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\摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 31 卷 第 18 期摇 摇 2011 年 9 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
高寒矮嵩草草甸冬季 CO2释放特征 吴摇 琴,胡启武,曹广民,等 (5107)………………………………………
开垦对绿洲农田碳氮累积及其与作物产量关系的影响 黄彩变,曾凡江,雷加强,等 (5113)……………………
施氮对几种草地植物生物量及其分配的影响 祁摇 瑜,黄永梅,王摇 艳,等 (5121)………………………………
浙江天台山甜槠种群遗传结构的空间自相关分析 祁彩虹,金则新,李钧敏 (5130)……………………………
大兴安岭林区不同植被对冻土地温的影响 常晓丽,金会军,于少鹏,等 (5138)…………………………………
樟子松树轮不同组分的稳定碳同位素分析 商志远,王摇 建,崔明星,等 (5148)…………………………………
内蒙古不同类型草地叶面积指数遥感估算 柳艺博,居为民,朱高龙,等 (5159)…………………………………
杭州西湖北里湖荷叶枯落物分解及其对水环境的影响 史摇 绮,焦摇 锋,陈摇 莹,等 (5171)……………………
火干扰对小兴安岭落叶松鄄苔草沼泽温室气体排放的影响 于丽丽,牟长城,顾摇 韩,等 (5180)………………
黄河中游连伯滩湿地景观格局变化 郭东罡,上官铁梁,白中科,等 (5192)………………………………………
黄土区次生植被恢复对土壤有机碳官能团的影响 李摇 婷,赵世伟,张摇 扬,等 (5199)…………………………
我国东北土壤有机碳、无机碳含量与土壤理化性质的相关性 祖元刚,李摇 冉,王文杰,等 (5207)……………
黄土旱塬裸地土壤呼吸特征及其影响因子 高会议,郭胜利,刘文兆 (5217)……………………………………
宁南山区典型植物根际与非根际土壤微生物功能多样性 安韶山,李国辉,陈利顶 (5225)……………………
岩溶山区和石漠化区表土孢粉组合的差异性———以重庆市南川区为例 郝秀东,欧阳绪红,谢世友 (5235)…
夏蜡梅及其主要伴生种叶的灰分含量和热值 金则新,李钧敏,马金娥 (5246)…………………………………
苏柳 172 和垂柳对 Cu2+的吸收特性及有机酸影响 陈彩虹,刘治昆,陈光才,等 (5255)………………………
导入 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性 张丽君,程林梅,杜建中,等 (5264)………………………
空气湿度与土壤水分胁迫对紫花苜蓿叶表皮蜡质特性的影响 郭彦军,倪摇 郁,郭芸江,等 (5273)……………
黄土高原旱塬区土壤贮水量对冬小麦产量的影响 邓振镛,张摇 强,王摇 强,等 (5281)…………………………
咸阳地区近年苹果林地土壤含水量动态变化 赵景波,周摇 旗,陈宝群,等 (5291)………………………………
苗药大果木姜子挥发油成分变化及其地理分布 张小波,周摇 涛,郭兰萍,等 (5299)……………………………
环境因子对小球藻生长的影响及高产油培养条件的优化 丁彦聪,高摇 群,刘家尧,等 (5307)…………………
不同基质对北草蜥和中国石龙子运动表现的影响 林植华,樊晓丽,雷焕宗,等 (5316)…………………………
安徽沿江浅水湖泊越冬水鸟群落的集团结构 陈锦云,周立志 (5323)……………………………………………
黑胸散白蚁肠道共生锐滴虫目鞭毛虫的多样性分析与原位杂交鉴定 陈摇 文,石摇 玉,彭建新,等 (5332)……
基于熵权的珠江三角洲自然保护区综合评价 张林英,徐颂军 (5341)……………………………………………
专论与综述
中小尺度生态用地规划方法 荣冰凌,李摇 栋,谢映霞 (5351)……………………………………………………
土地利用变化对土壤有机碳的影响研究进展 陈摇 朝,吕昌河,范摇 兰,等 (5358)………………………………
海洋浮游植物与生物碳汇 孙摇 军 (5372)…………………………………………………………………………
多年冻土退化对湿地甲烷排放的影响研究进展 孙晓新,宋长春,王宪伟,等 (5379)……………………………
生源要素有效性及生物因子对湿地土壤碳矿化的影响 张林海,曾从盛,仝摇 川 (5387)………………………
生态网络分析方法研究综述 李中才,徐俊艳,吴昌友,等 (5396)…………………………………………………
研究简报
不同群落中米氏冰草和羊草的年龄结构动态 金晓明,艾摇 琳,刘及东,等 (5406)………………………………
主题分辨率对 NDVI空间格局的影响 黄彩霞,李小梅,沙晋明 (5414)…………………………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*314*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*35*
室室室室室室室室室室室室室室
2011鄄09
封面图说: 在树上嬉戏的大熊猫———大熊猫是中国的国宝,自然分布狭窄,数量极少,世界上仅分布在中国的四川、陕西、甘肃
三省的部分地区,属第四纪冰川孑遗物种,异常珍贵。 被列为中国国家一级重点保护野生动物名录,濒危野生动植
物种国际贸易公约绝对保护的 CITES附录一物种名录。 瞧,够得上“功夫熊猫冶吧。
彩图提供: 陈建伟教授摇 国家林业局摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 31 卷第 18 期
2011 年 9 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 31,No. 18
Sep. ,2011
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08003鄄017B);山西省农科院攻关项目(Ygg0912)
收稿日期:2011鄄03鄄30; 摇 摇 修订日期:2011鄄07鄄11
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: li鄄gui鄄quan@ 126. com;sunyi692003@ yahoo. com. cn
张丽君,程林梅,杜建中,郝曜山,王亦学,李贵全,孙毅.导入 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性.生态学报,2011,31(18):5264鄄5272.
