全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
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摇 摇 第 猿源卷 第 员园期摇 摇 圆园员源年 缘月摇 渊半月刊冤
目摇 摇 次
前沿理论与学科综述
景观可持续性与景观可持续性科学 赵文武袁房学宁 渊圆源缘猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
生态系统服务付费的诊断框架及案例剖析 朱文博袁王摇 阳袁李双成 渊圆源远园冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
湿地植物根表铁膜研究进展 刘春英袁陈春丽袁弓晓峰袁等 渊圆源苑园冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
水生生态环境中捕食信息素的生态学效应 覃光球袁卢豪良袁唐振柱袁等 渊圆源愿员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
脊椎动物传播植物肉质果中的次生物质及其生态作用 潘摇 扬袁罗摇 芳袁鲁长虎 渊圆源怨园冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
个体与基础生态
中亚热带天然林土壤 悦匀源吸收速率对模拟 晕沉降的响应 陈朝琪袁杨智杰袁刘小飞袁等 渊圆源怨愿冤噎噎噎噎噎噎
塔里木盆地南缘旱生芦苇生态特征与水盐因子关系 贡摇 璐袁朱美玲袁塔西甫拉提窑特依拜袁等 渊圆缘园怨冤噎噎噎
黄刺玫叶片光合生理参数的土壤水分阈值响应及其生产力分级 张淑勇袁夏江宝袁张光灿袁等 渊圆缘员怨冤噎噎噎噎
亚热带杉木和米老排人工林土壤呼吸对凋落物去除和交换的响应 余再鹏袁万晓华袁胡振宏袁等 渊圆缘圆怨冤噎噎噎
施钾提高蚜害诱导的小麦茉莉酸含量和叶片相关防御酶活性 王摇 祎袁张月玲袁苏建伟袁等 渊圆缘猿怨冤噎噎噎噎噎
高浓度 韵猿及太阳辐射减弱对冬小麦 孕杂域光合活性及光能耗散的影响
孙摇 健袁郑有飞袁吴荣军袁等 渊圆缘源愿冤
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蜡样芽孢杆菌 月猿鄄苑在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果
黄秋斌袁张摇 颖袁刘凤英袁等 渊圆缘缘怨冤
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有限供水下冬小麦全程耗水特征定量研究 张兴娟袁薛绪掌袁郭文忠袁等 渊圆缘远苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
抗真菌转基因水稻生态适合度评价 李摇 伟袁郭建夫袁袁红旭袁等 渊圆缘愿员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
花生叶片蛋白组对 哉灾鄄月辐射增强的响应 杜照奎袁李钧敏袁钟章成袁等 渊圆缘愿怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
南海南部悬浮颗粒物脂肪酸组成 刘华雪袁柯常亮袁李纯厚袁等 渊圆缘怨怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
年龄尧集群尧生境及天气对鄱阳湖白鹤越冬期日间行为模式的影响 袁芳凯袁李言阔袁李凤山袁等 渊圆远园愿冤噎噎噎
咱树暂麻雀羽再生的能量预算和水代谢散热调节 杨志宏袁吴庆明袁杨摇 渺袁等 渊圆远员苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
低剂量杀虫剂对星豹蛛捕食效应的影响及其机理 李摇 锐袁李摇 娜袁刘摇 佳袁等 渊圆远圆怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
空心莲子草叶甲对越冬保护的响应与控害效能 刘雨芳袁王秀秀袁李摇 菲袁等 渊圆远猿愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
种群尧群落和生态系统
气候变化对鄱阳湖白鹤越冬种群数量变化的影响 李言阔袁钱法文袁单继红袁等 渊圆远源缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
不同退耕年限下菜子湖湿地土壤磷素组分特征变化 刘文静袁张平究袁董国政袁等 渊圆远缘源冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
查干湖湿地浮游植物与环境因子关系的多元分析 李然然袁章光新袁张摇 蕾 渊圆远远猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
闽江河口区淡水和半咸水潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌多样性 曾志华袁杨民和袁佘晨兴袁等 渊圆远苑源冤噎噎噎噎噎
环境及遗传背景对延河流域植物叶片和细根功能性状变异的影响 郑摇 颖袁温仲明袁宋摇 光袁等 渊圆远愿圆冤噎噎噎
衡阳紫色土丘陵坡地植被恢复阶段土壤特性的演变 杨摇 宁袁邹冬生袁杨满元袁等 渊圆远怨猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
海平面上升影响下广西钦州湾红树林脆弱性评价 李莎莎袁孟宪伟袁葛振鸣袁等 渊圆苑园圆冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
中国南方 猿种主要人工林生物量和生产力的动态变化 杜摇 虎袁曾馥平袁王克林袁等 渊圆苑员圆冤噎噎噎噎噎噎噎噎
杉木人工林土壤真菌遗传多样性 何苑皞袁周国英袁王圣洁袁等 渊圆苑圆缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
科尔沁固定沙地植被特征对降雨变化的响应 张腊梅袁刘新平袁赵学勇袁等 渊圆苑猿苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
黄土丘陵区退耕还林地刺槐人工林碳储量及分配规律 申家朋袁张文辉 渊圆苑源远冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
景观尧区域和全球生态
南亚热带森林演替过程中小气候的改变及对气候变化的响应 刘效东袁周国逸袁陈修治袁等 渊圆苑缘缘冤噎噎噎噎噎
黄淮海平原典型站点冬小麦生育阶段的干旱特征及气候趋势的影响 徐建文袁居摇 辉袁刘摇 勤袁等 渊圆苑远缘冤噎噎
资源与产业生态
基于 郧陨杂的山西省矿产资源规划环境影响评价 刘摇 伟袁杜培军袁李永峰 渊圆苑苑缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
基于效益分摊的水电水足迹计算方法要要要以密云水库为例 赵丹丹袁刘俊国袁赵摇 旭 渊圆苑愿苑冤噎噎噎噎噎噎噎
学术信息与动态
全球土地计划第二次开放科学大会渊郧蕴孕 圆灶凿 韵责藻灶 杂糟蚤藻灶糟藻 酝藻藻贼蚤灶早冤会议述评 段宝玲袁卜玉山 渊圆苑怨远冤噎噎噎
期刊基本参数院悦晕 员员鄄圆园猿员 辕 匝鄢员怨愿员鄢皂鄢员远鄢猿源愿鄢扎澡鄢孕鄢 预 怨园郾 园园鄢员缘员园鄢猿远鄢圆园员源鄄园缘
室室室室室室室室室室室室室室
封面图说院 鄱阳湖越冬的白鹤群要要要白鹤为国家一级保护动物袁世界上白鹤东部种群的迁徙路线是从俄罗斯西伯利亚的雅库
特袁向南迁飞 缘员园园噪皂到中国长江下游的鄱阳湖越冬袁其中途经俄罗斯的雅纳河尧印迪吉尔卡河和科雷马河流域袁进
