
during which the Qinghai鄄Tibet Plateau was suddenly uplifted by geological processes. Based on these results, we propose
that the wolves of the Qinghai鄄Tibet Plateau and the widespread wolf Canis lupus chanco are not the same subspecies.
Key Words: wolf; China; genetic diversity; evolution
灰狼简称狼,属于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬属(Canis),由于狼食谱宽、适应性强,曾在地球
上广泛分布[1]。 狼在我国曾一度分布于除海南省、南中国海诸岛屿以及台湾省外的广大地区,但由于人为捕
杀和生境破坏,现仅集中分布于人口较为稀少的内蒙古、新疆、青海、西藏等地区[2]。 我国关于狼的研究主要
集中在宏观生态学方面,关于狼种群遗传多样性及系统分类地位的研究非常少,并且在狼亚种的划分上还存
在着众多争议:很多学者认为中国狼或蒙古狼(Canis lupus Chanco)与欧亚狼(Canis lupus Lupus)是同一个亚
种[3];中国动物志引述 Pocock 等和 Ellerman 等的研究结论认为分布于中国境内的狼仅有蒙古狼(C. l.
chanco)一个亚种[4鄄5];王秀辉应用 RAPAD方法将中国狼划分为 5 个亚种:云贵和东南集群亚种,东北河北群
体亚种、甘肃群体亚种、内蒙古群体亚种和新疆群体亚种[6];罗理杨等通过测定中国各个地区狼线粒体控制
区部分序列得出分布于青海、西藏、云南的狼种群属于西南种群亚种,东北种群与华北种群作为一个亚种,内
蒙古及新疆种群归属不能确定[7]。 国内对狼遗传多样性的研究未见报道,这对于野生狼种群的管理及保护
非常不利。
线粒体 DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)不会发生遗传重组,较核 DNA有更高的突变率,因此被公认为
用来作为研究动物遗传进化的标记物质[8]。 线粒体细胞色素 b(Cytochrome b, Cyt b)基因全长大约在 1100—
1200 bp之间,并且不同物种间序列长度差异较大,但是在核苷酸组成上却具有偏好性。 由于 Cyt b 基因中含
有突变和保守区,并且存在较慢和较快的进化的密码子位点,所以 Cyt b基因是对动物系统进化研究的较好的
分子标记。 犬科动物线粒体控制区(Control region displacement loop, D鄄loop)全长 1240—1360 bp,其中存在 3
个保守序列框(Conserved sequence block):CSB 玉、CSB 域和 CSB 芋[9]。 起始位点位于 CSB 玉区 5忆端的第一
高变区(Hypervariable region, HVR 玉)序列变异速率较快,常被用来进行种群遗传结构及系统地理分析[10]。
近些年来,保护生物学研究已经深入到分子水平,要求使用分子实验技术从大量动物样本中提取 DNA以获取
动物的遗传信息。 在采集分析样品的过程中,传统的取样方法(通过杀死动物来获取新鲜的组织或捕获动物
抽取血液)对于野外动物种群特别是濒危珍稀动物种群较难实现。 因此本研究采集了来自青海、新疆及内
蒙、吉林 4个地区 55个样品,且多数样品采用非损伤取样的方法获得。 通过分子生物学手段成功获得 44 个
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个体线粒体 D鄄Loop区 HVR 玉序列和 40 个线粒体 Cyt b 部分序列,对其进行遗传学分析,探讨各地种群遗传
多样性高低并分析其系统进化地位。
1摇 材料与方法
1.1摇 样品采集
本研究于 2011 年 12 月至 2012 年 6 月分别在青新疆阿勒泰地区、内蒙古西旗、内蒙古达赉湖自然保护
区、吉林图门市共采集样品 55份,且样品多数来自于野外捕捉的圈养狼(样本详细资料见表 1)。 所有粪便样
品一律置于-20 益冰箱中保存,肌肉组织置于-80 益冰箱中保存,采集皮毛组织均为自然风干后置于常温干
燥环境下保存,血液样品加入抗凝剂后使用生物低温采样箱运送至实验室-80益冰箱中保存。
表 1摇 狼样品基本信息表
Table 1摇 Basic information of all the wolves samples
地理种群
Geographic group
样品来源地
Sample origin site
样品采集地
Sample collecting site
样品数
Sample number
样品类型
Sample type
青海种群 青海刚察 中国科学院西高所 6 皮毛
Qinghai population 青海湖区 青海动物园 10 粪便
新疆种群 新疆阿勒泰地区 新疆青河县富疆狼园 8 粪便
Xinjiang population 新疆青河县 新疆青河县富疆狼园 3 血液
内蒙种群 内蒙达赉湖自然保护区 内蒙达赉湖自然保护区 3 肌肉组织
Inner mongolia population 内蒙西旗 哈尔滨野狼湖狼园 3 粪便
吉林种群 内蒙呼伦贝尔 内蒙呼伦贝尔 20 粪便
Jilin population 吉林图门市 哈尔滨野狼湖狼园 2 粪便
总计 Total 55
1.2摇 实验方法
1.2.1摇 样品 DNA的提取
由于在分子生物学研究中,应用毛皮或者粪便样品为 DNA 来源时,获得的 DNA 含量相对于其他组织样
品较低,可能会对后续实验造成影响以致无法获得准确的结果,因此针对这种情况,本研究采用重复提取的方
法,对同一样品分别独立操作两次,获得的 DNA分别置于-20益冰箱保存并用于后续实验。 粪便中总 DNA的
提取使用粪便提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit,USA)。 血液,毛皮及肌肉组织 DNA 的提取使用血液
及组织提取试剂盒(QIAamp DNeasy Blood & Tissue Kit,USA)。
1.2.2摇 PCR扩增
狼线粒体控制区 HVR 玉引物采用犬科动物 mtDNA D鄄loop 第一高变区的序列长度为 582 bp 通用引
物对[11]:
L15404: 5忆鄄CTCTTGCTCCACCATCAGC鄄3忆