Zhang L J,Cheng L M,Du J Z,Hao Y S,Wang Y X, Li G Q,Sun Y. Introduction of TaNHX2 gene enhanced salt tolerance of transgenic puna chicory
plants. Acta Ecologica Sinica,2011,31(18):5264鄄5272.
导入 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性
张丽君1,2,程林梅2,杜建中2,郝曜山2,王亦学2,李贵全1,*,孙摇 毅1,2,*
(1. 山西农业大学,太谷摇 030081;2. 山西省农业科学院生物技术研究中心,太原摇 030031)
摘要:我国部分地区土地盐碱化的日益严重,对作物的生长和生态环境产生了显著影响,因此通过植物基因工程手段培育耐盐
碱的转基因作物品种对改善作物的生存能力和生态环境,提高作物产量具有重要的意义。 采用农杆菌介导法将来自小麦
(Triticum aestivum Linn)的 Na+ / H+逆向转运蛋白的基因(vacuolar Na+ / H+ exchanger or antiporter,简称 NHX、NHE或 NHA),对普
那菊苣(Cichorium intybus L. cv. Puna)植株进行了遗传转化。 经抗生素筛选以及针对 TaNHX2 基因的 PCR检测和 Southern杂交
分析,证明获得了 28 株转 TaNHX2 基因的普那菊苣植株。 用不同浓度 NaCl溶液对普那菊苣野生型和 T0代种子、愈伤组织和幼
苗生长情况胁迫的研究,结果表明:转 TaNHX2 基因普那菊苣植株表现出一定的抗性,比野生型明显提高。 在 300 mmol / L NaCl
胁迫下转基因植株种子的出芽率、外植体出愈率和分化率是野生型植株的 2—4 倍,而 500 mmol / L NaCl浓度为野生型和转基因
外植体能否生长的临界点。 在此临界值下野生型外植体或不能形成愈伤组织、或幼苗不能正常生根、或已生根幼苗不能正常成
长,而转基因外植体可以继续形成愈伤组织并正常生根生长。 同时对 500 mmol / L NaCl 胁迫下野生型和转基因普那菊苣幼苗
其体内丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶( POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定,结果表明 转基因植株比野生型植株的
MDA含量降低了 1—3 倍,POD活性提高了 1—3 倍,SOD活性提高了 2—3 倍,分析发现普那菊苣的耐盐性与其体内的丙二醛
含量(MDA)、过氧化氢酶( POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性密切相关。
关键词: 普那菊苣; TaNHX2; 转基因; 耐盐性
Introduction of TaNHX2 gene enhanced salt tolerance of transgenic puna chicory
plants摇
ZHANG Lijun1,2,CHENG Linmei2,DU Jianzhong2,HAO Yaoshan2,WANG Yixue2, LI Guiquan1,*,SUN Yi1,2,*
1 Shanxi Argriculture University Taigu 030081,China
2 Biotechnology Research Center,Shanxi Academy of Agricultural Sciences Taiyuan 030031,China
Abstract: The growing severity of land salinization and alkalization in some areas of China has resulted in adverse impacts
on crop production and agriculture鄄ecological environment. Soil salinity is one of the major limiting factors affecting crop
growth, development and yield in arid and semiarid regions of China. Therefore, breeding for saline and alkaline tolerant
crop varieties through genetic engineering approaches is of great significance for improving the crop survivability in saline
and alkaline conditions and ecological environment, as well as for enhancing crop production. With the development of
molecular biology and genetic transformation technology, numerous genes related to saline and alkaline tolerances have been
found and cloned. Introduction of these genes into various plants has achieved rapid improvement of their tolerances saline
and alkaline conditions. Cichorium intybus L. cv. Puna. belonging to Asteraceae family is commonly known as witloof
cichory and widely distributed in northern, and central China. In this study, a wheat (Triticum aestivum Linn) vacuolar
Na+ / H+ exchanger gene ( TaNHX2), in connection with plant salt tolerance, was introduced into puna chicory using
Agrobacterium鄄mediated transformation approach. Puna chicory leaf segments were precultured for 2—3 days before being
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co鄄cultivated with the Agrobacterium strain, pBin438鄄TaNHX, which containing the target gene2 Transformed buds were
selected on the MS medium containing kanamycin (80mg / L) and Cefalexin (1000mg / L), and 28 putative transgenic lines
were obtained and used for further molecular and biological assay. Analysis of the transgenic plants was performed by using
PCR and Southern blot hybridization, which proved that the wheat vacuolar Na+ / H+ exchanger gene was successfully
integrated into puna chicory genome. Effects of NaCl concentration on growth of wild type and T0 seed germination, callus
induction and seedling growth were investigated. The results indicated that transgenic puna chicory explants tolerated certain
concentrations of NaCl up to 500 mmol / L, which was much higher than that of the wild type. Under 300 mmol / L NaCl
stress, the transgenic seeds germinating rate,callus induction rate and bud regeneration rate were 2—4 times higher than the
wide type. NaCl concentration of 500 mmol / L was the maximum amount for the survival of wide type puna chicory plantlets,
under which transgenic explants could form calli, buds, and roots, and grow normally but the wild type explants could
not. . We also measured the contents of malonaldehyde ( MDA), and activities of peroxidase ( POD) and superoxide
dismutase (SOD) in transgenic puna chicory seedlings and its wild counterpart. Under the stress of 500 mmol / L NaCl the
MDA content was decreased by 1—3 times, superoxide dismutase ( SOD) activity was increased by 2—3 times and
peroxidase (POD) activity was increased by 1—3 times compared with those in wide type plants. The decrease of MDA
content in transgenic puna chicory seedlings was negatively correlated and the increases of the enzyme activities in them
were positively correlated with their tolerance to NaCl. Above all, we can make a conclusion that salt鄄tolerant transgenic
puna chicory plants, could be obtained by introducing wheat vacuolar Na+ / H+ exchanger gene into by plant engineering
approaches.
