全 文 ：第１９卷 第６期
Ｖｏｌ．１９ Ｎｏ．６
草 地 学 报
ＡＣＴＡ ＡＧＲＥＳＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
２０１１年 １１月
Ｎｏｖ． ２０１１
农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立
张丽君１，２，程林梅２，杜建中２，李贵全１＊，孙 毅１，２＊
（１．山西省农业科学院生物技术研究中心，山西 太原 ０３００３１；２．山西农业大学，山西 太谷 ０３００８１）
摘要：以普那菊苣（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ Ｌ．ｃｖ．Ｐｕｎａ）叶片为试验材料，接种于含不同激素浓度配比的 ＭＳ培养基上
进行愈伤组织、芽分化以及根再生的诱导，分析了不同激素浓度及其配比对愈伤组织诱导和芽分化以及根再生效
果的影响。以已经建立的再生体系为基础，以农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４（含质粒ｐＢｉｎ４３８－ＴａＮＨＸ２）侵染转化普那菊
苣，探索普那菊苣高效遗传转化体系。结果表明：对外植体适宜的预培养时间为２～３ｄ，与农杆菌的共培养时间也
应控制在２～３ｄ；侵染时间控制在８ｍｉｎ左右；卡那霉素（Ｋｍ）阳性筛选的适宜选择浓度为６０ｍｇ·Ｌ－１。乙酰丁香
酮（ＡＳ）２００μｍｏｌ·Ｌ
－１是促进农杆菌转化的最佳浓度，２００Ｗ 超声波处理、２０次负压处理也可提高农杆菌转化率
效果。２６ｍｇ·Ｌ－１ Ｋｍ是野生型普那菊苣苗能够存活的上限，头孢唑林钠和头孢噻肟钠在５００～１０００ｍｇ·Ｌ－１浓度
范围内、羧苄青霉素３００ｍｇ·Ｌ－１和氨苄青霉素在４０～６０ｍｇ·Ｌ－１浓度范围内均能较好的诱导出愈伤组织和芽。
将来自小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白（ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｏｒ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ，简称ＮＨＸ，
ＮＨＥ或ＮＨＡ）导入普那菊苣；经抗生素筛选以及针对ＴａＮＨＸ２基因的ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明获得
了２８株转ＴａＮＨＸ２基因的普那菊苣植株。
关键词：普那菊苣；组织培养；植株再生；农杆菌介导；遗传转化；ＴａＮＨＸ２
中图分类号：Ｑ９４３．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－０４３５（２０１１）０６－１０４２－０９
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｎａ Ｃｈｉｃｏｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｊｕｎ１，２，ＣＨＥＮＧ Ｌｉｎ－ｍｅｉ ２，ＤＵ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＬＩ Ｇｕｉ－ｑｕａｎ１＊，ＳＵＮ Ｙｉ １，２＊
（１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔａｉｙｕａｎ，Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ０３００３１，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ，Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ０３００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈｉｃｏｒｙ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ Ｌ．ｃｖ．Ｐｕｎａ）ｌｅａｆ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ａｓｅｐｔｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍ－
ｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｃａｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｕｄ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｕｓ，ｂｕｄｓ ａｎｄ ｒｏｏｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ－
ｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＢｉｎ４３８－ＴａＮＨＸ２）ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ Ｐｕｎａ Ｃｈｉｃｏｒｙ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ．
Ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ－
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｗｅｒｅ ２～３ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ８ｍｉｎｕｔｅｓ ａｎｄ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃ－
ｔｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｕｄｓ ｗａｓ ６０ｍｇ·Ｌ－１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（ＡＳ）ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ
ｒａｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ
ｏｆ ２００μｍｏｌ·Ｌ
－１ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，
ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ２００Ｗａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｆ ２０ｔｉｍｅｓ ａｌｓｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｐｕｎａ ｃｈｉｃｏｒｙ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗａｓ ２６ｍｇ·Ｌ－１；ａｎｄ ｔｈｅ
ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ ｓｏｄｉｕｍ，ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ ｓｏｄｉｕｍ，ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ ａｎｄ Ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｉｎ ｆｏｒ ｉｎｄｕ－
ｃｉｎｇ ｃａｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ５００～１０００，５００～１０００，３００ａｎｄ ４０～６０ｍｇ·Ｌ－１，ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｇｅｎｅ（ＴａＮＨＸ２）ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｈｉｃｏｒｙ ｃｕｌｔｉｖａｒ，
ａｎｄ ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．
收稿日期：２０１１－０３－０９；修回日期：２０１１－０８－２０
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（２００９ＺＸ０８００３－０１７Ｂ）；山西省农科院攻关项目（Ｙｇｇ０９１２）资助
作者简介：张丽君（１９８１－），女，河北行唐人，博士研究生，研究方向为作物遗传与育种，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｊｕｎ．ｚｈａｎｇ９１１＠１６３．ｃｏｍ；＊通信作者 Ａｕ－
ｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉ－ｇｕｉ－ｑｕａｎ＠１２６．ｃｏｍ；ｓｕｎｙｉ６９２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