H16118: 5忆 鄄AAACTATATGTCCTGAAACC鄄3忆
根据 Cyt b内部的保守位点,选择性的扩增了位于细胞色素 b 后半部分长度大约 767 bp 的序列,其下游
包含一段 tRNApro序列。 引物设计使用软件 Primer 5.0及 Oligo 7.5。 所得引物序列为:
L14666:5忆 鄄AGAGTGAATCTGAGGCGGCTT鄄3忆
H15432:5忆 鄄GCTTTGGGTGCTGATGGTGG鄄3忆
狼控制区 HVR玉和 Cyt b 区 PCR反应体系相同: Taq 酶 0.25 滋L (Takara),10 伊 buffer 4 滋L,10 mmol /
LdNTPs (Takara)3 滋L,前 /后引物各 0.8 滋L, BSA (Takara)0.25 滋L,以及模板 DNA 1 滋L,加灭菌超纯水至
50 滋L。
狼控制区第一高变区(HVR 玉)PCR 反应条件为:94 益 预变性 4 min; 接下来 40 个循环(94 益 30 s,53
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益 45 s,72益 45 s),最后 72 益 延伸 5 min。 Cyt b区 PCR反应条件为:94 益 预变性 4 min, 接下来 40个循环
(94 益 30 s,57 益 45 s,72 益 45 s),最后 72 益 延伸 5 min。
1.2.3摇 PCR产物的回收及测序
PCR产物采用 1.0%的常规琼脂糖凝胶电泳检测,上样量为 5 滋L PCR 产物加 1 滋L 6伊Loading Buffer
(Takara),100 V电压电泳 30 min,凝胶经 EB 染色后置于紫外下观察将目的条带切下,用凝胶回收试剂盒
(QIAquick Gel Extraction Kit,USA)回收纯化后送至北京三博远志测序公司进行测序。
1.2.4摇 序列分析
测序所得序列结果在 Genbank 上经 Blast比对后确定序列来源于狼。 用 Clustal X软件进行 DNA序列排
列[12],并辅以人工校对,以去掉扩增的 Cyt b序列中所包含的线粒体 tRNApro序列。 基于 Kimura双参数距离模
型(Kimura鄄2鄄Parameter,K2P),通过 MEGA 5.0计算各地理种群狼控制区 HVR 玉和 Cyt b序列变异碱基比例、
变异类型、转换和颠换比(R)及遗传距离等基础数据[13]。 基于狼 Cyt b 序列,利用遗传距离和分子钟的分歧
时间计算公式为 t =D / 2a( t 为分歧时间,D 为遗传距离,a 为分子钟)并结合已经校正的哺乳动物细胞色素 b
序列的每百万年 2%分子钟来计算中国各地计算各地理种群进化分歧时间[14鄄15]。 基于狼控制区 HVR 玉序列
用 DnaSP 5.0[16]软件划分单倍型,将单倍型序列上传至 Genbank,单倍型序列登陆号见表 4,并计算核苷酸多
样性(Nucleotide diversity,Pi)和单倍型多样性 (Haplotype diversity, Hd),进而推算各地种群遗传多样性高低。
为了研究中国各地狼的系统发育,结合本研究中发现的中国狼线粒体 HVR玉单倍型及从 Genbank 中下载已
有中国狼研究中 20 个 mtDNA 控制区序列,然后重新划分单倍型,用邻接法 ( Neighbour鄄joining,NJ)以
Genbank下载的郊狼线粒体控制区序列(Canis latrans, Genank登录号:NC_008093)为外群构建单倍型的系统
发生树,其中各节点的支持率根据各序列 bootstrap[17]1000次重抽样后数据计算。 根据单倍型变异位点,应用
软件 Network 4.610 ( http: / / www. fluxus鄄engineering. com / sharenet. htm)构建基于 Median鄄Joining 法简约网络
(Statistical parsimony network)关系图,以期与已有研究进行比较。 为了解中国狼在世界范围内的系统进化地
位,下载了 123个世界各地狼线粒体控制区单倍型(附表),并以 8 个郊狼单倍型序列(附表)为外群使用 NJ
法构建系统发育树。
2摇 结果
图 1摇 中国部分地区狼线粒体第一高变区多态位点分布图
Fig.1摇 Variable sites distribution of HVR 玉 in mtDNA of China Wolf
2.1摇 线粒体控制区 HVR玉基因序列及其变异
实验获得 44个中国狼线粒体控制区第一高变区 583 bp序列,其中内蒙西旗,内蒙达赉湖自然保护区,青
海湖区,青海刚察,新疆青河县样品全部扩增测序成功(表 2)。 通过比对 44 个线粒体控制区 HVR 玉序列发
现共有变异位点 51个,占分析序列长度的 8.76%,插入缺失位点 11 个,碱基替换位点 40 个(图 1)。 研究表
明,通过扩增总 DNA的方法有可能扩增出核基因组中线粒体基因插入拷贝[18鄄20],即线粒体假基因(Numts)。
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由于线粒体假基因和线粒体基因分歧度较大,这时应考虑青海种群是否存在这样的假基因。 将青海种群线粒
体控制区 HVR 玉基因分别与 Genbank中下载先前研究的中国青海狼序列(FJ032363)以及中国内蒙狼序列
(GQ374438)比对,发现青海狼与中国西藏狼序列相似度超过 97.5%,而与中国内蒙狼序列比对结果与表 4 结
果相符,证明青海种群确实与其他种群存在较大的分歧。 其中转换 /颠换之比 R 为 5.71,说明序列突变未达
到饱和状态[21]。
各地区种群的线粒体控制区 HVR 玉基因碱基组成分析:A,T,C,G 平均含量分别是 26.29%、30.24%、
16郾 62%和 26.85%,其中 A+T含量为 56.53%,符合脊椎动物线粒体基因组成特点,低于犬科动物线粒体全序
列 A+T含量(60.3%—60.5%) [22],表明 HVR 玉相对于其他保守的线粒体基因组区段来说较易突变。
表 2摇 狼样品测序结果信息表
Table 2摇 The wolf sample sequencing results table
地理种群
Geographic group
样品来源地
Sample origin site
编号
Number
样品数
Sample number
测序成功样品数
Successful sequencing sample No.