Key Words: Puna chicory; TaNHX2;genetic transformation;salt tolerance
土壤盐碱化是影响生态环境和农业生产的重要问题。 我国西北地区自然条件恶劣,生态环境脆弱,干旱
少雨,土壤盐碱化严重,许多地方年降雨量不足 300mm,属于干旱、半干旱区域。 近几十年来,更是由于过度
放牧、不合理开垦、滥采滥伐等原因,造成我国 3 亿 hm2 草地中有 0. 8 亿 hm2 草地严重盐碱化、沙化、退化,使
原本就脆弱的生态环境遭到毁灭性的破坏,严重制约我国畜牧业的发展,影响人民生活水平的提高。 改善西
部生态环境的重点是恢复林草植被,防止水土流失,加快加强生态环境保护和建设。 目前西北地区可利用的
优良牧草品种较少,品种更新慢是牧草生产存在的主要问题之一。 如何开垦和利用这些盐碱化土壤,并在短
期内培育出适合于我国西北部地区栽培的抗干旱、耐盐碱的牧草新品种,是当前农业生产中的亟需解决的重
要问题。 随着分子遗传学和植物转基因技术的快速发展,通过基因工程手段将外源优良基因导入栽培作物品
种中,可以打破物种之间杂交不亲和的界限,具有高效性和针对性,可弥补常规育种技术的不足,缩短育种周
期。 因此利用基因工程育种技术可加速选育出优质、抗逆的转基因牧草新品种,满足我国西北地区生态建设
和畜牧业生产的需求。
高等植物 Na+ / H+逆向转运蛋白存在于质膜和液泡膜上,分别称为 P型和 V型;分别利用 P 型 H+ 鄄ATPase
和 V型 H+ 鄄ATPase及 V 型 H+ 鄄PPase 建立的跨膜质子梯度作为驱动力,驱动 Na+运出细胞或区域化在液
泡[1鄄2],特别是在高盐生境下维持细胞质 Na+稳态和 Na+ / K+相对稳定,减少 Na+对胞质中细胞器的毒害;同时,
区隔化在液泡中的 Na+降低了细胞的渗透势,促使细胞从外界胁迫环境中吸水以继续维持渗透平衡[3],因此
具有增强植物适应盐胁迫的功能。
普那菊苣(Cichorium intybus L. cv. Puna)为菊科(Asteraceae)菊苣属(Cichorium)双子叶植物。 普那菊苣是
一种营养丰富的牧草,同时具有药用和食用价值。 其干物质中富含蛋白、矿物质元素、氨基酸、微量元素等,更
重要的是含有一些生物化学成分:马栗树皮素、马栗树皮甙、野莴苣甙、山莴苣素和山莴苣苦素等特殊成分,是
其他牧草植物所不具有的。 药理和化学成分研究表明普那菊苣中的这些物质具有防治黄胆性肝炎、心血管疾
病和骨质疏松症等功效[4]。 普那菊苣在我国分布较广,主要集中在西北、华中、华北、东北地区。 这些地区都
5625摇 18 期 摇 摇 摇 张丽君摇 等:导入 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性 摇
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比较干旱,且盐碱地面积较大,对普那菊苣产量的提高有一定限制。 因此通过基因工程手段提高普那菊苣的
耐旱、耐盐能力具有较大的应用价值。 目前国内对由农杆菌介导的普那菊苣遗传转化报道甚少,本研究试图
通过农杆菌介导法将来自小麦(Triticum aestivum Linn)的 Na+ / H+逆向转运蛋白 TaNHX2 基因转入普那菊苣
中[5];同时研究外源基因的转化对普那菊苣耐盐性的影响,为普那菊苣在盐碱地区的栽培奠定基础。
1摇 材料和方法
1. 1摇 植物材料及供体质粒
供试材料为普那菊苣二倍体(2n=2x=18),种子由山西农科院畜牧兽医研究所提供。 小麦 TaNHX2 基因
载体由中国科学院遗传发育研究所 803 组陈受宜研究员提供,质粒名称为 pBin438鄄TaNHX2;启动子:
CaMV35S,终止子:Nos。 农杆菌菌株是 LBA4404,标记基因为卡那霉素(Km),筛选基因为 Km和利福平(rif),
质粒图谱见(图 1)。
Hind BamH Ⅰ EcoR
R L
35s Na-Hantiporter(TaNHX2) UTT
Sal
Kpn
图 1摇 质粒 pBin438鄄TaNHX2 构建图谱
Fig. 1摇 The map of pBin438鄄TaNHX2 expression vector used in the study
1. 2摇 农杆菌介导法转化普那菊苣及再生苗的获得
将普那菊苣的无菌苗叶片切块在 MS固体培养基上预培养 2—3d,并将普那菊苣叶片切块浸泡在对数生
长期农杆菌(OD600约为 0. 4—0. 6),继而在含 0. 2 mg / L IBA和 2. 0 mg / L6鄄BA的MS固体培养基上共培养 2d,
然后转入含 0. 2mg / L IBA、2. 0mg / L 6鄄BA、60mg / L Km 和 1000mg / L 头孢霉素(cef)的 MS 固体筛选培养基上
培养,待不定芽长至 1cm时,转移到含 80mg / LKm素和 1000mg / L cef的 MS培养基上生根。
1. 3摇 Km抗性植株的 PCR分析和 Southern杂交分析
取野生型及转基因处理后再生的 Km 抗性苗叶片,采用 CTAB 法[6]提取总 DNA,以 Primer 1: 5忆鄄
atggggtaccaagtggtggc鄄3忆; Primer 2: 5忆鄄taaacactccaaggaaggtg鄄3忆,为引物,提取的 DNA 为模板,采用 95益预变性
2min,95益变性 30s,56益退火 50s,72益延伸 50s,30 个循环后,于 72益延伸 10 min,产物片段长度为 700 bp。
为进一步证实 PCR扩增结果的可靠性,提取未转化植株和 PCR 阳性植株叶片总 DNA 进行 Southern 杂
交,以含有外源基因的质粒 DNA为阳性对照。 以限制性内切酶 Hind芋酶切 20滋g 总 DNA,37益温浴过夜。 以
地高辛(Digoxigenin (DIG)鄄dUTP)标记的 TaNHX2 基因片段为探针,杂交温度为 68益,过夜。 以 CSPD (4鄄
methoxyspiro {1,2鄄dioxetane鄄3,2忆鄄 (5忆鄄 chloro)tricyclo [3. 3. 1. 1] decan)鄄4鄄yl } phenyl phosphate (CSPD)为发
光底物。 具体操作根据 Southern 试剂盒(The Dig DNA Labeling and Detection试剂盒)操作手册进行,CSPD购
于 Boehringer Mannheim Co. Ltd, Germany。 探针制备方法如下:
扩增体系摇 buffer 2滋l;dNTP (地高辛标记) 4滋L;p1 0. 8滋L;p2 0. 8滋L;Taq (2u / uL) 1滋L;ddH2O 10. 4;
template(质粒 DNA) 1滋L。
扩增程序摇 94益 5min; 94益 30s;56益 50s; 72益 50s;72益 10min;30cycles。
1. 4摇 普那菊苣盐胁迫处理方法
转基因植株的耐盐性按下述指标进行分类:1 级高抗叶片表现为深绿色,植株生长正常;2 级抗性植株生
长正常,叶色绿色,叶尖稍有卷曲;3 级中抗植株生长缓慢,叶色淡绿色,叶片卷曲;4 级不抗生长停滞,叶色发
黄,叶片萎蔫直致死亡。 用 400mmol / L的 NaCl对 28 株转基因植株和 28 野生型植株进行耐盐性等级分析,并