入中国后主要停歇地有扎龙尧林甸尧莫莫格以及双台河口尧滦河口尧黄河三角洲和升金湖等地遥 多年的监测表明袁世
界 怨园豫以上的白鹤种群都在鄱阳湖越冬遥 越冬初期和末期是白鹤补充能量的关键阶段袁因此袁研究鄱阳湖国家级自
然保护区越冬白鹤种群数量和当地气候变化的相关性具有重要意义遥
彩图及图说提供院 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 耘鄄皂葬蚤造院 糟蚤贼藻泽援糟澡藻灶躁憎岳 员远猿援糟燥皂
第 34 卷第 10 期
2014年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.10
May,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670334, 31270461); 浙江省教育厅科研项目(Y201223322); 中央高校基本科研业务费专项资金资助
项目(XDJK2011D009)
收稿日期:2013鄄02鄄03; 摇 摇 修订日期:2014鄄03鄄21
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zzhong@ swu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201302030223
杜照奎, 李钧敏, 钟章成, 董鸣.花生叶片蛋白组对 UV鄄B辐射增强的响应.生态学报,2014,34(10):2589鄄2598.
Du Z K, Li J M, Zhong Z C, Dong M.A proteomic analysis of Arachis hypogaea leaf in responses to enhanced ultraviolet鄄B radiation.Acta Ecologica Sinica,
2014,34(10):2589鄄2598.
花生叶片蛋白组对 UV鄄B辐射增强的响应
杜照奎1,2, 李钧敏2, 钟章成1,*, 董摇 鸣3,4
(1. 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 西南大学生命科学学院, 重庆摇 400715;
2. 台州学院生态研究所,台州摇 318000; 3. 中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室, 北京摇 100093;
4. 杭州师范大学生命与环境科学学院, 杭州摇 310036)
摘要:为揭示 UV鄄B辐射增强处理降低花生光合速率和花生抵御 UV鄄B辐射增强的分子机制,应用蛋白质双向电泳与质谱联用
技术对自然光环境下补增 UV鄄B辐射(54 滋W/ cm2)处理 24h的苗期花生叶片差异表达蛋白质变化进行了分析。 结果表明:补
增 UV鄄B处理下,花生叶片中共检测到丰度变化在 2.5倍以上的差异表达蛋白点 39个(其中 22种蛋白质表达下调,17种表达上
调),经过 MALDI鄄TOF鄄TOF分析及数据库检索,成功鉴定出其中的 27种蛋白质。 被鉴定的 27种蛋白质按其功能大致可归为 8
类,第玉类:光合作用相关的蛋白质,包括质体蓝素、1, 5鄄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基、放氧复合物增强子蛋白 1、PsbP 结构域蛋
白 6和果糖二磷酸醛缩酶;第域类:糖代谢相关蛋白质,包括苹果酸脱氢酶;第芋类:能量合成相关蛋白质,包括 ATP 合酶;第郁
类:氨基酸代谢相关蛋白质,包括半胱氨酸合成酶;第吁类:蛋白质加工相关蛋白质,包括热激蛋白;第遇类:蛋白质翻译相关蛋
白质,包括核糖体循环因子;第喻类:防御相关蛋白质,包括几丁质酶、过氧化物酶、Cu鄄Zn 超氧化物歧化酶、二羟肉桂酸 3鄄O鄄转
甲基酶和类萌发素蛋白;第峪类,未知功能蛋白质。 这些研究结果为进一步研究花生抵御 UV鄄B辐射的分子机理提供了有意义
的线索。
关键词:UV鄄B; 花生; 蛋白组学; 双向电泳; 质谱
A proteomic analysis of Arachis hypogaea leaf in responses to enhanced
ultraviolet鄄B radiation
DU Zhaokui1,2, LI Junmin2, ZHONG Zhangcheng1,*, DONG Ming3,4
1 MOE Key Laboratory of Eco鄄environments of Three Gorges Reservoir Region, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China
2 Institute of Ecology, Taizhou University, Taizhou 318000, China
3 State Key Laboratory of Vegetation and Environmental Change, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
4 College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China
Abstract: Ultraviolet鄄B (UV鄄B, 280—320 nm) constitutes a minor part of the solar spectrum, which can be absorbed by
stratospheric ozone layer. However, a global depletion of the ozone layer, largely due to the release of man鄄made
chlorofluorocarbons, has resulted in an increase of ground鄄level solar UV鄄B radiation. UV鄄B can influence plant processes,
either through direct damage or via various regulatory effects. Many researches have warned that excessive UV鄄B radiation
can harm living organisms by damaging DNA, proteins, lipids, and membranes and consequently affecting plant growth,
development, morphology, and productivity. Two鄄dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2鄄D PAGE) is a powerful
technique for resolving hundreds of proteins in parallel. Combined with mass spectrometry (MS), it allows rapid and
reliable protein identification. In recent years, proteomic鄄based technologies have been successfully applied to systematic
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studies of the stress responses many plant species, including Arabidopsis, soybean, rice, wheat, barley, potato, tomato,