细胞色素 b
Cytochrome b
控制区高变区
Hypervariable region
青海种群 青海刚察 G 6 5 6
Qinghai population 青海湖区 HQ 10 7 10
新疆种群 新疆阿勒泰地区 A 8 7 7
Xinjiang population 新疆青河县 Q 3 3 3
内蒙种群 内蒙达赉湖自然保护区 D 3 2 3
Inner mongolia population 内蒙西旗 X 3 2 2
内蒙呼伦贝尔 H 22 13 12
吉林种群 Jilin population 吉林图门市 T 2 1 1
总计 Total 8 55 40 44
2.2摇 线粒体 Cyt b基因序列及其变异
实验共获得 40个狼线粒体 Cyt b序列(表 2)。 将扩增测序所得到 40条的长度为 767 bp的序列经 Clustal
X[2]比对去掉含有的 tRNApro序列后得到 582 bp的 Cyt b部分序列。 经分析后发现,没有发现碱基插入及缺失
现象,表明这些 Cyt b序列来自于线粒体,而不是核基因中的线粒体假基因[23]。 使用 MEGA 5.0 分析这 40 条
Cyt b序列发现其碱基组成为:T 29.0%、C 29.6%、A 29.9%、G 11.6%。 582 个碱基位点中共发现变异位点 31
个,占分析序列的 5.33%,且变异位点全部为简约信息位点,未发现单核苷酸变异位点。 40 个个体总的转换
颠换比(R)为 28.68,各地理种群转换颠换比均大于 2.0,与动物线粒体碱基替换模式结论相符[18]。 狼 Cyt b
部分序列 G+C含量为 41.2%,与脊椎动物基因序列 G+C含量在 40%—50%之间的结论相符[24]。 密码子第一
位点 G+C含量(50.2%)明显高于第二位点(40.2%)和第三位点(38.2%)的含量,表明密码子第二三位点开始
倾向于富含 AT(表 3)。
表 3摇 狼 Cyt b部分序列基因密码子同位点的碱基组成平均值 / %
Table 3摇 Base compositions averagement for Cyt b partial sequenees of Wolf in the 1st,2nd,3rd position of the genetic codons
碱基类型
Base type
全序列
Complete sequence
第一位点
The 1st position
第二位点
The 2nd position
第三位点
The 3rd position
胸腺嘧啶(Thymine,T) 29.0 22.0 44.0 21.0
胞嘧啶(Cytosine,C) 29.6 29.7 24.2 34.7
腺嘌呤(Adenine,A) 29.9 28.0 21.1 40.5
鸟嘌呤(Guanine,G) 11.6 20.5 10.8 3.5
2.3摇 基于线粒体控制区 HVR 玉中国部分地区狼遗传多样性分析
使用软件 DnaSP 5.0 对 44 个成功获得目的个体样本片段序列进行分析,共确定 16 个单倍型,其中青海
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种群内部青海刚察与青海湖区种群共享 3个单倍型(QH2,QH3,QH4),新疆种群内部新疆阿勒泰地区及青河
县种群共享 1个单倍型 XJ2,内蒙种群内部内蒙达赖湖自然保护区,西旗及呼伦贝尔种群共享 2 个单倍型
NM2和 NM4,吉林图门与内蒙呼伦贝尔种群共享 1个单倍型 NM3(表 4)。 吉林图门与内蒙呼伦贝尔种群之
间共享 1个单倍群,说明两个种群之间表现为共同的母系来源或存在基因交流。
表 4摇 线粒体控制区 HVR玉单倍型及变异位点信息
Table 4摇 Haplotypes and variable sites within the HVR 玉 of mitochondrial control region
单倍型
Haplotypes
多态位点
摇 摇 摇 摇 摇 摇 11111111摇 1111111133摇 3333334445
2334555568摇 9903356666摇 7778889912摇 4556685894
3077067898摇 3605853458摇 0253684564摇 3080545686
个体数
Individuals
Genbank登录号
Genbank
Accession No.
编号
No.
NM1 ACTGTGGTTG TATTCTTCTT ATCTAACGAC H10 KC414564 W1
NM2 CCTACTCTTA H1—H4,H6,H7,H11,H12,X1,D1, KC414565 W2
NM3 .......... .G........ ........G. .........G D3 KC414566 W3
NM4 .......... .C........ ........G. .........G H5,T KC414567 W4
NM5 ........C. .......... G......... T....C..CG H8,X2,D2 KC414568 W5
QH1 T......... .G........ ........G. .........G H9 KC414569 W6
QH2 GT....AG.. ..CCTCCTCC .C.C....GT ...G.CTGC. G1 KC414570 W7
QH3 GT...AAG.. ..CCTCCTCC .C.C....GT ...G..T.C. G2,HQ9 KC414571 W8
QH4 GT....AG.. ..CCTCCTCC .C.C....GT ...G.CT.C. G3,G5,G6,HQ4,HQ6,HQ7 KC414572 W9
QH5 GT....AG.. .GCCTCCTCC .C.CG...GT ...G.CT.C. G4,HQ2,HQ10 KC414573 W10
QH6 GT....AG.. .GCCTCCTCC .C.CGGT.GT ...G.CT.C. HQ1 KC414574 W11
QH7 GT....AG.. ..CCTCCTCC .C.CG...GT .T.G.CT.C. HQ3 KC414575 W12
QH8 GTGA..AA.C A.CCTCCTCC .C.CT...GT ...G.CT.C. HQ5 KC414576 W13
XJ1 GT....AG.. ..CCTCCTCC .C.C....GT .T.G.CT.C. HQ8 KC414577 W14
XJ2 .......... .G........ ....G..A.. .......... A1,A2,A3,A7 KC414578 W15
XJ3 .......... .......... ..T.G..A.. ..C.TCT.CG A4,A6,Q1,Q2,Q3 KC414579 W16
....C...C. .......... G......... T....C..CG A5
由于吉林图门种群数量小于 3,不符合 Tajima 检验[25]要求至少 3条同源原序列的要求,所以选取符合条
件的青海,内蒙和新疆种群进行遗传多样性分析。 使用 DnaSP 5.0软件对分布在中国青海、内蒙、新疆 3 个种
群 44个个体测得的线粒体控制区 HVR 玉进行遗传分析后得出,中国种群单倍型多态性 Hd 为 0.897,核苷酸
多态性 Pi为 0.02278。 新疆种群的核苷酸多样性为 0.942,明显的高于另外两个种群,说明新疆种群遗传多样
性较高,遗传资源丰富。 通过 Tajima忆s D 和 Fu and Li忆s D 值检测结果无显著差异(P>0.10)表明这 3 个中国
狼种群相对于中性进化的歧异度没有明显的偏离(表 5)。
表 5摇 中国狼 3个地理种群 43个粪便样品线粒体 DNA HVR 玉遗传多样性分析
Table 5摇 Analysis of the genetic diversity of mitochondrial DNA HVR 玉 for 42 individuals in three populations of Chinese wolves