在后续的耐盐实验中所选用转基因植株均为高抗的转基因株系。
6625 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
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将野生型和转基因 T0代的种子用 75%酒精浸泡 1—2min,0. 1%的升汞浸泡 10min,经蒸馏水冲洗数次后
用滤纸吸干,挑选健康而饱满的种子置于铺有 2 层定性滤纸的培养皿(直径为 10cm)中,分别滴加处理液至饱
和,每皿 50 粒,重复 3 组。 实验设置 5 个 NaCl 处理梯度:0(CK)、100、300、500、700、900mmol / L,恒温培养箱
中培养(25益,12h 光照,12h 黑暗),每天更换处理液以保持处理浓度不变。 从处理的第 3 天开始,每天
10:00—10:30 记录每个培养皿中的发芽种子数。
选取未转化苗和已鉴定含有 TaNHX2 基因的 5 个 T0代转基因株系,分别做以下处理:
淤 诱导得到其愈伤组织(愈伤组织编号与其外植体转基因株系编号相同)每组处理 20 块,设 3 组重复,
观察愈伤组织和芽的分化状态;
于 取 1cm左右的芽尖组织(芽尖组织编号与其外植体转基因株系编号相同)每组处理 5 个,设 3 组重复,
观察叶片的生长情况和是否能够生根及其生长状态
盂 已生根 20d左右的植株(与其外植体转基因株系编号相同)每组处理 5 个,设 3 组重复,观察叶片和根
的生长情况
它们分别在 100、300、500、700、900mmol / LNaCl的 MS固体培养基上光照培养(25益,12h光照,12h黑暗)
30d,以正常 MS培养基为对照。
取 1cm左右的芽尖组织(每个株系做 20 个重复),在 500mmol / L NaCl 的 MS 固体培养基上光照培养
(25益,12h光照,12h黑暗)。 20d后测定各株系的根长,根重和鲜重。
选取在实验室抗性试验中表现较好的 T0代转 TaNHX2 基因 5 个株系的阳性植株幼苗扩繁,将在 MS 培养
基中生长 2d的幼苗移栽至直径 10cm、高 10cm的塑料营养钵中,蛭石作基质,培养 30d左右,然后移栽至花盆
当中,2 周后进行旱胁迫处理。 实验设 5 个处理,NaCl 浓度为 100、300、500、700、90mmol / L 以蒸馏水为对照。
每组处理 20 株,设 5 组重复,光照培养 30d,观察植株的生长情况。
1. 5摇 生理指标的测定
转基因植株与野生型植株选取同一苗龄的组培苗,用 NaCl浓度为 500mmol / L处理 24h后,观察其抗性表
现,并对其 SOD活性、POD活性以及 MDA含量进行测定[7]。
1. 6摇 统计分析
试验数据采用 Excel 2003 及用 DPS软件进行方差分析,显著水平 0. 05。
2摇 结果与分析
2. 1摇 转 TaNHX2 基因植株的获得和鉴定
利用农杆菌介导法转入普那菊苣,经转化处理的外植体在筛选培养基上经过 2 周左右的分化培养,普那
菊苣的外植体边缘开始出现抗性再生芽,培养约 1 个月后,许多外植体无法再生,或产生的再生芽在随后的培
养中白化死亡。 将经 60mg / LKm筛选而再生成的抗性芽长至 0. 5—1. 0cm 时接种在含有 80 mg / LKm 的生根
培养基上培养,1 周后即可观察到白苗的产生。
用目的基因 TaNHX2 的特异引物对卡那筛选阳性的普那菊苣植株 DNA进行 PCR检测,共有 28 株扩增出
预期大小(700 bp)的片段,野生型植株没有扩增出该片段(图 2),初步证明 TaNHX2 基因已成功地转入普那
菊苣。
为明确外源 TaNHX2 基因在普那菊苣基因组中的整合拷贝数,对部分 PCR 鉴定阳性植株的总 DNA 酶切
产物进行电泳转膜,以标记的 TaNHX2 基因探针与其进行 Southern杂交。 结果发现 1 株有 2 条杂交带,3 株各
有 1 条杂交带,1 株有 3 条杂交带,野生型植株无杂交信号,表明外源基因已整合到普那菊苣基因组的 DNA
中,且外源基因多以单拷贝形式插入(图 3)。
2. 2摇 普那菊苣 NaCl 胁迫下的生长
实验结果显示,用 400mmol / L 的 NaCl 对 28 株转基因植株和 28 野生型植株进行抗盐性分析,28 株转基
因植株中有 23 株表现为高抗,3 株表现为抗性,2 株表现为中抗;而野生型植株 3 株表现为中抗和 25 株表现
7625摇 18 期 摇 摇 摇 张丽君摇 等:导入 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性 摇
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为不抗。
M P 1 2 3 4 5 6 7 8
2000
1000750
500
250
100
700bp
图 2摇 转化植株的 PCR检测
Fig. 2摇 Detection of transgenic plants by PCR
M:DL2000 maker;P:阳性对照,-:阴性对照;1—8:转基因植株
P — 1 2 3 4 5
图 3摇 转基因植株的 Southern blot 鉴定
Fig 3摇 Southern blot hybridization of transgenic plant DNA
P:阳性对照;—:阴性对照;1—5:转基因植株
低浓度处理(NaCl<300mmol / L)对种子萌发、愈伤组织形成的抑制相对较弱(表 1),其发芽率、出愈率和
分化芽数下降相对比较缓和,处理间的发芽率、出愈率和分化芽数差异不显著;随着处理浓度的升高,当
500mmol / L逸NaCl逸300 mmol / L时,野生型和转基因 T0代的种子、外植体受抑制程度增强,其发芽率下降幅度
增大,到 500mmol / L 时,野生型种子发芽率基本降为 0;野生型外植体不能形成愈伤组织并且叶片呈现淡黄
色,随着 NaCl(900mmol / L逸 NaCl >500mmol / L)浓度的继续增加,野生型外植体变黄并死亡,转基因外植体可
以继续形成愈伤组织。 当 NaCl浓度增加到 900mmol / L 时,转基因外植体仍然可以形成愈伤组织,但是已经
不能形成芽点。
表 1摇 不同 NaCl浓度组合对出芽率、愈伤诱导和芽分化的影响
Table 1摇 Effects of NaCl on the induction of callus and bud differentiation
NaCl 浓度
The concentration
of NaCl solution / (mmol / L)
种子出芽数
No. of buds
愈伤组织数
No. of callus
分化芽数
No. of seedlings
野生型 100 26. 52 依 1. 66 b 14. 52 依 1. 97 a 21. 71 依 2. 52 b
Wide type 300 3. 09 依 2. 21 c 7. 57 依 1. 67 b 13. 97 依 1. 13 c
500 0 依 0 d 1. 73 依 0. 98 cd 2. 06 依 0. 74 de
700 0 依 0 d 0 依 0 d 0 依 0 e
900 0 依 0 d 0 依 0 d 0 依 0 e