第６期 张丽君等：农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｕｎａ ｃｈｉｃｏｒｙ；Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ；Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ－
ｔｉｏｎ；ＴａＮＨＸ２
普那菊苣（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ Ｌ．ｃｖ．Ｐｕｎａ）是
菊科菊苣属多年生宿根性草本植物，是２０世纪８０
年代新西兰科工部草地研究所培育出的菊苣饲用新
品种，１９８５年正式鉴定通过并推广利用［１］。普那菊
苣中的提取物如醇、正己烷等是重要的免疫促进及
免疫调节剂。普那菊苣嫩叶及利用普那菊苣肉质根
软化栽培获得的芽球可食用，具有清肝利胆、健胃消
食、利尿消肿的作用，是新兴的特种蔬菜；普那菊苣
的根、茎、叶还可做饲草；此外，普那菊苣花蕾紫蓝
色，花期长，可用于绿化美化环境［２～４］。目前，有关
普那菊苣的研究主要集中在其栽培技术、生理生化
和药用价值方面，少量的有关普那菊苣组织培养的
报道也不够系统［５～７］。本研究以普那菊苣叶为外植
体，进行不同培养基的筛选，建立其离体培养再生和
转化体系，通过农杆菌介导法导入来自小麦（Ｔｒｉｔｉ－
ｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）植株体内 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基
因［８］，旨在获得抗旱、耐盐碱等抗逆转基因菊苣植
株，以提高其在逆境胁迫下的生存能力。
１ 材料和方法
１．１ 植物材料及供体质粒
１．１．１ 植物材料 供试植物材料为普那菊苣种子
（２ｎ＝２ｘ＝１８），种子由山西农科院畜牧兽医研究所
友情提供。
１．１．２ 质 粒 图 谱 及 来 源 逆 向 转 运 蛋 白
（ＴａＮＨＸ２）基因由中国科学院遗传发育研究所
８０３组陈受宜研究员提供，其载体质粒ｐＢｉｎ４３８－
ＴａＮＨＸ２的启动子为 ＣａＭＶ３５Ｓ，终止子为 Ｎｏｓ。
转化用农杆菌菌株是ＬＢＡ４４０４，抗生素抗性基因为
卡那霉素（Ｋｍ），质粒图谱如图１所示。
图１ 质粒ｐＢｉｎ４３８－ＴａＮＨＸ２构建图谱
Ｆｉｇ．１ ｐＢｉｎ４３８－ＴａＮＨＸ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
１．２ 方法
１．２．１ 培养基 基本培养基为 ＭＳ１：ＭＳ＋３％蔗
糖＋０．６％琼脂，ｐＨ５．８。愈伤组织和芽诱导筛选培
养基为 ＭＳ２：ＭＳ１＋不同的激素（表１）；根诱导筛选
培养基为 ＭＳ３：ＭＳ１＋不同的激素（表２）；共培养培
养基为 ＭＳ２；选择培养基为 ＭＳ４：ＭＳ２＋Ｋｍ＋抑菌
抗生素（表３）。农杆菌菌液培养用ＬＢ培养基。具
体成分如表１～３所示。
表１ 愈伤组织和芽诱导培养基
Ｔａｂｌｅ １ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｃａｌｕｓ ａｎｄ ｂｕｄｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
培养基编号 Ｎｏ．ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ 培养基成分Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ２－１ ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－２ ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＢＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１＋ＡｇＮＯ３０．５ｍｇ·Ｌ－１＋Ｖｃ ０．３ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－３ ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ·Ｌ－１＋ＩＡＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－４ ＭＳ＋ＩＡＡ ０．３ｍｇ·Ｌ－１＋ ＫＴ １．