地理种群
Geographic group
个体数
Number
单倍型多样性
Haplotype
diversity
(Hd)
核苷酸多样性
Nucleotide
diversity
(Pi)
核苷酸差异多样性
Average number
of nucleotide
differences(K)
Tajima 检验
Tajima忆s D
Fu and Li 检验
Fu and Li忆s D
青海种群
Qinghai population 16 0.842依0.075 0.00453依0.00108 2.64167 -1.49407
* -1.70774*
新疆种群
Xinjiang population 10 0.644依0.101 0.00942依0.00177 5.55556 0.56153
* -0.13773*
内蒙种群
Inner mongolia population 17 0.647依0.120 0.00511依0.00150 3.01471 -0.27259
* 0.19016*
总体 Total 43 0.897依0.028 0.02278依0.00122 13.23699 1.05547* -0.29042*
摇 摇 * P >0.10无显著差异
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从 Genbank下载的中国各地区的基于线粒体控制区序列 20 个灰狼的线粒体控制区序列(附表)。 由于
下载的序列长度存在差异,所以我们将所有序列剪辑后得到长度为 582 bp 的线粒体控制区序列。 基于 582
bp的序列重新划分中国狼单倍型,发现 28个单倍型,并重新对其进行编号,其中 NM2(W2),NM4 (W4),QH2
(W7),QH3 (W8),QH4 (W9),XJ3 (W16)与以前研究中发现的单倍型完全匹配(附表)。
图 2摇 基于中国狼 mtDNA控制区 28单倍型序列构建的 NJ树(a)和基于中国狼 mtDNA控制区 28单倍型序列构建的网络结构图(b)
Fig.2摇 Neighbor鄄joining tree of 28 mtDNA haplotypes based on mtDNA D鄄loop of China wolf ( a) and Network of 28 mtDNA haplotypes
based on mtDNA D-loop of China wolf (b)
圆圈代表的是单倍型,红点代表的是假定的中间单倍型, 线代表一个替位突变, 圈的大小与单倍型频率的大小成正比
2.4摇 分子系统树的构建
通过对 Genbank下载的 20条中国狼线粒体控制区序列与比研究发现的单倍型对后重新定义 28 个单倍
型。 通过比对后发现本研究发现的线粒体控制区单倍型与 Tsuda,K等[26]在蒙古乌兰巴托附近发现的狼单倍
型共享 3个单倍型,与罗理杨[7]等发现的单倍型共享 4 个单倍型(附表)。 使用 NJ 法构建 28 个中国狼单倍
型系统进化树(图 2),除青海种群外,其他地区或亚地区的的狼单倍型并没有聚集在一起,表明地区或亚地区
狼在遗传学方面没有独特的遗传结构[7]。 通过进化树不难看出,青海种群单倍型与除青藏高原外的单倍型
基于遗传距离分属两个不同的世系,这与罗理杨等所得的结果一致[7]。 把得到的 28 个中国狼单倍型与
Genbank上下载的 123 个灰狼单倍型序列构建 NJ 树发现,位于青藏高原及其周边地区的狼与喜马拉雅山脉
西侧的印度狼亲缘关系较近并为一支,而广布于中国其他地区的狼单倍型与欧亚狼亲缘关系较近,且没有表
现出明显的与地理分布有关的差异(图 3)。
2.5摇 分化时间估计
基于 Cyt b序列,利用已经校正的哺乳动物细胞色素 b序列的每百万年 2%分子钟来计算中国各地狼进化
分歧时间。 基于 Kimura双参数距离模型,计算中国各地狼的遗传距离,其中内蒙、新疆与吉林种群遗传距离
数值范围为 0.002—0.006 MYA Bp,其种群分歧时间大约为 0.05—0.15 MYA Bp。 青海狼与本研究其他地理种
群遗传距离较远,遗传距离为 0.043—0.048,由此得出青海种群与其他地理种群分歧时间大约在 1.08—1.2
MYA Bp,巧合的是这与青藏高原受地质作用的急速隆起时间(0.9—1.1 MY)相近[27]。
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图 3摇 基于从 Genbank下载的 225bp的线粒体控制区序列,使用 K2P碱基替换模型构建的环形 NJ树
Fig.3摇 Neighbor鄄joining original tree, computed using a nucleotide substitution model with Kimura 2 parameter distances, illustrating the
phylogenetic relationship among wolf 225bp mtDNA control region haplotypes registered in GenBank
红线表示中国狼单倍型,粉红线代表郊狼外群,绿线代表分布于印度 Canis.lupus.pallipes亚种
3摇 讨论
狼分布范围广,野外活体采样难度很大。 本文尝试从粪便中成功的提取总 DNA,为今后通过使用粪便样
品对狼进行遗传进化研究提供了依据。 本研究从 55 个样品中成功的提取和扩增出出 44 个个体的线粒体
HVR 玉和 40个 Cyt b序列,其中未成功提取出 DNA的样品全部为粪便样品,而且主要为内蒙呼伦贝尔地区
样品。 未提取出来的原因可能是采集的粪便样品时间过长,样品中的 DNA 降解或者粪便样品中含有可抑制
后续反应的酶[28]。
对种群进行遗传多样性评估,不仅有利于了解种群结构及动态,而且为制定种群保护和管理措施提供依
据。 通常考虑一个种群遗传多样的高低主要是通过对比种群内部单倍型间的遗传距离和核苷酸多态性,然而
由于核苷酸多态性充分考虑到了单倍型在种群内的比例,所以一般使用核苷酸多态性来衡量一个种群遗传多
样性的高低[29]。 本研究利用线粒体 HVR 玉序列对中国 4个地理狼种群进行遗传多样性检测,发现平均核苷
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酸多态性为 2.27%,与世界其他地区狼相比遗传多样性是较高的,如 Randi等[30]通过分析 mtDNA控制区序列
发现保加利亚狼核苷酸多样性为 0.26%,Pilot[31]等在东欧十多个国家采集到 643 只狼样品,并成功地鉴定出
21个线粒体 DNA单倍型,得出其核苷酸多样性为 1.7%,Tomislav等[32]分析了 91只狼的线粒体控制区序列得
出克罗地亚狼遗传多样性为 1.8%,从而说明中国狼相对于世界其他国家和地区来说线粒体 D-loop 区存在丰
富的多样性。
通过构建的中国狼分子系统发育树可以看出,青海种群与西藏狼明显的并为一支,而其他地区的狼则没
有按照地理区划分成不同的谱系,同时各个谱系间含有共同的单倍型,说明其遗传基础一致,存在着基因交
流,这与北美狼亚种分化的研究是一致的[33]。 t检验也显示了吉林,内蒙,新疆种群之间的遗传距离无显著差
异,而与青海种群差异明显。 其中青海种群拥有较多的单倍型,且通过世界狼系统进化树不难看出,青海种群
拥有的单倍型较为特殊,不与除青藏高原及周边地区外的中国其他地区的狼单倍型相似,而是与喜马拉雅山
山脉西部位于印度等国家地区的狼接近,通过青海种群的分布区域考虑,青海种群位于青藏高原东北部的青
海湖周边地区,北面为昆仑山和祁连山,东面为横断山脉,平均海拔在 3000m 以上,山地可以达到 4000m 以
上,这些天然的地理屏障阻碍了青海种群与青藏高原外的其他地理种群进行基因交流,长期的地理隔离造成
青海种群独立进化形成了隔离种群。 而青海种群与西藏狼,云南狼共享单倍型,说明了青海种群与西藏云南
种群在起源进化上关系比较近。
长久以来,研究认为中国狼只有一个亚种即 C.l.Chanco[4鄄5]。 Tsuda K 等[26]通过研究狼的 3 个亚种(C. l.