转基因 100 33. 43 依 3. 21 a 16. 13 依 2. 67 a 29. 69 依 2. 64 a
Transgenic 300 12. 54 依 4. 89 b 13. 60 依 2. 67 a 24. 10 依 2. 74 b
500 5. 51 依 0. 98 c 6. 33 依 1. 96 b 11. 97 依 3. 49 c
700 0 依 0 d 4. 03 依 1. 71 bc 6. 46 依 1. 71 d
900 0 依 0 d 1. 65 依 0. 91 cd 3. 66 依 1. 54 de
摇 摇 同一列中右侧字母字母不同表示差异显著(P<0. 05)
NaCl胁迫下普那菊苣幼苗表现如下:NaCl臆300mmol / L 时,野生型幼苗叶片由平展伸直、墨绿色渐变为
萎蔫、淡绿色,可以正常生根生长,生长成发达的根系;当 500mmol / L逸NaCl >300mmol / L时,野生型幼苗叶片
呈现黄绿色,卷曲,变形,不能正常生根;而转基因普那菊苣植株的叶片面积在盐胁迫下虽然也有一定程度的
缩小渐变为细窄形,但是仍然能够较为正常地生长,叶片也依然浓绿,且能够正常生根,生长成发达的根系。
8625 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
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在此浓度下野生型幼苗叶子根据统计分析结果可以看出,转基因外植体的耐盐性显著高于野生型外植体(P<
0. 05)。 当 700mmol / L逸NaCl >500mmol / L时,野生型幼苗叶片枯黄、死亡;转基因幼苗叶片生长速度减慢,叶
片颜色开始变淡,生根缓慢;当 900mmol / L逸NaCl >700mmol / L 时,转基因幼苗叶片变黄、卷曲、变形,颜色变
为淡黄绿色,根系不能正常生长。 在对 5 个转基因普那菊苣株系幼苗的观察中发现,它们对 NaCl浓度的耐受
力也存在着一些微小的差异,可能与外源基因的拷贝数和插入位点有一定的关系。 综述所述,500mmol / L 的
NaCl是野生型幼苗可以承受的最大浓度,900mmol / L 的 NaCl是转基因幼苗可以承受的最大浓度。 NaCl胁迫
下普那菊苣生根幼苗与未生根幼苗结果相似,
对含有 TaNHX2 基因的普那菊苣 T0代转基因阳性植株盆栽作 NaCl处理,结果与实验室相结果一致。 低
浓度处理(NaCl臆300mmol / L)时,对植株的抑制相对较弱,当 NaCl浓度升至 500mmol / L 时,转基因的 20 株幼
苗全部可以存活,胁迫解除后可正常生长;野生型植株则大部分死亡;继续增加 NaCl浓度时,转基因幼苗也开
始出现死亡。
在正常 MS 培养基上,转基因普那菊苣生长状况要略为优于野生型,表现在叶片颜色更为浓绿,根、茎也
更加粗壮一些。 而在 500mmol / L 的 NaCl 胁迫条件下,转基因普那菊苣根长在 1. 32—4. 89cm 范围内,平均
3郾 01cm;根重在 2. 56—8. 1g范围内,平均 4. 56g;而野生型平均根长 0. 2 cm,平均根重 0. 07g。 叶片的生长差
异也很明显,转基因普那菊苣光合面积是野生型的几倍,而野生型的光合面积很小(图 4)。 表明 500mmol / L
的 NaCl胁迫条件下,受体野生型的生长受到明显的抑制,而转基因普那菊苣的耐盐性得到明显改善,在高盐
培养基上能够良好生长。
A B
C D
图 4摇 转 TaNHX2 基因普那菊苣的耐盐性鉴定
Fig. 4摇 NaCl tolerance assay of TaNHX2 transgenic puna chicory plants
A: 野生型在正常 MS培养基上生长20 d; B:转基因普那菊苣在正常MS培养基上生长20 d; C:野生型对照在含有 500mmol / L NaCl MS培
养基上生长 20 d; D: 转基因普那菊苣在含有 500 mmol / L NaCl MS培养基上生长 20 d
2. 3摇 NaCl对普那菊苣组培苗 SOD、POD 活性和 MDA 含量的影响
在含 500mmol / LNaCl的 MS 固体培养基上光照培养 2h, 转基因普那菊苣的 SOD 酶活性在 33. 11—
41郾 99U / g鲜重范围内,平均酶活性为 36. 90 U / g鲜重; 野生型普那菊苣的 SOD 酶活性为 15. 07U / g 鲜重,是
转基因普那菊苣酶活性的 1 / 2(表 2)。 在盐胁迫处理下,转基因普那菊苣的 SOD 活性明显高于野生型,有利
于保护细胞内的蛋白和膜系统免受氧化胁迫的伤害,增强普那菊苣在高盐环境下的适应能力。
POD是植物体内保护酶的一种,它能分解植物体内过多的过氧化物[8]。 在 500mmol / LNaCl处理下,转基
因普那菊苣的 POD酶活性在 47. 25—79. 54 U / g鲜重范围内,平均酶活性为 66. 80 U / g鲜重;野生型普那菊苣
的 POD酶活性为 29. 40 U / g鲜重,是转基因普那菊苣酶活性的 1 / 2(表 2)。
9625摇 18 期 摇 摇 摇 张丽君摇 等:导入 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性 摇
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MDA是植物器官膜脂过氧化作用的最终产物[9],是膜系统受伤害的重要标志之一,积累越多表明组织的
保护能力越弱,细胞膜遭受破坏越严重。 本试验中,在含 500mmol / LNaCl浓度时,MDA的含量明显的低于野
生型(表 2),其原因可能是由于转基因株系中 TaNHX2 基因表达的增强提高了转基因植株在逆境胁迫下的生
长适应能力。
表 2摇 盐胁迫对普那菊苣 SOD、POD酶活性和MDA的影响
Table 2摇 Effects of NaCl stress on the SOD, POD activity, and MDA in the transgenic puna chicory plants
株系 Line SOD / (U / g鲜重) POD / (U / g鲜重) MDA / (滋mol / g鲜重)
WT 15. 07 依 4. 9 c 29. 41 依 4. 1d 28. 44 依 0. 9 a
9 33. 11 依 3. 2 b 47. 24 依 3. 3 c 15. 16 依 1. 1 b
11 38. 17 依 2. 9 ab 69. 86 依 2. 1 ab 9. 76 依 2. 1 bc
13 33. 63 依 2. 1 ab 63. 88 依 2. 9 b 11. 36 依 1. 7 bc
21 37. 59 依 3. 6 ab 71. 51 依 2. 3 ab 10. 29 依 1. 9 bc
24 41. 99 依 2. 7 a 79. 54 依 1. 9 a 9. 39 依 2. 4 c
摇 摇 同一列中右侧字母字母不同表示差异显著(P<0. 05)
3摇 讨论
长期以来,人们普遍认为植物耐盐性是一个复杂的,由多个基因控制的质量性状,单一基因的作用不能有
效提高作物的耐盐性。 然而 Aspe等在拟南芥体内过量表达 atnhxl基因,发现转基因植株的液泡 Na+ / H+交换