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＣＨ １００ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－５ ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－６ ＭＳ＋ＫＴ １．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－７ ＭＳ＋ＴＤＺ ０．５ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－８ ＭＳ＋ＢＡ ０．５ｍｇ·Ｌ－１＋２，４－Ｄ丁酯１．６ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ２－９ ＭＳ＋６－ＢＡ ２．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ ０．５ｍｇ·Ｌ－１＋Ｖｃ １００ｍｇ·Ｌ－１＋ＶＢ１１００ｍｇ·Ｌ－１＋Ｈｐｒｏ ３００ｍｇ·Ｌ－１
１．２．２ 外植体制备及预培养 选取无菌苗顶部幼
嫩平展的叶片按１ｃｍ×１ｃｍ大小切段制备外植体，
并置于 ＭＳ２培养基上预培养。培养条件（下同）：温
度（２８±１）℃，光照强度１３００～１５００ｌｘ，光照时间
１６／８ｈ。每个处理重复５次（５个培养皿），每次接
种２０个外植体。培养７ｄ后统计出愈率，３０ｄ后统
３４０１
草 地 学 报 第１９卷
计不定芽再生率。再生频率＝再生芽的外植体数／
接种外植体数×１００％。
表２ 根诱导培养基
Ｔａｂｌｅ ２ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
培养基编号
Ｎｏ．ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ
培养基成分
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ
ＭＳ３－１ ＭＳ＋ＩＡＡ ０．１～０．３ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ３－２ ＭＳ＋ＮＡＡ ０．１～０．３ｍｇ·Ｌ－１
ＭＳ３－３ ＭＳ＋ＩＢＡ ０．１～０．３ｍｇ·Ｌ－１
表３ ５种抗生素的浓度
Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
抗生素Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ 浓度 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／ｍｇ·Ｌ－１
卡那霉素ｋａｎａｍｙｃｉｎ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０
头孢唑林钠 Ｃｅｆａｍｅｚｉｎ ０ ２００ ４００ ６００ ８００ １０００
头孢噻肟钠 Ｃｌａｆｏｒａｎ ０ ２００ ４００ ６００ ８００ １０００
羧苄青霉素 Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ ０ ２００ ４００ ６００ ８００ １０００
氨苄青霉素 Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ ０ ２０ ４０ ６０ ８０ １００
１．２．３ 抗生素筛选压及抑制农杆菌过度生长的抗
生素的选择 Ｋｍ，Ｃｅｆ，Ｃｌａｆ，Ｃａｒｂ和Ａｍｐ共５种抗
生素（均购自太原阳光），分别制成１００ｍｇ·Ｌ－１母
液置于－２０℃冰箱贮存备用。Ｋｍ 用于筛选抗性
苗；Ｃｅｆ，Ｃｌａｆ，Ｃａｒｂ和Ａｍｐ用于抑制农杆菌的过度
生长，分别探讨４种抑菌剂对农杆菌的抑制作用和
对外植体发育的影响。抗生素种类及浓度梯度如表
３所示，记录和统计不同抗生素和在其不同浓度下
对农杆菌的抑制作用以及抗性苗的发育状况。
１．２．４农杆菌菌液的制备 从平板挑取含质粒农杆
菌接种到附加有２０ｍｇ·Ｌ－１利福平（ｒｉｆ）和 ５０
ｍｇ·Ｌ－１ Ｋｍ的 ＬＢ液体培养基中，于２８℃，１５０
ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养１６～２４ｈ。农杆菌的二次活化是
将上述培养菌液按２％的比例接入上述ＬＢ液体培
养中，２８℃（１２ｈ）振荡至对数生长期。收集菌液于
４℃，１３０００ｇ离心１ｍｉｎ，弃去上清，菌体用适量 ＭＳ
液体培养基重悬，并直接用于对外植体的遗传转化。
１．２．５ ＡＳ、超声波和负压处理对转化的影响 为