and many others. A wide range of abiotic stresses have been examined, such as drought, nutrition deficiency, temperature,
oxidative stress, herbicides, wounding, anoxia, salt, and heavy metals. These investigations have provided a wealth of
important information on the physiological processes involved in plant stress responses. To explore the molecular mechanisms
of the decreased photosynthetic rate and the resistance of peanut ( Arachis hypogaea) when exposed to enhanced UV鄄B
radiation, 2鄄D PAGE and MS were used to identify the differentially鄄expressed proteins in peanut seedling leaves in
response to supplementary UV鄄B radiation (54 滋W / cm2) for 24 h. A total of 39 protein spots were differentially expressed
by at least 2.5 fold compared with the controls (22 proteins were down鄄regulated and 17 were up鄄regulated) after treatment
with supplementary UV鄄B radiation. Of those protein spots, 27 were successfully identified by MALDI TOF / TOF MS after a
database search. Those 27 proteins could be classified into eight categories according to their functions: class I,
photosynthesis ( plastocyanin, ribulose鄄1,5鄄bisphosphate carboxylase small subunit, oxygen鄄evolving enhancer protein 1,
PsbP domain鄄containing protein 6, and fructose鄄bisphosphate aldolase ); class II, carbohydrate metabolism ( malate
dehydrogenase); class III, energy synthesis (ATP synthase); class IV, amino acid biosynthesis (cysteine synthase); class
V, protein biosynthesis ( ribosome recycling factor); class VI, protein processing ( heat shock proteins); class VII,
defense responses (chitinase, peroxidase, Cu鄄Zn SOD, caffeic acid 3鄄O鄄methyltransferase, and germin鄄like protein); class
VIII, unknown proteins. In conclusion, we hypothesized that the enhanced UV鄄B radiation caused a decrease in the
photosynthesis rate of peanut leaves mainly via three mechanisms. First, enhanced UV鄄B may down鄄regulate the expression
of ribosome recycling factor, which caused a decrease in the expression of subunit PsbP in photosystem II, thus destroying
the thylakoid membrane structure. Second, the reduced plastocyanin expression may have induced a decrease in
photosynthetic electron transport efficiency. Third, the down鄄regulation of ribulose鄄1, 5鄄bisphosphate carboxylase and
fructose鄄1,6鄄bisphosphate aldolase resulted in a decrease in carbon assimilation. At the same time, peanut may also
enhance its resistance to UV鄄B stress by increasing the expressions of antioxidant enzymes and non鄄enzymatic antioxidants,
germin鄄like proteins, pathogenesis鄄related proteins, and heat shock proteins. These results provide important information for
understanding the molecular mechanisms by which A. hypogaea responds to elevated UV鄄B stress.
Key Words: UV鄄B; Arachis hypogaea;proteome; two鄄dimensional electrophoresis (2鄄DE); mass spectrometry
摇 摇 人类工业的快速发展使得大量氯氟烃类气体被
释放到空气中,导致大气臭氧层变薄,从而提高到达
地球表面的 UV鄄B ( ultraviolet鄄B, UV鄄B, 280—320
nm)水平[1]。 UV鄄B 虽然只是太阳光谱中的一小部
分,但是很容易被生物分子(例如:核酸、蛋白质和脂
质等)大量吸收,从而引起高等植物中分子和细胞水
平的生化反应历程发生改变[2]。 目前,植物对 UV鄄B
辐射响应的研究报道较多,但大多集中在光合作用、
形态变化和生理抗性等。 总体而言,增强的 UV鄄B辐
射会使较多的植物净光合速率降低、株高变低、叶片
变厚、生物量下降,并且伴随抗氧化酶活性升高或
UV鄄B吸收物质含量增加等[3]。
当前,评价 UV鄄B辐射增强对植物光合作用影响
时通常是比较处理与对照间植物的净光合速率
(Pn),如果 Pn 下降,则一般会从 3 个方面进行解
释:一是透射电镜观察叶绿体超微结构遭到破坏[4],
二是核酮糖鄄1, 5鄄二磷酸羧化酶(Rubisco)羧化效率
下降[5],三是电子传递效率降低[6],但深层原因的解
释较少。 此外,植物应对 UV鄄B 辐射方面,较多的研
究将重点集中在一些常见的抗氧化酶、非酶抗氧化