率比野生型高的多,且液泡中 Na+含量也较高。 用含 200mmol / LNaCl 的盐水浇灌,转基因植株能够完成整个
生命周期,并没有表现出明显的生长缺陷[3],表现出明确的抗盐性提高。 番茄中过量表达 atnhx1 基因的转基
因植物能够在 200mmol / L的 NaCl浓度下正常生长、开花、结实,而对果实品质没有明显影响,Na+也没有在果
实中大量积累[10]。 上述研究表明用单一的 Na+ / H+逆向转运蛋白基因转化番茄[10]、油菜[11]、玉米[12]、小
麦[13]和马铃薯[14]等植物,超量表达外源液泡膜 Na+ / H+逆向转运蛋白基因能够显著提高受体植物的耐盐性。
这些工作预示着人们有可能通过向目标植物导入 1 个或少数几个基因就能得到新的耐盐植物种质资源。
TaNHX2 的表达与逆境密切相关,可以一方面降低过多 Na+对细胞质的毒害,另一方面又可将 Na+作为一种有
益的渗透调节剂来降低细胞的渗透势,从而使植物能更好地适应盐渍生境。
本实验结果显示,NaCl浓度在 300mmol / L时普那菊苣种子的发芽率能保持正常水平,随着浓度的升高而
迅速下降,NaCl 处理后,普那菊苣种子的萌发和出苗均晚于野生型,说明盐胁迫下影响种子的萌发和幼苗的
生长。 除发芽期外,幼苗期也是植物对盐胁迫最敏感的时期[15]。 因此,幼苗期的耐盐性可以在很大程度上反
映出该品种在其他时期的耐盐性,对转 TaNHX2 基因普那菊苣植株在组织培养和盆栽条件下进行胁迫实验显
示,NaCl胁迫下不但可以降低普那菊苣愈伤组织的出愈率和出芽率,而且对普那菊苣幼苗的生长发育以及根
长等都产生影响。 在碱胁迫下,普那菊苣的上述指标都产生了变化,不同指标变化趋势不同,且不同株系间存
在着一些微小的差异。 本实验表明,在逆境胁迫和非逆境胁迫下转基因植株的生长状态均优越于野生型;在
逆境胁迫下转基因普那菊苣的出愈率、出芽率、叶片和根茎都优于野生型,且植株死亡率小;野生型普那菊苣
的叶片和根部褐化都较为严重。 其中,死亡率、叶片和根长都与 NaCl浓度呈现一定的变化关系,即与 NaCl浓
度高度相关,这说明盐胁迫对它们的影响显著。 在对转基因普那菊苣株系胁迫实验中观察到,不同株系间存
在着一定的差异。
植物在高盐胁迫环境下会发生一系列的生理生化变化。 其伴随产生的氧化胁迫对细胞的伤害是影响植
物生长的重要原因之一[16鄄17]。 正常生长条件下产生的活性氧(ROS)能够被体内活性氧清除系统的各种酶
(SOD、POD、CAT 等)及时清除,不会对细胞造成伤害。 但盐、干旱或病害胁迫会诱导细胞内迅速产生大量活
性氧,活性氧的累积可使细胞膜脂不饱和脂肪酸过氧化, 破坏生物膜整体流动性、通透性和完整性, 导致细
胞膜透性增大、细胞液外渗, 甚至导致细胞内膜系统的破坏及诱发细胞凋亡。 SOD是避免细胞免受氧化胁迫
的关键酶, 其活性直接影响到活性氧的生成和代谢[16鄄18]。 同时,SOD还能减少活性氧对叶绿体的破坏, 提高
0725 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
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植物的耐盐性[18]。 本研究中,在 500mmol / LNaCl胁迫下,转 TaNHX2 基因普那菊苣的 SOD、POD 酶活性几乎
为野生型的两倍,从而能有效地减弱氧化胁迫带来的伤害。 本研究将 TaNHX2 基因转入普那菊苣中, 提高了
转基因植株在盐胁迫下的 SOD、POD活性,及其根长、根重和净增鲜重,表明转基因普那菊苣植株的耐盐性明
显增强,说明在盐胁迫下,这些转基因植株内发生的生理代谢变化可以降低逆境对普那菊苣植株的伤害,提高
保护酶的活性,从而增强植株对环境的抗逆性。 植物体在逆境胁迫下保护酶的作用,可能是通过它们之间相
互协调且保持一个稳定的平衡态所进行的[19]。 从上述的研究结果可以看出,Na+ / H+逆向转运蛋白增强了植
物的渗透调节能力,使普那菊苣对盐碱环境具有较强的耐受力,令其在高盐胁迫下能够较好地生长。
4摇 结论
导入小麦 TaNHX2 基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性和在盐胁迫环境下的 SOD 酶活性和 POD 酶活
性含量。 耐盐性与 SOD、POD的活性密切相关。
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ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 31,No. 18 September,2011(Semimonthly)
CONTENTS
CO2 emission from an alpine Kobresia humilis meadow in winters WU Qin, HU Qiwu, CAO Guangmin, et al (5107)………………
Effect of cultivation on soil organic carbon and total nitrogen accumulation in Cele oasis croplands and their relation to crop yield
HUANG Caibian, ZENG Fanjiang, LEI Jiaqiang, et al (5113)
…
……………………………………………………………………
Biomass and its allocation of four grassland species under different nitrogen levels
QI Yu, HUANG Yongmei, WANG Yan, et al (5121)
……………………………………………………
………………………………………………………………………………
Small鄄scale spatial patterns of genetic structure in Castanopsis eyrei populations based on autocorrelation analysis in the Tiantai
Mountain of Zhejiang Province QI Caihong, JIN Zexin, LI Junmin (5130)………………………………………………………
Influence of vegetation on frozen ground temperatures the forested area in the Da Xing忆anling Mountains, Northeastern China
CHANG Xiaoli,JIN Huijun,YU Shaopeng,et al (5138)
………
……………………………………………………………………………
Analysis of stable carbon isotopes in different components of tree rings of Pinus sylvestris var. mongolica
SHANG Zhiyuan, WANG Jian, CUI Mingxing, et al (5148)
……………………………
………………………………………………………………………