分析乙酰丁香酮（ＡＳ）对农杆菌介导转化频率的影
响［９］，设计了４个处理，分别为：①在感染前３０ｍｉｎ，
向菌液中加入ＡＳ；②在共培养基中添加 ＡＳ；③菌
液和共培养基中都不添加 ＡＳ（ＣＫ）；④两者中都添
加ＡＳ。ＡＳ终浓度设置为：２００和４００μｍｏｌ·Ｌ
－１。
超声波处理［１０］时为避免探头与加有菌液的处
理物间的交叉污染，特将待处理的溶液放置于一个
体积较小的烧杯中，再将这个小烧杯放置于另一个
较大体积的加有无菌水的烧杯中，探头直接伸入无
菌水，待处理材料是通过接受处理无菌水的超声波
的传播波来得到处理的。超声波处理时把三角瓶放
于超声波清洗器中央进行超声波处理，工作频率设
置７个处理，分别为０（ＣＫ），１００，２００，３００，４００，
５００，６００ Ｗ；工作时间设置５个处理，分别为０
（ＣＫ），２，４，６，８，１０ｍｉｎ，外植体在菌液中浸染时间
１０ｍｉｎ（包括超声波处理时间）。
负压处理时将外植体与３０ｍＬ菌液混合于５０
ｍＬ的无菌注射器中，密封后反复抽拉，以抽拉次数
代表负压处理强度［１１］，设０（ＣＫ），１０，２０，３０，４０，５０，
６０次处理，每次抽拉距离为６ｃｍ，每次间隔时间２
ｓ，在菌液中浸染时间１０ｍｉｎ（包括负压处理时间），
选定适合外植体芽诱导的负压处理强度［１２］。
以上每个处理设５次重复，每个重复含２０个外
植体，接种７ｄ后统计出愈率，３０ｄ后统计不定芽再
生率。
１．２．６ 抗性植株的获得 经过３０ｄ的筛选后，待
芽长２～３ｃｍ时，转入生根培养基，待生根完全后将
小苗取出，洗去根部培养基，载于花盆中。移栽１４ｄ
后取样（叶片）按ＣＴＡＢ方法提取植物总ＤＮＡ。
１．２．６．１ 转化植株的ＰＣＲ检测 用于检测ＴａＮ－
ＨＸ２基因片段的引物序列如下：
Ｐｒｉｍｅｒ １：５′－ＡＴＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣ－３′
Ｐｒｉｍｅｒ ２：５′－ＴＡＡＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧ－３′
ＰＣＲ反应体系：ＤＮＡ １００～１５０ｎｇ、ＴａＫａＲａ
Ｔａｑ ２Ｕ、总体积２０μＬ；ＰＣＲ热循环条件：９４℃，３０
ｓ；５６℃，３０ｓ；７２℃，５０ｓ；３０个循环，反应所用的Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶和ｄＮＴＰ购自上海生工生物工程技术
服务有限公司。
１．２．６．２ 转化植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析 采用
ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒ－
ｔｅｒ Ｋｉｔ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ），按其说明书进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检
测外源ＤＮＡ片段。
２ 结果与分析
２．１ 外植体的诱导与分化
外植体脱分化试验中，单独添加细胞分裂素（６－
ＢＡ，ＫＴ，ＴＤＺ）或生长素（ＮＡＡ和ＩＢＡ）诱导能力较
差；而细胞分裂素与生长素的配合使用对再分化影
响较大：６－ＢＡ与 ＮＡＡ或ＩＡＡ的组合诱导效果较
差，且易诱导愈伤组织形成根状物；６－ＢＡ与ＩＢＡ的
组合，能较好的诱导愈伤组织的形成或芽的分化，但
愈伤容易玻璃化和褐化，添加ＡｇＮＯ３和Ｖｃ能明显
４４０１
第６期 张丽君等：农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立
的改善此现象的发生；ＫＴ与 ＮＡＡ或ＩＡＡ的组合
诱导效果较好，出现芽点的时间较早，芽生长正常；
ＴＤＺ与ＮＡＡ的组合虽然诱导效果好，生长势强，出
现芽点的时间早，但是随着培养时间的增加，愈伤组
织逐渐老化，从底部开始缓慢褐化，芽生长受到影
响，且大多出现玻璃化苗。结合试验结果观察得出
（表４）：诱导愈伤组织和芽分化最佳培养基为 ＭＳ２－
４，即：ＭＳ＋ＩＡＡ ０．３ｍｇ·Ｌ－１＋ ＫＴ １．０ｍｇ·Ｌ－１
＋ＣＨ １００ｍｇ·Ｌ－１培养基。
表４ 不同激素浓度配比对愈伤诱导和芽分化的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
培养基
Ｍｅｄｉｕｍ
外植体数
Ｎｏ．ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ
愈伤组织数 Ｎｏ．ｏｆ ｃａｌｕｓ 分化芽数 Ｎｏ．ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｕｄｓ
均值±标准差 Ｍｅａｎ±ＳＤ Ｐ＜０．０１ 均值±标准差 Ｍｅａｎ±ＳＤ Ｐ＜０．０１
ＭＳ２－１ ２０×５ ８．０３±２．８５ Ｂ １５．４０±６．１１ ＢＣＤ
ＭＳ２－２ ２０×５ １５．８６±２．４９ Ａ ２６．４７±６．００ ＡＢ
ＭＳ２－３ ２０×５ ６．５７±１．６１ Ｂ １３．４０±４．６８ ＣＤ
ＭＳ２－４ ２０×５ １６．４６±１．９７ Ａ ３０．２８±３．３６ Ａ
ＭＳ２－５ ２０×５ ４．０９±１．６７ Ｂ ６．８１±２．４２ ＤＥ
ＭＳ２－６ ２０×５ １７．０８±３．５１ Ａ ２２．２２±５．７２ ＡＢＣ
ＭＳ２－７ ２０×５ ５．４９±２．８５ Ｂ １２．３７±６．１２ ＣＤ
ＭＳ２－８ ２０×５ １７．７８±４．４０ Ａ ０±０ Ｅ
ＭＳ２－９ ２０×５ １．６４±０．９１ Ｂ ４．７７±３．１３ ＤＥ
２．２ 再生芽的生根诱导
ＩＡＡ，ＮＡＡ和ＩＢＡ共３种激素都可诱导根的
生成。在添加ＩＡＡ的生根培养基中，７ｄ左右诱导
形成根原基，此时ＩＡＡ因光照大部分分解，使其含
量降低到不利于根的伸长生长。其中 ＭＳ＋ＮＡＡ和
ＭＳ＋ＩＢＡ培养基更适合生根，生根率达９８％（图２）。
图２ 不同激素对根的生长状况的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｒｏｏｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
注：左：ＮＡＡ；中：ＩＢＡ；右：ＩＡＡ
Ｎｏｔｅ：Ｌｅｆｔ：ＮＡＡ；ｍｉｄｄｌｅ：ＩＢＡ；ｒｉｇｈｔ：ＩＡＡ
２．３ 外植体的选择
叶片发育年龄和外植体的类型对诱导率有明显
的影响。较幼嫩的外植体易被农杆菌感染致死，基
本上不能形成愈伤组织；发育时间较长的外植体，细
胞分化程度较高，造成褐化严重；只有发育时期适
中，如２０ｄ龄的叶片，方可高频率产生不定芽，而且
不定芽形成速度快。
２．４ 抗生素对再生频率的影响
选择培养基加入Ｋｍ后，随着Ｋｍ浓度增加，野
生型植株由于不具有Ｋｍ抗性而逐渐死亡，而转化
植株由于Ｋｍ抗性基因的导入和表达能正常生长发
育，一般当Ｋｍ浓度恰好达到使野生型植株全部死
亡时的浓度称之为该植物转化植株的筛选压。由图
３可知，Ｋｍ对野生型植株愈伤组织的诱导具有强
烈的抑制作用，在Ｋｍ浓度为２０ｍｇ·Ｌ－１时，愈伤
组织的相对增长量就明显降低，而转化植株的愈伤
组织在Ｋｍ浓度为７０ｍｇ·Ｌ－１时，愈伤组织的相对
增长量才明显降低。为了严格地筛选抗性植株，本
研究中愈伤组织分化时Ｋｍ浓度定为６０ｍｇ·Ｌ－１，
不定芽生根时Ｋｍ浓度定为８０ｍｇ·Ｌ－１。
共培养后愈伤组织表面及浅层组织中共生有大
量农杆菌，为了杀死和抑制农杆菌的生长必须进行
脱菌培养。常用的抑菌抗生素有Ｃｅｆ，Ｃｌａｆ，Ｃａｒｂ和
５４０１
草 地 学 报 第１９卷
Ａｍｐ等。抗菌素对农杆菌的抑制作用，因抗菌素的
种类及浓度不同而异。试验结果表明（表５），Ｃｅｆ和
Ｃｌａｆ在５００～１０００ｍｇ·Ｌ－１浓度范围内、Ｃａｒｂ为
３００ｍｇ·Ｌ－１和Ａｍｐ在４０～６０ｍｇ·Ｌ－１浓度范围
内均对诱导愈伤组织和出芽无影响。但随着浓度的
增加，它们对普那菊苣愈伤组织和芽分化的抑制作
用也在增强，表现为普那菊苣外植体的出愈率和出
芽率均降低。而且普那菊苣外植体愈伤组织和芽的
诱导率的这种降低差异较大，愈伤组织的诱导率要
高于芽的诱导率，说明愈伤组织对抗生素反应比较
迟钝，而芽则相对比较敏感。
图３ 普那菊苣在不同Ｋｍ浓度下的分化出芽
Ｆｉｇ．３ Ｓｈｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｐｕｎａ Ｃｈｉｃｏｒｙ ｌｅａｖｅｓ ｏｎ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
表５ 几种抗生素对离体叶片再生频率的影响
Ｔａｂｌｅ ５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ
抗生素
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／ｍｇ·Ｌ－１
外植体数
Ｎｏ．ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ
再生芽数／个Ｎｏ．ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ
均值±标准差 Ｍｅａｎ±ＳＤ Ｐ＜０．０１
再生频率／％