性物质[7]和 UV鄄B吸收物质(如:类黄酮)等层面,其
它方面研究鲜有报道。
植物在生长发育过程中,常常会受到某些非生
物胁迫,引发蛋白质在表达量和种类上的显著改变,
而以双向电泳与质谱技术为标志的蛋白质组学为从
分子水平揭示植物对非生物胁迫(如:干旱、低温、
盐、臭氧和重金属等)的响应机制提供了有力保
障[8]。 花生(Arachis hypogaea L.)是豆科落花生属一
年生草本植物,富含脂肪和蛋白质,为重要的食用植
物油来源。 研究发现,UV鄄B辐射可导致花生产量下
0952 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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降[9],原因是因为净光合速率降低,株高变矮和叶片
数目减少,但有关花生 UV鄄B辐射对花生影响的分子
机制尚未明确。 本课题组在前期研究发现大田种植
的花生在接受 UV鄄B 补增处理 24 h 后,净光合速率
显著下降,本研究拟借助于蛋白质组学技术,分析花
生幼苗在 UV鄄B辐射增强下蛋白质表达的差异,旨在
从蛋白质水平揭示:1)UV鄄B辐射增强处理降低花生
光合速率的分子机理,2)花生抵御 UV鄄B 辐射增强
的分子机制,从而为最终培育优良抗性品种提供理
论依据。
1摇 材料与方法
1.1摇 供试材料
供试花生(A. hypogaea L.)品种为小京生,该品
种为浙江省优异花生,种子购自新昌县种子公司。
1.2摇 试验设计
试验在浙江省临海市许市村旱地进行,土壤为
沙性土,其基本理化性质为:pH 7.57、有机质 26.21
g / kg、全氮 1.08 g / kg、全磷 1.55 g / kg、全钾 15.20 g /
kg、碱解氮 36.15 mg / kg、有效磷 112.26 mg / kg、速效
钾为 155.62 mg / kg。 2012 年 5 月 1 日挑选健康饱
满、大小均匀的花生种子于 25 益自来水中浸泡 24
h,穴播,每穴 2粒,行距 40 cm,穴距 20 cm。
花生萌发后,每穴保留 2 棵幼苗,待主茎 4 对真
叶全部展开时开始进行补增 UV鄄B 辐射处理,UV鄄B
光源采用北京电光源研究所生产的紫外灯管(发射
波段 280—320 nm,峰值 308 nm)。 将紫外灯具悬挂
在试验组花生上方,维持 UV鄄B 辐射强度在 54 滋W /
cm2左右(相当于试验地太阳光 UV鄄B 的 20%,UV
enhanced, UVE),每天辐射时间 8 h,共处理 3d;为保
证两组接受太阳光照射条件尽可能一致,对照组
(CK)花生上方也悬挂灯架,但不安装灯管。 处理结
束后,收获植株最顶端 2 张叶片,对照和处理各设 8
个重复,液氮速冻,并保存于-80 益冰箱中,用于蛋
白质组学分析。
1.3摇 研究方法
1.3.1摇 花生蛋白质的提取与制备
将 5个重复的冷冻样品取出,称取 1 g 左右叶
片,混合,液氮中充分研磨;按照 1 颐10 的比例加入预
冷的含 10%三氯乙酸的丙酮,-20 益沉淀 1h;4 益,
15000 r / min 离心 15 min,取沉淀,加入预冷丙酮,
-20 益沉淀 1h;4益,15000 g离心 15 min,取沉淀,真
空冷冻干燥;在 20 mg 干燥蛋白粉末中加入 1 ml 样
品裂解液(9 mol / L尿素、4% CHAPS、1% IPG buffer、
1% DTT),30 益恒温水浴溶解 1h,使蛋白充分溶解;
将溶液在室温下 15000 r / min 离心 15 min,取上清,
并再次离心取上清,充分去除不溶性杂质。 上清液
即为组织的总蛋白溶液,采用 Bradford 法测定提取
的蛋白浓度并分装后储存于-80 益备用或直接用于
双向电泳。
1.3.2摇 花生蛋白质的双向电泳
第一向固相 pH 梯度等电聚焦电泳( Isoelectric
focusing, IEF):采用 GE Healthcare生产的 IPG胶条
(24 cm,pH= 3—10),上样蛋白量为 200 滋g(体积为
450 滋L)。 水化和聚焦温度均为 20 益,等电聚焦程
序为:50 V聚焦 12 h、500 V 聚焦 1h、1000 V 聚焦 1
h、1000—10000 V 梯度升压聚焦 1 h、10000 V 聚焦
10 h。
第二向 SDS鄄PAGE 电泳:聚焦完毕后,取出胶
条,在 10 ml平衡缓冲液玉[6 mol / L 尿素、50 mmol /
L Tris·HCl( pH = 8.8)、30%甘油、2%SDS、1%DTT
和 0.05%溴酚兰]和 10 ml平衡缓冲液域[6 mol / L尿
素、50 mmol / L Tris·HCl(pH = 8.8)、30%甘油、2%
SDS、2.5%碘乙酰胺和 0.05%溴酚兰]的平衡管中缓
慢水平摇晃 15 min。 在 SDS鄄PAGE 凝胶(12%)的上
表面加入封胶液(25 mmol / L Tris、192 mmol / L 甘氨
酸、0.1%SDS 和 0.5%琼脂糖),将胶条放到第二向
SDS鄄PAGE凝胶的上表面,使胶条与 SDS鄄PAGE凝胶
的胶面充分接触。 待琼脂糖完全凝固后,将凝胶转
移至电泳槽中,在 15 益按如下参数进行电泳:100 V
电泳 45 min后将电压改为 200V,电泳至溴酚兰前沿
刚好跑出凝胶。
1.3.3摇 硝酸银染色
电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃板,取出凝胶按
Shevchenko等[10]方法进行硝酸银染色,略有修改。
具体操作如下:双蒸水洗 5 min;固定液(30%乙醇、
10%乙酸)固定 30 min;10%乙醇洗两遍,每遍 5 min;
双蒸水洗两遍,每遍 5 min;敏化液(0.02%硫代硫酸
钠)敏化 1 min;水洗两遍,每次 1 min;银染液(0.1%
硝酸银)染色 20 min;双蒸水洗两次,每次 30 s;显影
液(0.25%碳酸钠,0.04%甲醛溶液)显影 3 min;至图
像满意;停显液(5%乙酸)终止显色;双蒸水洗 3 次,
1952摇 10期 摇 摇 摇 杜照奎摇 等:花生叶片蛋白组对 UV鄄B辐射增强的响应 摇
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每次 5 min,保鲜膜密封。 4 益保存备用。
1.3.4摇 双向电泳图谱分析
银染后的凝胶应用 Image Scanner(GE Healthcare)
扫描仪进行扫描,扫描模式为灰度模式,光密度值为
300 dpi。 使用 PDQuest 8.0软件(Bio鄄Rad)对处理和
对照的双向电泳图像进行分析,按照软件说明进行
凝胶蛋白点检测、图像背景扣除、蛋白点灰度值标准
化和不同凝胶间蛋白点匹配,以变化倍数大于 2.5倍
或小于 0.4倍为标准选择差异蛋白点用于质谱分析。
1.3.5摇 质谱鉴定与数据库检索
从凝胶上切取差异蛋白质点,用胰蛋白酶于 37
益酶解 16 h,利用基质辅助激光解析电离飞行时间
质谱(MALDI鄄TOF鄄TOF MS,质谱仪器型号:ABI 5800
Proteomics Analyzer)对蛋白质进行鉴定。 将一级和
二级质谱数据整合并使用 GPS 3. 6 ( Applied
Biosystems)和 Mascot2.1(Matrix Science)对质谱数据
进行分析和蛋白鉴定,搜索参数如下:数据库为
NCBInr 绿色植物数据库(Viridiplantae),酶为胰蛋白
酶,允许最大漏切位点为 1,质量允许误差范围为 0.3
Da,在 Protein score C.I.%大于 95为鉴定成功。
1.3.6摇 生物信息学分析
依据 UniProtKB 数据库 ( http: / / www. uniprot.