lupus,C. l. pallipes and C. l. Chanco) 发现中国狼(C. l. Chanco)的线粒体控制区变异较其他两个亚种较大,而
我们通过对比线粒体控制区部分序列发现,除青海地区序列与另外两个亚种序列差异较大外,其他地区种群
单倍型与另外两个亚种差别不大。 Ramesh K Aggarwal 等[34]利用 Tsuda K 等[26]从蒙古国乌兰巴托发现的狼
的线粒体单倍型与印度西部喜马拉雅山脉狼进行比较,得出印度西部喜马拉雅山脉狼是与蒙古狼是完全不同
的,并推测其是世界上最古老的狼世系,这与的研究结果一致。 基于线粒体 DNA的研究结果,Dinesh 等[35]认
为可以将位于印度喜马拉雅山脉附近狼种群从中国狼或蒙古狼亚种(C. l. Chanco)中剥离出来一起划归为西
藏亚种(C. l. langier)。 通过本文研究,并结合以前形态学及解剖学上的研究结果[36]推测青藏高原种群的狼
可能与印度喜马拉雅山附近的狼同属于西藏狼亚种(C. l. langier),当然这只是推测,具体的情况还需要从解
剖生理学,基因组学乃至古生物学的证据来证实。 同时通过构建的系统进化树(图 3)也能看到除青藏高原及
周边地区的狼外中国其他地区的狼单倍型广布于欧亚大陆乃至北美大陆狼分支中,说明这些地区的狼起源进
化关系较为复杂。
4摇 结论
基于线粒体控制区部分序列测定及分析,研究结果表明中国狼较世界其他国家地区拥有较高的遗传多样
性。 系统进化分析表明中国狼可以分为两个世系,且位于青藏高原及其周边地区的狼与中国其他地区的狼遗
传结构差异较大,且其遗传多样性较其他地区低。 推测其在进化上与中国其他地区狼较早出现分歧,并形成
独立进化种群。 利用线粒体 Cyt b部分序列推算各地理种群的进化分歧时间得出,位于青藏高原种群与其他
地理种群分歧时间大约在 1.1 MY前,与青藏高原受地质作用急速隆起时间相近。
致谢:中国科学院西北高原生物所、青海动物园、哈尔滨野狼湖狼园、新疆富疆狼园、内蒙古达赉湖自然保护区
提供研究样品,东北林业大学高中信教授、曲阜师范大学刘广帅同学为采集样品提供指导与帮助,特此致谢。
参考文献(References):
[ 1 ]摇 Wilson D E,Reeder D M. Mammal Species of the World(MSW): A Taxonomic and Geographic Reference. 3rd ed. Baltimore: Johns Hopkins
University Press, 2005.
[ 2 ] 摇 张洪海,张培玉,王振龙,车启来. 世界狼的分布、种群数量及保护现状.曲阜师范大学学报,1999,25(1):101鄄103.
7781摇 6期 摇 摇 摇 张洪海摇 等:中国狼不同地理种群遗传多样性及系统进化分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
[ 3 ]摇 Busch R H. The Wolf Almanac. New York: The Lyons Press:1993, 241鄄241.
[ 4 ] 摇 Ellerman J R, Morrison鄄Scott R C. S. Checklist of Palaearctic and Indian Mammals 1758—1960. London: British Museum (Natural History)
publications,1951.
[ 5 ] 摇 Pocock R I. The Fauna of British India, Including Ceylon and Burma, Mammalia(2 vols, Primates and Carnivora Only) . London: Taylor and
Francis, 1940
[ 6 ]摇 王秀辉,高中信,于学伟,崔岩. 狼亚种分化的 RAPD分子证据.东北林业大学学报,2000,28(5):110鄄113.
[ 7 ] 摇 罗理杨,金煌,杨公社.中国狼的种内系统发育关系与亚种分化.东北林业大学学报, 2003,31(5):81鄄83.
[ 8 ] 摇 Avis J C,Arnold J,Ball R M,Birmingham E,Lamb T,Nigel J E,Reba C A,Saunders N C. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA
bridge between population genetics and systematic. Annual Review of Ecology and Systematic,1987,18(1): 489鄄522.
[ 9 ] 摇 Kim K S, Lee S E, Jeong H W, Ha J H. The complete nucleotide sequence of the domestic dog (Canis familiars) mitochondrial genome. Molecular
Phylogenetics and Evolution, 1998, 10(2): 210鄄 220.
[10] 摇 Lunt D H,Whipple L E,Hyman B C. Mitochondrial DNA variable number tandem repeats(VNTRs): utility and problems in molecular ecology.
Molecular Ecology, 1998, 7(11):1441鄄1455.
[11] 摇 ROERDINK A R,ALDSTADT J H. Sensitive method for the determination of roxarsone using solid鄄phase micro extraction with multi鄄detector gas
chromatography. Journal of Chromatography A, 2004, 1057(1 / 2): 177鄄183.
[12] 摇 Jeanmougin F,Thompson J D,Gouy M,Higgins D G,Gibson T J. Multiple sequence alignment with Clustal X. Trends in Biochemical Sciences,
1998, 23 (10): 403鄄405.
[13] 摇 Tamura K,Dudley J,Nei M,Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis ( MEGA) software version. Molecular Biology and
Evolution, 2007, 24 (8):1596鄄1599.