Retrieval of leaf area index for different grasslands in Inner Mongolia prairie using remote sensing data
LIU Yibo, JU Weimin, ZHU Gaolong, et al (5159)
………………………………
………………………………………………………………………………
Decomposition of lotus leaf litter and its effect on the aquatic environment of the Beili Lake in the Hangzhou West Lake
SHI Qi, JIAO Feng, CHEN Ying, et al (5171)
……………
……………………………………………………………………………………
Effects of fire disturbance on greanhouse gas emission from Larix gmelinii鄄Carex schmidtii forested wetlands in XiaoXing忆an
Mountains, Northeast China YU Lili, MU Changcheng, GU Han, et al (5180)…………………………………………………
Wetland landscape transition pattern of Lianbo Beach along the Middle Yellow River
GUO Donggang,SHANGGUAN Tieliang,BAI Zhongke,et al (5192)
…………………………………………………
………………………………………………………………
Effect of revegetation on functional groups of soil organic carbon on the Loess Plateau
LI Ting, ZHAO Shiwei,ZHANG Yang, et al (5199)
…………………………………………………
………………………………………………………………………………
Soil organic and inorganic carbon contents in relation to soil physicochemical properties in northeastern China
ZU Yuangang, LI Ran, WANG Wenjie, et al (5207)
………………………
………………………………………………………………………………
Characteristics of soil respiration in fallow and its influencing factors at arid鄄highland of Loess Plateau
GAO Huiyi, GUO Shengli, LIU Wenzhao (5217)
………………………………
…………………………………………………………………………………
Soil microbial functional diversity between rhizosphere and non鄄 rhizosphere of typical plants in the hilly area of southern Nixia
AN Shaoshan,LI Guohui,CHEN Liding (5225)
……
……………………………………………………………………………………
Differences in the surface palynomorph assemblages on a karst mountain and rocky desertification areas: a case in Nanchuan
District,Chongqing HAO Xiudong, OUYANG Xuhong,XIE Shiyou (5235)………………………………………………………
Ash content and caloric value in the leaves of Sinocalycanthus chinensis and its accompanying species
JIN Zexin, LI Junmin, MA Jine (5246)
………………………………
……………………………………………………………………………………………
Uptake kinetic characteristics of Cu2+by Salix jiangsuensis CL J鄄172 and Salix babylonica Linn and the influence of organic acids
CHEN Caihong, LIU Zhikun, CHEN Guangcai, et al (5255)
…
………………………………………………………………………
Introduction of TaNHX2 gene enhanced salt tolerance of transgenic puna chicory plants
ZHANG Lijun,CHENG Linmei,DU Jianzhong,et al (5264)
………………………………………………
…………………………………………………………………………
Effects of air humidity and soil water deficit on characteristics of leaf cuticular waxes in alfalfa (Medicago staiva)
GUO Yanjun, NI Yu,GUO Yunjiang, et al (5273)
…………………
…………………………………………………………………………………
Influence of water storage capacity on yield of winter wheat in dry farming area in the Loess Plateau
DENG Zhenyong, ZHANG Qiang, WANG Qiang, et al (5281)
…………………………………
……………………………………………………………………
Research of dynamic variation of moisture in apple orchard soil in the area of Xianyang in recent years
ZHAO Jingbo, ZHOU Qi, CHEN Baoqun, et al (5291)
………………………………
……………………………………………………………………………
Volatile oil contents correlate with geographical distribution patterns of the miao ethnic herb Fructus Cinnamomi
ZHANG Xiaobo,ZHOU Tao,GUO Lanping,et al (5299)
……………………
……………………………………………………………………………