org / )提供的蛋白质注释信息对蛋白质进行功能
分类[11]。
2摇 结果与分析
2.1摇 花生叶片蛋白质双向电泳图谱
花生叶片总蛋白质经 IEF / SDS鄄PAGE、银染和图
像扫描,获得了双向电泳图谱(图 1),可以看出,对
照(自然光照)与处理(UV鄄B 辐射增强)之间叶片蛋
白质在 2D胶上的分布基本一致。 用 PDQuest 8.0软
件对其进行分析,经自动检测和人工去除杂点后,从
对照和处理 2D 凝胶上分别得到 757 个和 779 个稳
定且重复性较好的蛋白质点。
图 1摇 自然光照(CK)和 UV鄄B辐射增强处理(UVE)下花生叶片蛋白双向电泳图谱
Fig.1摇 2鄄DE maps of total proteins from A. hypogaea leaves treated with ambient UV鄄B radiation (CK) and with UV鄄B radiation enhanced (UVE)
编号 1—39为差异表达蛋白点
2.2摇 UV鄄B辐射增强处理后花生叶片差异蛋白点的
比较
利用 PDQuest 8.0 软件对 2鄄DE 图谱进行分析,
发现一些蛋白质在对照与处理间的表达丰度存在明
显的差异。 以对照相对处理蛋白质丰度变化在 2.5
倍以上(或 0.4 倍以下)作为检测阈值,比较对照和
处理的 2鄄DE凝胶图谱,结果表明 UV鄄B 辐射增强处
理 24 h后的花生叶片中共有 39个蛋白质差异表达,
为便于蛋白点的比较及质谱鉴定,分别标记为 1—
39。 在 39个差异表达的蛋白质点中,UV鄄B 辐射增
强处理使得 22种蛋白质表达下调(图 1CK中箭头所
指蛋白质点),17 种蛋白表达上调(图 1UVE中箭头
所指蛋白质点),部分差异表达蛋白质点见图 2。
2.3摇 花生叶片差异表达蛋白点的质谱鉴定
经过胰蛋白酶酶解、MALDI鄄TOF鄄TOF 质谱分析
获得肽质量指纹图谱,将肽质量指纹图谱与多肽序
列标签数据提交 Mascot网站,选用 NCBInr数据库进
行检索,成功对 27 个差异表达蛋白质进行了鉴定,
表 1为各差异表达蛋白质点的质谱鉴定结果。
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图 2摇 部分差异表达蛋白点的放大比较
Fig.2摇 Enlarged images of partial differentially expressed protein spots
表 1摇 花生叶片差异表达蛋白质点的质谱鉴定结果
Table 1摇 Identification of differential proteins in peanut leaves by MALDI鄄TOF鄄TOF MS
功能
Function
蛋白点编号
Spot No.
登录号
Accession number
蛋白点名称
Protein name
分子量
Molecular weight
(Theo. / Exp.)
(kD)
等电点
Isoelectric point
(Theo. / Exp.)
得分
Score
物种
Species
表达调控
Regulation
光合作用 1 gi | 351727559 质体蓝素 16.55 / 16.40 4.82 / 3.24 177 大豆 Glycine max ¯
Photosynthesis 3 gi | 1079736 核酮糖鄄1,5鄄二磷酸羧化酶小亚基前体 19.98 / 16.43 8.80 / 3.95 374 野大豆 Glycine soja ¯
7 gi | 1079736 核酮糖鄄1,5鄄二磷酸羧化酶小亚基前体 19.98 / 16.73 8.80 / 4.14 374 野大豆 G. soja ¯
18 gi | 131386 放氧增强蛋白 1 35.25 / 37.50 5.58 / 5.42 616 菠菜 Spinacia oleracea ¯
22 gi | 356571888 PsbP 结构域蛋白 6 28.51 / 29.91 5.73 / 6.33 409 大豆 G. max ¯
37 gi | 351724481 果糖二磷酸醛缩酶 38.66 / 48.44 6.77 / 8.51 676 大豆 G. max ¯
糖代谢 32 gi | 37725953 苹果酸脱氢酶 37.39 / 40.85 7.01 / 8.29 699 豌豆 Pisum sativum ¯
Carbohydrate 33 gi | 2827080 苹果酸脱氢酶前体 36.00 / 44.28 8.80 / 7.97 634 紫花苜蓿Medicago sativa ¯
metabolism 36 gi | 37725953 推测的苹果酸脱氢酶 37.39 / 39.35 7.01 / 8.51 699 豌豆 P. sativum ¯
能量生物合成 9 gi | 356512762 ATP 合成酶 24kD亚基 29.98 / 32.23 8.87 / 5.16 300 大豆 G. max -
Energy 17 gi | 356563202 ATP 合成酶 啄链 27.44 / 24.70 5.98 / 5.94 256 花生 Arachis hypogaea ¯
biosynthesis 21 gi | 224145221 ATP 合成酶 啄链 26.94 / 25.14 6.02 / 6.52 378 毛果杨Populus trichocarpa ¯
氨基酸生物合成
Amino acid
biosynthesis
23 gi | 255567778 半胱氨酸合成酶 43.38 / 43.39 7.60 / 6.54 696 蓖麻 Ricinus communis -
蛋白质加工 14 gi | 399940 70kD热激蛋白 72.72 / 78.86 5.95 / 5.57 1264 菜豆 Phaseolus vulgaris -
Protein processing 16 gi | 123556 18.2kD热激蛋白 18.15 / 22.86 5.81 / 5.93 266 紫花苜蓿 M. sativa -
蛋白质翻译
Protein translation 38 gi | 356536011 核糖体循环因子 28.57 / 30.91 8.86 / 8.74 248 大豆 G. max ¯
防御蛋白 4 gi | 116330 酸性几丁质酶 31.70 / 33.09 4.90 / 3.49 587 赤豆 Vigna angularis -
Defence protein 31 gi | 1237027 几丁质酶(类型 II) 29.42 / 40.15 6.29 / 8.23 557 花生 A. hypogaea -
11 gi | 194466268 过氧化物酶 18.84 / 50.30 5.93 / 5.33 186 花生 A. hypogaea -
12 gi | 194466268 过氧化物酶 18.84 / 48.96 5.93 / 5.33 186 花生 A. hypogaea -
3952摇 10期 摇 摇 摇 杜照奎摇 等:花生叶片蛋白组对 UV鄄B辐射增强的响应 摇
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续表
功能
Function
蛋白点编号
Spot No.