[14] 摇 Li W H,Gokobori T,Nei M. Pseudogenes as a paradigm of neutral evolution. Nature, 1981, 292(5820): 237鄄239.
[15] 摇 Wayne R K, Geffen E, Girman D J, Koepfli K P, Lau LM, Marshall C R. Molecular systematics of the canidae. Systematic Biology, 1997, 46
(4): 622鄄653.
[16] 摇 Librado P,Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 2009, 25 (11): 1451鄄1452.
[17] 摇 Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.Evolution,1985, 39(4): 783鄄791.
[18] 摇 Irwin D M,Koeher T D, Wilson A C. Evolution of the cytochromeb gene of mammals. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 128鄄144.
[19] 摇 Woischnik M, Moraes C T. Pattern of organization of human mitochondrial pseudogenes in the nuclear genome . Genome Research, 2002, 12 (6):
885鄄893.
[20] 摇 Tourmen Y, Baris O, Dessen P, Jacques C, Malthiery Y, Reynar P. Structure and chromosomal distribution of human mitochondrial pseudogenes.
Genomics, 2002, 80 (1): 71鄄75.
[21] 摇 Knight A,Mindell D P. Substitions bias,weighting of DNA sequence evolution,and the phylogenetic positions of Fea忆s viper. Systems Biology,1993,
42(1): 18鄄31.
[22] 摇 陈磊,张洪海,马建章. 蒙古狼线粒体基因组序列分析及其系统发育地位.生态学报,2010,30(6):1463鄄1471.
[23] 摇 Stadelmann B,Jacobs D S,Schoeman C, Ruedi M. Phylogeny of African Myotis bats (Chiroptera, Vespertilionidae) inferred from cytochrome b
sequences. Acta Chiropterologica, 2004, 6(2): 177鄄192.
[24] 摇 Sueoka N. On the genetic basis of variation and heterogeneity of DNA base composition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 1962, 48(4): 582鄄592.
[25] 摇 Tajima F .Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics,1989,123(3): 585鄄595.
[26] 摇 Tsuda K, Kikkawa Y, Yonekawa H, Tanabe Y. Extensive interbreeding occurred among multiple matriarchial ancestors during the domestication of
dogs: evidence from interand intraspecies polymorphisms in the d鄄loop region of mitochondrial DNA between dogs and wolves. Genes & Genetic
System, 1997, 72(4): 229鄄238.
[27] 摇 Sun J, Liu T. Stratigraphic evidence for the uplift of the Tibetan Plateau between ~ 1.1 and ~ 0.9 myr ago. Quaternary Resarch,2000,54(3):
309鄄320.
[28] 摇 刘艳华,张明海. 基于线粒体 Cty b 基因的西藏马鹿种群遗传多样性研究.生态学报,2011,31(7): 1976鄄1981.
[29] 摇 Neigel J E,Avise J C. Application of a random walk model to geographic distributions of animal mitochondrial DNA variation.Geneties,1993,135
(4): 1209鄄1220.
[30] 摇 Randi E, Lucchini V, Christensen M F, Mucci N, Funk S M, Dolf G, Loeschke V. Mitochondrial DNA variability in Italian and East European
wolves: detecting the consequences of small population size and hybridization. Conservation Biology, 2000,14(2): 464鄄473.
[31] 摇 Pilot M, Jedrzejewski W, Branicki W, Sidorovich W E, Jedrzejewska B, Stachura K, Funk S M. Ecological factors influence population genetic
structure of European grey wolves. Molecular Ecology, 2006,15(14): 4533鄄4553.
8781 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
[32]摇 Gomerc姚 ic忆 T, Sindic姚 ic忆 M, Galov A, Arbanasic忆 H, Kusak J, Kocijan I, Gomerc姚 ic忆1 M D, Huber D. High genetic variability of the grey wolf (Canis
lupus L.) population from croatia as revealed by mitochondrial DNA control region sequences. Zoological Studies, 2010,49(6):816鄄823.
[33] 摇 Vila C, Amorim J R, Leonard J A, Posada D, Castroviejo J, Petrucci鄄Fonseca F, Crandall K A, Ellegren H, Wayne R K. Mitochondrial DNA
Phylogeography and Population History of the GreyWolf Canis lupus. Molecular Evolution, 1999, 8(12): 2089鄄2103.
[34] 摇 Aggarwal R K, Ramadevi J, Singh L. Ancient origin and evolution of the Indian wolf: evidence from mitochondrial DNA typing of wolves from
Trans鄄Himalayan region and Pennisular India. Genome Biology, 2003, 4: 6鄄6.
[35] 摇 Sharma D K, Maldonado J E, Jhala Y V, Fleischer R C. Ancient wolf lineages in India. Biology letters, 2004, 271(S3): S1鄄S4.
[36] 摇 Pocock R I, F R S, F Z S. The races of Canis lupus. Proceedings of the Zoological Society of London, 1935, 105(3): 647鄄686.
附表摇 从 Genbank下载的用于分析中国狼系统发育序列信息
Table摇 Reference mitochondrial control鄄region sequences obtained from Genbank and used in the phylogenetic analysis
样品编号
Sample code
Genbank 登录号
Genbank Acc. No.
亚种
Subspecies
国家或地区 /洲
Country or vegion / Conttinent D鄄loop(bp)
单倍型编号
Haplotypes No.