Effect of environmental factors on growth of Chlorella sp. and optimization of culture conditions for high oil production
DING Yancong, GAO Qun, LIU Jiayao, et al (5307)
………………
………………………………………………………………………………
The effects of substrates on locomotor performance of two sympatric lizards, Takydromus septentrionalis and Plestiondon chinensis
LIN Zhihua, FAN Xiaoli, LEI Huanzong, et al (5316)
……
……………………………………………………………………………
Guild structure of wintering waterbird assemblages in shallow lakes along Yangtze River in Anhui Province, China
CHEN Jinyun, ZHOU Lizhi (5323)
…………………
…………………………………………………………………………………………………
Phylogenetic diversity analysis and in situ hybridization of symbiotic Oxymonad flagellates in the hindgut of Reticulitermes chinensis
Snyder CHEN Wen, SHI Yu, PENG Jianxin, et al (5332)………………………………………………………………………
An entropy weight approach on the comprehensive evaluation of the Pearl River Delta Nature Reserve
ZHANG Linying, XU Songjun (5341)
………………………………
………………………………………………………………………………………………
Review and Monograph
On planning method of mesoscale and microscale ecological land RONG Bingling, LI Dong, XIE Yingxia (5351)……………………
Effects of land use change on soil organic carbon:a review CHEN Zhao,L譈 Changhe,FAN Lan,et al (5358)………………………
Marine phytoplankton and biological carbon sink SUN Jun (5372)………………………………………………………………………
Effect of permafrost degradation on methane emission in wetlands: a review
SUN Xiaoxin, SONG Changchun, WANG Xianwei, et al (5379)
……………………………………………………………
…………………………………………………………………
A review on the effects of biogenic elements and biological factors on wetland soil carbon mineralization
ZHANG Linhai, ZENG Congsheng, TONG Chuan (5387)
………………………………
…………………………………………………………………………
A review of studies using ecological network analysis LI Zhongcai, Xu Junyan, WU Changyou, et al (5396)…………………………
Scientific Note
Dynamics of age structures on Agropyron michnoi and Leymus chinensis in different communities
JIN Xiaoming, AI Lin, LIU Jidong, et al (5406)
………………………………………
…………………………………………………………………………………
The impact of thematic resolution on NDVI spatial pattern HUANG Caixia, LI Xiaomei, SHA Jinming (5414)………………………
2009 年度生物学科总被引频次和影响因子前 10 名期刊绎
(源于 2010 年版 CSTPCD数据库)
排序
Order
期刊
Journal
总被引频次
Total citation
排序
Order
期刊
Journal
影响因子
Impact factor
1 生态学报 11764
2 应用生态学报 9430
3 植物生态学报 4384
4 西北植物学报 4177
5 生态学杂志 4048
6 植物生理学通讯 3362
7
JOURNAL OF INTEGRATIVE
PLANT BIOLOGY
3327
8 MOLECULAR PLANT 1788
9 水生生物学报 1773
10 遗传学报 1667
1 生态学报 1. 812
2 植物生态学报 1. 771
3 应用生态学报 1. 733
4 生物多样性 1. 553
5 生态学杂志 1. 396
6 西北植物学报 0. 986
7 兽类学报 0. 894
8 CELL RESEARCH 0. 873
9 植物学报 0. 841
10 植物研究 0. 809
摇 绎《生态学报》 2009 年在核心版的 1964 种科技期刊排序中总被引频次 11764 次,全国排名第 1; 影响因
子 1郾 812,全国排名第 14;第 1—9 届连续 9 年入围中国百种杰出学术期刊; 中国精品科技期刊
摇 摇 编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报
(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 31 卷摇 第 18 期摇 (2011 年 9 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
摇
(Semimonthly,Started in 1981)
摇
Vol郾 31摇 No郾 18摇 2011
编摇 摇 辑摇 《生态学报》编辑部
地址:北京海淀区双清路 18 号
邮政编码:100085
电话:(010)62941099
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主摇 摇 办摇 中国生态学学会
中国科学院生态环境研究中心
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