登录号
Accession number
蛋白点名称
Protein name
分子量
Molecular weight
(Theo. / Exp.)
(kD)
等电点
Isoelectric point
(Theo. / Exp.)
得分
Score
物种
Species
表达调控
Regulation
15 gi | 71040665 Cu鄄Zn超氧化物歧化酶 15.20 / 18.05 5.27 / 5.42 284 花生 A. hypogaea ¯
24 gi | 357470923 二羟肉桂酸 3鄄O鄄转甲基酶 29.34 / 51.39 5.59 / 6.45 328 蒺藜苜蓿Medicago truncatula -
28 gi | 357513969 类萌发素蛋白 23.08 / 27.33 8.96 / 7.87 263 蒺藜苜蓿 M. truncatula ¯
35 gi | 357513969 类萌发素蛋白 23.08 / 27.93 8.96 / 8.30 263 蒺藜苜蓿 M. truncatula ¯
未知蛋白 6 gi | 359806300 非特征蛋白 37.88 / 55.00 4.53 / 3.41 664 大豆 G. max -
Unkown protein 30 gi | 255638833 未知蛋白 18.13 / 35.07 6.27 / 8.00 232 大豆 G. max ¯
34 gi | 351722815 非特征蛋白 21.17 / 21.49 8.74 / 8.69 280 大豆 G. max ¯
摇 摇 -代表蛋白质表达量上调;¯代表蛋白质表达量下调
图 3摇 27个鉴定蛋白功能分类图
Fig. 3 摇 The distribution of the 27 identified proteins by
functional category
摇 摇 依据 UniProtKB 数据库提供的蛋白质注释信
息,所鉴定的 27个叶片蛋白质按其功能可归为八类
(图 3)。 第玉类:光合作用相关的蛋白质 6 种,包括
质体蓝素(1 号)、1, 5鄄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基
(3 号和 7 号)、放氧复合物增强子蛋白 1(18 号)、
PsbP 结构域蛋白 6(22号)和果糖二磷酸醛缩酶(37
号);第域类:糖代谢相关蛋白质 3 种,包括苹果酸脱
氢酶(32、33 和 36 号);第芋类:能量合成相关蛋白
质 3种,包括 ATP 合酶(9、17 和 21 号);第郁类:氨
基酸代谢相关蛋白质 1 种,包括半胱氨酸合成酶(23
号);第吁类:蛋白质加工相关蛋白质 2 种,包括热激
蛋白(14和 16号);第遇类:蛋白质翻译相关蛋白质
1种,包括核糖体循环因子(38 号);第喻类:防御相
关蛋白质 8 种,包括酸性几丁质酶(4 和 31 号)、过
氧化物酶(11 和 12 号)、Cu鄄Zn 超氧化物歧化酶(15
号)、二羟肉桂酸 3鄄O鄄转甲基酶(24 号)和类萌发素
蛋白(28和 35 号);第峪类,未知功能蛋白质 3 种,
包括 6、30和 34号。
3摇 讨论
在质谱鉴定中,位置邻近的蛋白质点被鉴定为
同一种蛋白质(3 号和 7 号被鉴定为 1, 5鄄二磷酸核
酮糖羧化酶小亚基、17 号和 21 号均被鉴定为 ATP
合成酶d链、28和 35 号被鉴定为类萌发素蛋白),类
似的情况在小麦等作物中也存在,这可能是由于这
些蛋白质表达丰度过高,在等电聚焦和二向分离时
发生了位置偏移而造成的[12];当然也有可能是这些
蛋白质发生局部降解或存在翻译后修饰现象。 蛋白
质翻译后修饰在植物体内可以参与植物生长发育、
病理、非生物逆境应答等细胞信号转导过程,常见形
式有磷酸化、糖基化、甲基化和乙酰化等[13]。
本研究以油料作物花生为材料,运用差异蛋白
质组学技术试图从蛋白质表达水平揭示植物对 UV鄄
B 辐射增强响应的分子机制。 结果表明,室外补增
UV鄄B处理改变了花生叶片中与光合作用、糖代谢、
能量合成、氨基酸合成、蛋白质加工、蛋白质翻译和
防御蛋白等代谢相关蛋白的表达。
3.1摇 UV鄄B辐射增强对光合作用相关蛋白质的影响
光合作用光反应中光系统域(PS域)易受 UV鄄B
辐射损伤,尤其是反应中心的 D1(psbA 基因编码)和
D2(psbD 基因编码)蛋白,即使在非常低的 UV鄄B 辐
射剂量下它们都能够被降解。 UV鄄B 辐射下 PS域活
性与 psbA基因转录产物及其翻译产物 D1 蛋白的稳
定性密切相关[14]。 扫描电镜结果表明,UV鄄B 辐射
增强会破坏叶绿体的超微结构[4]、叶绿素荧光动力
4952 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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学研究表明遭受 UV鄄B辐射的植物叶片 PS域活性和
光合电子传递速率显著降低[15],从而降低其净光合
速率[6],但 UV鄄B 如何破坏叶绿体和类囊体结构以
及降低电子传递速率原因目前仍未明确。