控制区位置
D鄄loop region
1鄄CHW1 AY916807 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W17 Most of 5忆鄄CR鄄I
2鄄CHW2 AY916808 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W18 Most of 5忆鄄CR鄄I
3鄄CHW3 AY916810 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W19 Most of 5忆鄄CR鄄I
4鄄CHW4 AY916811 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W20 Most of 5忆鄄CR鄄I
5鄄CHW5 AY916812 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W21 Most of 5忆鄄CR鄄I
6鄄CHW6 AY916806 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W22 Most of 5忆鄄CR鄄I
7鄄CHW7 AY916813 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W23 Most of 5忆鄄CR鄄I
8鄄CHW8 AY916814 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W24 Most of 5忆鄄CR鄄I
9鄄CHW9 AY916805 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W2 Most of 5忆鄄CR鄄I
10鄄CHW11 AY916816 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W4 Most of 5忆鄄CR鄄I
11鄄CHW12 AY916817 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W25 Most of 5忆鄄CR鄄I
12鄄CHW13 AY916804 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W26 Most of 5忆鄄CR鄄I
13鄄CHW14 AY916819 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W2 Most of 5忆鄄CR鄄I
14鄄CHW15 AY916818 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W27 Most of 5忆鄄CR鄄I
15鄄CHW16 AY916820 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W8 Most of 5忆鄄CR鄄I
16鄄CHW17 AY916822 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W28 Most of 5忆鄄CR鄄I
17鄄CHW18 AY916821 C.l.chanco 中国 亚洲 597 W7 Most of 5忆鄄CR鄄I
18鄄CT1 FJ032363 C.l.langier 中国西藏 亚洲 1263 W9 Complete D鄄loop
19鄄CT2 NC_011218 C.l.langier 中国西藏 亚洲 1263 W9 Complete D鄄loop
20鄄CN GQ374438 C.l.chanco 中国 亚洲 1250 W2 Complete D鄄loop
21鄄ch1 AB007375 C.l.chanco 蒙古 亚洲 673 W29 Complete 5忆鄄CR鄄I
22鄄ch2 AB007376 C.l.chanco 蒙古 亚洲 673 W2 Complete 5忆鄄CR鄄I
23鄄ch3 AB007377 C.l.chanco 蒙古 亚洲 673 W4 Complete 5忆鄄CR鄄I
24鄄ch4 AB007378 C.l.chanco 蒙古 亚洲 673 W18 Complete 5忆鄄CR鄄I
25鄄ch5 AB007379 C.l.chanco 蒙古 亚洲 673 W16 Complete 5忆鄄CR鄄I
26-Rw1 DQ480503 俄罗斯 欧洲 1269 Complete D鄄loop
27鄄Wo251 AB480743 C.l.chanco 俄罗斯 欧洲 598 Most of 5忆鄄CR鄄I
28鄄Wo252 AB480744 C.l.chanco 朝鲜 亚洲 598 Most of 5忆鄄CR鄄I
29鄄Jw229 AB480736 C.l.hodophilax 日本 亚洲 598 Most of 5忆鄄CR鄄I
30鄄Jw237(1) AB480738 C.l.hodophilax 日本 亚洲 590 Most of 5忆鄄CR鄄I
31鄄Jw240(1) AB480739 C.l.hodophilax 日本 亚洲 598 Most of 5忆鄄CR鄄I
32鄄Jw257 AB480741 C.l.hodophilax 日本 亚洲 598 Most of 5忆鄄CR鄄I
33鄄Jw233 AB499819 C.l.hodophilax 日本 亚洲 1231 Complete D鄄loop
34鄄Jw235 AB499820 C.l.hodophilax 日本 亚洲 1271 Complete D鄄loop
35鄄Jw237(2) AB499821 C.l.hodophilax 日本 亚洲 1102 Most of D鄄loop
36鄄Jw240(2) AB499823 C.l.hodophilax 日本 亚洲 1270 Complete D鄄loop
37鄄Jw AB500701 C.l.hattai 日本 亚洲 599 Most of 5忆鄄CR鄄I
38鄄Sw1 DQ480506 沙特阿拉伯 亚洲 1269 Complete D鄄loop
39鄄Sw2 DQ480507 沙特阿拉伯 亚洲 1270 Complete D鄄loop
40鄄W3Tr AY570178 伊朗 亚洲 586 Most of 5忆鄄CR鄄I
9781摇 6期 摇 摇 摇 张洪海摇 等:中国狼不同地理种群遗传多样性及系统进化分析 摇
http: / / www.ecologica.cn
续表
样品编号
Sample code
Genbank 登录号
Genbank Acc. No.
亚种
Subspecies
国家或地区 /洲
Country or vegion / Conttinent D鄄loop(bp)
单倍型编号
Haplotypes No.
控制区位置
D鄄loop region
41鄄W1Ks AY570179 伊朗 亚洲 586 Most of 5忆鄄CR鄄I
42鄄W2Qv AY570180 伊朗 亚洲 587 Most of 5忆鄄CR鄄I
43鄄W4Hd AY570181 伊朗 亚洲 586 Most of 5忆鄄CR鄄I
44鄄Iw AB007374 C.l. pallipes 印度 亚洲 672 Complete 5忆鄄CR鄄I
45鄄Iwb AY333744 C.l. pallipes 印度 亚洲 336 3忆鄄CR鄄II
46鄄Iwc AY333745 C.l. pallipes 印度 亚洲 336 3忆鄄CR鄄II
47鄄Iwd AY333746 C.l. pallipes 印度 亚洲 336 3忆鄄CR鄄II
48鄄GW鄄AMM AY289973 C.l.indica 印度 亚洲 1323 Complete D鄄loop
49鄄 GW鄄AP鄄1 AY289974 C.l.indica 印度 亚洲 1253 Complete D鄄loop
50鄄 GW鄄AP鄄2 AY289975 C.l.indica 印度 亚洲 1272 Complete D鄄loop
51鄄 GW鄄AP鄄3 AY289976 C.l.indica 印度 亚洲 1262 Complete D鄄loop
52鄄 GW鄄gujarat AY289984 C.l.indica 印度 亚洲 1292 Complete D鄄loop
53鄄HW鄄TW5 AY289995 C.l.chanco 印度喜马拉雅山 亚洲 1296 Complete D鄄loop
54鄄HWD1 AY333740 C.l.chanco 印度喜马拉雅山 亚洲 335 3忆鄄CR鄄II
55鄄HWD2 AY333741 C.l.chanco 印度喜马拉雅山 亚洲 335 3忆鄄CR鄄II
56鄄Wo1 AF098115 C.l. tundrarum 加拿大 北美洲 707 Complete 5忆鄄CR鄄I
57鄄Wo2 AF098116 C.l.lupus 加拿大 北美洲 706 Complete 5忆鄄CR鄄I
58鄄W03 AF098117 C.l.lupus 加拿大 北美洲 706 Complete 5忆鄄CR鄄I
59鄄Wo4 AF098118 C.l. columbianus 加拿大 北美洲 706 Complete 5忆鄄CR鄄I
60鄄Wo5 AF098119 C.l. columbianus 加拿大 北美洲 708 Complete 5忆鄄CR鄄I
61鄄Wo6 AF098120 C.l. columbianus 加拿大 北美洲 706 Complete 5忆鄄CR鄄I
62鄄Wo8 AF098122 C.l. columbianus 加拿大 北美洲 708 Complete 5忆鄄CR鄄I
63鄄Wo9 AF098123 C.l. crassodon 加拿大 北美洲 707 Complete 5忆鄄CR鄄I
64鄄Wo10 AF098124 C.l. crassodon 加拿大 北美洲 707 Complete 5忆鄄CR鄄I