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ＣＫ ０ ２０×５ １５．６６±２．７９ Ａ ７８
头孢唑林钠Ｃｅｆａｍｅｚｉｎ ２００ ２０×５ １４．６４±１．５８ ＡＢ ６８
４００ ２０×５ １６．３１±１．９６ Ａ ７９
６００ ２０×５ １２．１９±１．６８ ＡＢＣ ６０
８００ ２０×５ １２．４７±２．０８ ＡＢＣ ５９
１０００ ２０×５ １１．２４±１．９９ ＡＢＣ ５６
头孢噻肟钠Ｃｌａｆｏｒａｎ ２００ ２０×５ １２．５９±２．０４ ＡＢＣ ６１
４００ ２０×５ １４．７１±１．９９ ＡＢ ６９
６００ ２０×５ １４．０７±２．５０ ＡＢ ６６
８００ ２０×５ １１．０４±２．２４ ＡＢＣ ５５
１０００ ２０×５ １０．４１±２．５５ ＡＢＣ ５２
羧苄青霉素Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ ２００ ２０×５ １３．６１±２．９２ ＡＢＣ ６６
４００ ２０×５ １３．０５±４．６１ ＡＢ ６６
６００ ２０×５ ７．０４±１．１４ ＣＤ ３４
８００ ２０×５ ２．０１±１．４９ Ｄ １０
氨苄青霉素Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ ２０ ２０×５ １４．２２±３．０１ ＡＢ ７０
４０ ２０×５ １５．４４±１．６５ Ａ ７６
６０ ２０×５ １７．５０±１．４０ Ａ ８２
８０ ２０×５ １３．４１±１．５７ ＡＢ ６６
１００ ２０×５ ８．６９±２．０３ ＢＣ ４１
２．５ 预培养时间、侵染时间和共培养时间对转化效
果的影响
经过不同时间预培养（０～５ｄ）处理的外植体其
生长状况、转化率及愈伤组织形成等方面都有差别。
在农杆菌感染之前将外植体预培养２～３ｄ，可以减
少伤害胁迫，调整细胞生理状况，从而有利于农杆菌
的感染，同时可以减轻经农杆菌浸染后的腐烂褐化。
预培养时间过长，会造成伤口的愈合化，不利于农杆
菌的浸染。适宜的预培养时间为２～３ｄ。菌液的浸
染时间对转化有一定的影响。若浸染时间太短，农
６４０１
第６期 张丽君等：农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立
杆菌尚未侵入伤口，在共培养时无农杆菌生长，不能
产生转化体；若外植体在菌液中浸染时间过长，不仅
造成后期生长农杆菌无法抑制且易导致外植体的腐
烂褐化死亡。浸染叶片时间应控制在８ｍｉｎ左右、
叶柄控制在６～８ｍｉｎ之间，叶茎控制在６ｍｉｎ左
右。共培养的前２ｄ是携带外源基因的农杆菌进入
植物细胞的关键时期。这一过程发生之后，农杆菌
的继续存在已没有必要，且它的生长速度远比愈伤
要快，农杆菌的过度生长只会加大对愈伤组织的损
伤，并导致愈伤中已转化的细胞死亡，所以共培养时
间以２～３ｄ较为合适。
２．６ ＡＳ的添加方式、超声波和负压处理对转化率
的影响
乙酰丁香酮（ＡＳ）是双子叶植物细胞壁合成的前
体［１３］，通常单子叶植物在转化过程中不产生ＡＳ等酚
类物质，所以在转化过程中人为添加ＡＳ可以促进根
癌农杆菌感染单子叶植物。ＡＳ的添加方式对普那菊
苣的感染率也有较大影响。仅在感染前活化菌中添
加ＡＳ和仅在共培养基上添加ＡＳ时，与对照相比并
没有明显提高，在活化菌液中和共培养基中都添加
ＡＳ能明显促进转化。但是随着ＡＳ浓度的提高其转
化率不再升高反而呈下降趋势。这可能是由于 ＡＳ
是一种酚类物质，太高的浓度会对植物组织有伤害作
用，对接下来的愈伤组织诱导有害，因此本研究中使
用的ＡＳ浓度为２００μｍｏｌ·Ｌ
－１。试验结果表明，接
触ＡＳ外植体产生的愈伤组织明显多于没有接触
ＡＳ的外植体，因此，在双子叶植物中补充 ＡＳ也可
以提高愈伤组织诱导率。
适宜的超声波处理功率和时间可以提高转化
率［１４］，但是超声波处理本身会对外植体组织造成伤
害，在一定程度上增加了外植体的坏死率。在不使
用超声波处理时，叶片的坏死率很低，随着超声波功
率和处理时间的增加，外植体的坏死率也相应地增
加。试验结果表明，低强度（２００Ｗ）超声波和较短
时间处理对转化率有明显的促进作用，工作功率过
高（６００Ｗ）反而降低了转化率，超声波处理最佳工
作功率为２００Ｗ，工作时间为６ｍｉｎ。
不同强度负压处理对转化率的影响不同，当１０
≤负压强度≤２０次时，愈伤组织的芽诱导率和存活
率随着负压强度的升高而升高，说明低强度的负压
处理对外植体的伤害较小，对外植体的芽诱导有一
定的促进作用。当３０≤负压强度≤４０次时，愈伤组
织的芽诱导率呈下降趋势；当负压强度＞３０次时，
愈伤组织为淡黄色的疏松组织，经过继代培养后愈
伤组织褐化严重，芽诱导率降为０，表明过高的负压