PsbP 为构成 PS域的亚基,大小约 20.1kD,具有
与 Ca2+、Cl-和 Mg2+相结合的能力,对光合放氧具有
重要的作用[16]。 Yi 等[17]运用 RNA 干扰技术抑制
拟南芥 PsbP 蛋白的表达后(PsbP 的含量仅为对照
的 13%),结果发现叶绿体肿胀变圆,基粒类囊体内
径变大且垛叠无序,据此推断 PsbP 对于稳定类囊体
和叶绿体结构具有重要作用。 本研究发现 UV鄄B 辐
射后会引起花生叶片中 PsbP 结构域蛋白 6 表达量
的下调(蛋白质点 22),暗示 UV鄄B 或许通过下调
PsbP 的表达量进而破坏植物类囊体的结构,降低植
物的光合能力。
核糖体循环因子 ( ribosome recycling factor,
RRF)是蛋白质合成体系中核糖体循环再利用的关
键因子,对菠菜[18]和水稻[19]的研究结果表明,RRF
均由核基因编码,转录后被转运至线粒体或叶绿体
中发挥作用。 Wang 等[20]最近报道,拟南芥 RRF 突
变株 hfp108鄄1叶绿体类囊体膜系统发育不成熟,基
粒和基质类囊体模糊,免疫印迹发现:叶绿体蛋白,
如 D1、D2、CP43、CP47、PsbA 和 PsbB 等蛋白表达量
下降。 本研究中,试验组花生 RRF 表达量下调,同
时叶绿体蛋白 PsbP 表达量也出现下降,由此,我们
推测可能是 RRF 量的不足影响 PsbP 的表达量降
低,这需要试验进一步验证。
质体蓝素(plastocyanin,PC)于类囊体膜内表面,
是高等植物中为 Cytb6 / f 与光系统玉(PS玉)之间传
递电子的一种含铜离子的蛋白质,为光合电子传递
链中的重要成员[21]。 研究显示,PC(蛋白质点 1)在
UV鄄B辐射增强下表达下调,PC 含量的减少会影响
到类囊体膜上电子传递的效率,使植物同化作用
减弱。
核酮糖鄄1, 5鄄二磷酸羧化酶 ( Ribulose 1, 5鄄
bisphosphate carboxylase, Rubisco)催化卡尔文循环
中的羧化反应,UV鄄B 对 Rubisco 含量的影响较大,
Jordan等[22]用 UV鄄B 处理豌豆 3d 后,发现可溶性蛋
白质下降了 33%,其中 Rubisco 小亚基含量下降了
56%,定量 PCR 检测发现 Rubisco 小亚基 mRNA 在
处理 4小时后下调量高于 20%,时间更长甚至检测
不出。 果糖鄄1, 6鄄二磷酸醛缩酶 ( fructose鄄1, 6鄄
bisphosphate aldolase, FBA)也是控制光合碳同化速
率的重要酶之一。 Uematsu等[23]将拟南芥 FBA基因
转入烟草后,促进了 RuBP 的生成并提高了光合速
率,Hatano鄄Iwasaki 和 Ogawa[24]研究表明,转化 FBA
基因的拟南芥也能显著提高 CO2同化速率。 本研究
表明,UV鄄B辐射降低了花生卡尔文循环中 Rubisco
(蛋白质点 3和 7)和 FBA(蛋白质点 37)两种酶的含
量,这或许是对光合作用碳循环影响的主要因素。
3.2摇 防御相关蛋白质对 UV鄄B辐射增强的响应
大多数学者认为,紫外吸收物质(如:类黄酮、花
色素苷和类胡萝卜素等)含量的诱导增加是植物应
对 UV鄄B辐射的重要防御机制,它们在植物应对 UV鄄
B辐射方面的重要性逐渐被证实。 但也有研究表
明[25],UV鄄B辐射拟南芥使得叶片中芥子酰葡萄糖
和芥子酰苹果酸含量提高,说明芥子酸酯在植物响
应 UV鄄B 辐射过程中起重要作用。 二羟肉桂酸 3鄄O鄄
转甲基酶(caffeic acid 3鄄O鄄methyltransferase, COMT)
可催化 5鄄羟基阿魏酸甲基化生成芥子酸[26],本研究
表明,花生也有可能通过 COMT(蛋白质点 24)的上
调来提高芥子酸的生成,进而大量合成芥子酸酯达
到保护植株的目的,这与 Mei覻ner 等[27]认为芥子酰
苹果酸只是在植物受到 UV鄄B 辐射初期能及时地起
到保护作用较为相似。 此外,COMT 也可催化 5鄄羟
基松柏醇甲基化生成芥子醇,芥子醇是构成木质素
的重要成分,因而 COMT 对木质素的合成具有调控
作用。 紫外线照射梁平柚(Citrus grandis L.)后,柚
皮中 COMT 基因转录水平显著提高[28],且 Yamasaki
等[29]研究表明植物在接受 UV鄄B 辐射增强处理后,
叶片中木质素含量较对照显著提高。 本研究发现试
验组花生叶片中 COMT 表达量上调,可能会加速叶
片中木质素的合成,木质素或许对于抵御紫外线的
辐射具有一定的作用。
UV鄄B对植物的伤害,其中重要的一条途径就是
产生活性氧(如:O·-2 , H2O2和·OH),对膜系统的过
氧化损伤[30]。 为抵御活性氧对植物产生的毒害作
用,植物可通过抗氧化酶类或非酶抗氧化系统对活
性氧进行清除。 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物
酶(POD)能有效清除植物体内的 O·-2 和 H2O2,抗坏
血酸鄄谷胱甘肽(AsA鄄GSH)也是消除 H2O2的重要成
分。 本研究发现,试验组花生叶片中 POD(蛋白质点