65鄄Wo11 AF098125 C.l. crassodon 加拿大 北美洲 707 Complete 5忆鄄CR鄄I
66鄄Cw DQ480508 加拿大 北美洲 1270 Complete D鄄loop
67鄄Lu68 FN298177 加拿大 北美洲 425 Part of 5忆鄄CR鄄I
68鄄H173 AY240155 美国 北美洲 1254 Complete D鄄loop
69鄄H919 AY240073 美国 北美洲 1282 Complete D鄄loop
70鄄Coy13 JF342907 C.l.lycaon 美国 北美洲 1300 Complete D鄄loop
71鄄w6 FJ213912 美国 北美洲 603 Most of 5忆鄄CR鄄I
72鄄w7 FJ213913 美国 北美洲 602 Most of 5忆鄄CR鄄I
73鄄Uw AF020699 美国 北美洲 402 Most of 5忆鄄CR鄄I
74鄄w6 AF008136 罗马尼亚 欧洲 712 Complete 5忆鄄CR鄄I
75鄄Sw1 AM711902 C.l.lupus 瑞典 欧洲 1357 Complete D鄄loop
76鄄Sw2 NC_009686 C.l.lupus 瑞典 欧洲 1357 Complete D鄄loop
77鄄Sw3 DQ480504 瑞典 欧洲 1249 Complete D鄄loop
78鄄Spw1 DQ480505 西班牙 欧洲 1269 Complete D鄄loop
79鄄ClupMIT1 EF380226 C.l. signatus 西班牙 欧洲 647 Most of 5忆鄄CR鄄I
80鄄ClupMIT2 EF380227 C.l. signatus 西班牙 欧洲 647 Most of 5忆鄄CR鄄I
81鄄ClupMIT3 EF380228 C.l. signatus 西班牙 欧洲 647 Most of 5忆鄄CR鄄I
82鄄ClupMIT4 EF380229 C.l. signatus 西班牙 欧洲 647 Most of 5忆鄄CR鄄I
83鄄w1 AF344299 波兰 欧洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
84鄄w2 AF344300 波兰 欧洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
85鄄w3 AF344301 波兰 欧洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
0881 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 35卷摇
http: / / www.ecologica.cn
续表
样品编号
Sample code
Genbank 登录号
Genbank Acc. No.
亚种
Subspecies
国家或地区 /洲
Country or vegion / Conttinent D鄄loop(bp)
单倍型编号
Haplotypes No.
控制区位置
D鄄loop region
86鄄w4 AF344302 波兰 欧洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
87鄄w8 AF005299 希腊 欧洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
88鄄w9 AF005300 希腊 欧洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
89鄄w18 AF005306 阿富汗 亚洲 257 Part of 5忆鄄CR鄄I
90鄄WCR01 GU059550 克罗地亚 欧洲 280 Part of 5忆鄄CR鄄I
91鄄WCR02 GU059551 克罗地亚 欧洲 280 Part of 5忆鄄CR鄄I
92鄄WCR03 GU059552 克罗地亚 欧洲 281 Part of 5忆鄄CR鄄I
93鄄WCR06 GU059555 克罗地亚 欧洲 281 Part of 5忆鄄CR鄄I
94鄄Yw1 AB007372 C.l.lupus 斯洛文尼亚 欧洲 673 Complete 5忆鄄CR鄄I
95鄄Yw2 AB007373 C.l.lupus 斯洛文尼亚 欧洲 372 Part of 5忆鄄CR鄄I
96鄄w1 AF338803 法国 /意大利 欧洲 343 Part of 5忆鄄CR鄄I
97鄄w2 AF338804 阿尔卑斯山 欧洲 343 Part of 5忆鄄CR鄄I
98鄄w3 AF338805 阿尔卑斯山 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
99鄄w4 AF338806 克罗地亚 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
100鄄w5 AF338807 克罗地亚 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
101鄄w6 AF338808 葡萄牙 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
102鄄w7 AF338809 西班牙 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
103鄄w8 AF338810 罗马尼亚 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
104鄄w9 AF338811 波兰 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
105鄄w10 AF338812 西班牙 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
106鄄w11 AF487754 阿尔卑斯山 欧洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
107鄄w1 AF115687 保加利亚 欧洲 543 Most of 5忆鄄CR鄄I
108鄄w2 AF115688 保加利亚 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
109鄄w3 AF115689 保加利亚 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
110鄄w4 AF115690 希腊 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
111鄄w5 AF115691 保加利亚 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
112鄄w7 AF115692 芬兰 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
113鄄w8 AF115693 意大利 /东欧 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
114鄄w9 AF115694 保加利亚 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
115鄄w10 AF115695 克罗地亚 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
116鄄w11 AF115696 以色列 亚洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
117鄄w12 AF115697 以色列 亚洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
118鄄w13 AF115698 芬兰 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
119鄄w14 AF115699 意大利 欧洲 543 Most of 5忆鄄CR鄄I
120鄄w15 AF115700 保加利亚 欧洲 543 Most of 5忆鄄CR鄄I
121鄄w16 AF115701 保加利亚 欧洲 543 Most of 5忆鄄CR鄄I
122鄄w19 AF115702 西班牙 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
123鄄w20 AF115703 西班牙 欧洲 542 Most of 5忆鄄CR鄄I
124鄄Coytoe 1 NC_008093 C.l.latrans 美国 北美洲 1265 Complete D鄄loop
125鄄Ccr21 HM755710 C.l.latrans 加拿大 北美洲 342 Part of 5忆鄄CR鄄I
126鄄Ccr23 HM755712 C.l.latrans 加拿大 北美洲 340 Part of 5忆鄄CR鄄I
127鄄Ccr25 HM755714 C.l.latrans 加拿大 北美洲 340 Part of 5忆鄄CR鄄I
128鄄Ccr27 HM755716 C.l.latrans 加拿大 北美洲 340 Part of 5忆鄄CR鄄I
129鄄Coytoe 2 DQ480510 C.l.latrans 美国 北美洲 1262 Complete D鄄loop
130鄄Cla25 AY280938 C.l.latrans 美国 北美洲 324 Part of 5忆鄄CR鄄I
131鄄Cla27 AY280940 C.l.latrans 美国 北美洲 323 Part of 5忆鄄CR鄄I
1881摇 6期 摇 摇 摇 张洪海摇 等:中国狼不同地理种群遗传多样性及系统进化分析 摇