处理强度会对外植体造成较大的伤害，从而抑制了
芽的再生。因此在本研究后续的负压辅助的转化试
验中使用抽拉２０次的负压强度。据报道，水稻
（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）材料转化的最佳负压处理强度为４０
次［１１］，说明不同的植物种类对负压处理的敏感性具
有差异。
２．７ 转化体的检测及转化植株的获得
经农杆菌转化和再生体系再生得到一些疑似转
化植株（图５），用 ＴａＮＨＸ２基因的引物分别对这
些植株的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，从３００株疑似转
化植株中扩增出有预期大小（７００ｂｐ）扩增片段的植
株７３株。部分ＰＣＲ检测结果如图６所示，而野生
型植株则没有特异扩增条带。
对ＰＣＲ检测呈阳性结果的植株的ＤＮＡ用限
制性内切酶 ＨｉｎｄⅢ消化，进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交
分析，ＣＳＰＤ染色，Ｘ光胶片曝光显示，这些植株的
ＤＮＡ中有２８株的杂交结果呈阳性，说明通过农杆
菌介导法转化普那菊苣获得了转基因植株。部分转
化植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交结果如图６所示，杂交
分析结果表明ＴａＮＨＸ２基因已整合到转基因植株
的基因组中。
３ 讨论
建立良好的外植体再生系统是普那菊苣基因转
化的关键环节，直接决定了转化的难易和转化频率
的高低。
在目前已建立的以普那菊苣花瓣、叶片、叶柄、
茎段等为外植体的再生体系中，由于品种的不同，其
再生能力存在一定的差异［１５］。一般来说，愈伤组织
诱导的培养基和芽诱导分化的培养基应该不同，愈
伤组织诱导需要的生长素和细胞分裂素浓度比值较
大，而芽诱导分化则需要细胞分裂素和生长素浓度
比值较大。但是本试验建立的普那菊苣高效再生体
系，外植体在相同的培养基上可以完成愈伤组织诱
导和芽的分化。在已报道的农杆菌介导的普那菊苣
遗传转化中，菌液浓度、侵染时间、共培养时间、抑菌
剂的选择与浓度、筛选剂浓度都会影响转化效率。
本试验优化了转化参数，获得了较高的转化率。同
已报道的普那菊苣遗传转化体系相比，本试验建立
的转化体系具有转化频率高、受基因型制约小、试验
周期短和再生植株变异小等优点。
７４０１
草 地 学 报 第１９卷
抗性愈伤组织的筛选在转基因工作中是十分重
要的。在筛选阶段，若没有高效的筛选体系，会造成
大量未成功转化的植株逃逸筛选压，加大了研究的
工作量。若一味的加大筛选压，可以将非转化细胞
杀死，但同时也严重影响和抑制转化细胞的生长和
再生能力，死亡的细胞对邻近的转化细胞会产生一
种抑制作用，干扰转化细胞的生长代谢，从而降低了
转化效率。在普那菊苣筛选培养时宜在生芽培养基
中加入６０ｍｇ·Ｌ－１的Ｋｍ进行筛选，在以后的继代
培养基中依次加入５０ｍｇ·Ｌ－１和４０ｍｇ·Ｌ－１的
Ｋｍ，并一直维持４０ｍｇ·Ｌ－１ Ｋｍ的水平，在生根培
养基中加入８０ｍｇ·Ｌ－１的Ｋｍ作为筛选压。
ＡＳ对农杆菌转化植物的作用因植物种类而异，
当受伤植物细胞产生的酚类物质不足以诱导农杆菌
ｖｉｒ基因活化时，ＡＳ等酚类物质能够帮助诱导这些基
因的活化，从而促进 Ｔ－ＤＮＡ向植物基因组的转
化［１６］，提高转化频率；反之，再加入ＡＳ就不一定能进
一步提高转化率，甚至会产生毒害作用降低农杆菌对
植物的转化率。本试验中在菌液和共培养基中都添
加２００μｍｏｌ·Ｌ
－１的ＡＳ则有利于提高转化率。
在农杆菌介导的植物转化过程中进行超声波和
负压处理时都是在外植体的表面形成许多细小的伤
口，并导致组织液大量外流，这种“伤流液”中可能含
有较多的酚类物质，可以大大刺激农杆菌的转化活
力［１２］。此外，大量细小伤口的存在为农杆菌的感染
提供了更多的机会，使外源基因容易进入，但同时这
些处理也会对植物细胞造成一定的伤害。如果在此
过程中伤害太大，就会影响植株的再生，继而影响转
８４０１
第６期 张丽君等：农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立
化苗的获得，因此在实际利用时需要测定超声波处
理的时间和负压强度。
４ 结论
通过基因工程手段向植物中导入ＴａＮＨＸ２基
因，培育出抗盐的转基因作物新品种，使其在盐渍化
的土壤中正常生长，对盐碱地的改良和畜牧业的发
展具有一定的意义。本研究通过对普那菊苣外植体
再生体系、转化体系的进一步优化，为获得更多的普
那菊苣转基因新品种奠定了良好的基础。
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