5952摇 10期 摇 摇 摇 杜照奎摇 等:花生叶片蛋白组对 UV鄄B辐射增强的响应 摇
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11和 12)含量上升,半胱氨酸合成酶(蛋白质点 23)
表达量上调,使得半胱氨酸和 GSH 的含量可能增
加,表明花生清除 H2O2的能力得到了提高;但 Cu /
Zn鄄SOD(蛋白点质 15)含量下降,说明清除 O·-2 的能
力遭到破坏,花生膜系统可能受到较为严重 O·-2
胁迫。
类萌发素蛋白(GLPs)以糖蛋白的形式结合存
在于细胞外基质中,可以催化草酸氧化产生过氧化
氢。 过氧化氢能够使植物初生壁中木聚糖交联,令
细胞壁更为致密;同时还可诱导与抗性有关的基因
表达,从而使植物对不良环境胁迫产生抗性[31]。 将
辣椒(Capsicum chinense Jacq.) GLPs 基因转入烟草
(Nicotiana tabacum Xanthi nc)后,提高了烟草对双生
病毒的抗性[32],过表达 GLPs 基因也可让甘蓝型油
菜阻止核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的感染[33],沉
默烟草中的 GLP 基因后,则提高了烟草天蛾
(Manduca sexta)的取食偏好性[34]。 本研究发现试
验组中 GLP(蛋白质点 28 和 35)表达下调,这暗示
着随着环境中 UV鄄B 辐射增强,花生抵抗病毒、细菌
感染或采食天敌等方面的能力可能会下降。
病程相关蛋白(PR)是植物受到病原菌侵染或
环境因素刺激时会产生多种抗性蛋白,在增强植物
抗性方面发挥重要作用,其中,几丁质酶和b鄄1, 3鄄葡
聚糖酶是两类重要的 PR 蛋白[35]。 几丁质酶
(Chitinase)是一类水解几丁质单体 N鄄乙酰鄄D鄄葡糖
胺之间糖苷键的酶[36],花生易遭受锈病、叶斑病和
茎腐病等病害的侵袭,这些病的病原菌均为真菌,由
于其细胞壁中存在着丰富的几丁质,UV鄄B 辐射增强
处理后,花生叶片中几丁质酶(蛋白质点 4 和 31)表
达上调,意味着花生抵御真菌侵染的能力可能会得
到提高。
此外,本研究中,试验组热激蛋白 HSP18.2(蛋
白质点 16)和 HSP70(蛋白质点 14)表达上调,推测
花生可能通过上调表达 HSP 来促进细胞质或细胞核
内新生蛋白质的折叠、组装及跨膜运输等,以此应对
UV鄄B对植株的不利影响,与本研究类似,Du 等[37]
用 UV 处理水稻后,也发现 HSP70 表达上调,而
Murakami等[38]将来自水稻的 HSP17.1 转入水稻中
后发现其抵抗 UV鄄B的能力较对照组显著提高。
综上所述,UV鄄B辐射增强引起花生叶片光合作
用下降的原因主要有三方面:首先可能是由于 UV鄄B
引起叶片核糖体循环因子表达量下调,导致 PS域的
亚基 PsbP 表达量下降,从而破坏植物类囊体的结
构;其次可能是质体蓝素含量下降引起光合电子传
递效率降低;第三则可能是由于核酮糖鄄1, 5鄄二磷酸
羧化酶和果糖鄄1, 6鄄二磷酸醛缩酶表达量降低导致
碳同化能力下降。 同时,花生也可能通过提高抗氧
化酶或非酶抗氧化物质、类萌发素蛋白、病程相关蛋
白和热激蛋白等的表达量来抵御 UV鄄B 胁迫。 在后
续的研究中,将对某些感兴趣差异表达的蛋白质的
编码基因进行克隆,构建表达载体转化花生,进一步
明确其在抵御 UV鄄B过程中的具体作用及分子机制,
为今后培育抗 UV鄄B辐射的花生品种提供理论依据。
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8952 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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叶生态学报曳圆园员源年征订启事
叶生态学报曳是由中国科学技术协会主管袁中国生态学学会尧中国科学院生态环境研究中心主办的生态学
高级专业学术期刊袁创刊于 员怨愿员年袁报道生态学领域前沿理论和原始创新性研究成果遥 坚持野百花齐放袁百家
争鸣冶的方针袁依靠和团结广大生态学科研工作者袁探索生态学奥秘袁为生态学基础理论研究搭建交流平台袁
促进生态学研究深入发展袁为我国培养和造就生态学科研人才和知识创新服务尧为国民经济建设和发展服务遥
叶生态学报曳主要报道生态学及各分支学科的重要基础理论和应用研究的原始创新性科研成果遥 特别欢
迎能反映现代生态学发展方向的优秀综述性文章曰研究简报曰生态学新理论尧新方法尧新技术介绍曰新书评价和
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本期责任副主编摇 祖元刚摇 摇 摇 编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
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主摇 摇 编摇 王如松
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