全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 32 卷 第 21 期摇 摇 2012 年 11 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的分布及对氮循环的影响 王衫允,祝贵兵,曲冬梅,等 (6591)………
造纸废水灌溉对滨海退化盐碱湿地土壤酶活性的响应 夏孟婧,苗颖,陆兆华,等 (6599)………………………
图们江下游湿地生态系统健康评价 朱卫红,郭艳丽,孙摇 鹏,等 (6609)…………………………………………
适应白洋淀湿地健康评价的 IBI方法 陈摇 展,林摇 波,尚摇 鹤,等 (6619)………………………………………
基于 MODIS的洞庭湖湿地面积对水文的响应 梁摇 婕,蔡摇 青,郭生练,等 (6628)……………………………
崇明东滩湿地不同潮汐带入侵植物互花米草根际细菌的多样性 章振亚,丁陈利,肖摇 明 (6636)……………
中国东部亚热带地区树轮 啄13C方位变化的谐波分析 赵兴云,李宝惠,王摇 建,等 (6647)……………………
甘肃臭草型退化草地优势种群空间格局及其关联性 高福元,赵成章 (6661)……………………………………
川西亚高山 /高山森林土壤氧化还原酶活性及其对季节性冻融的响应 谭摇 波,吴福忠,杨万勤,等 (6670)…
模拟分类经营对小兴安岭林区森林生物量的影响 邓华卫,布仁仓,刘晓梅,等 (6679)…………………………
苹果三维树冠的净光合速率分布模拟 高照全,赵晨霞,张显川,等 (6688)………………………………………
拟茎点霉 B3 与有机肥配施对连作草莓生长的影响 郝玉敏,戴传超,戴志东,等 (6695)………………………
落叶松林土壤可溶性碳、氮和官能团特征的时空变化及与土壤理化性质的关系
苏冬雪,王文杰,邱摇 岭,等 (6705)
………………………………
……………………………………………………………………………
人工固沙区与流沙区准噶尔无叶豆种群数量特征与空间格局对比研究
张永宽,陶摇 冶,刘会良,等 (6715)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
山地河流浅滩深潭生境大型底栖动物群落比较研究———以重庆开县东河为例
王摇 强,袁兴中,刘摇 红 (6726)
…………………………………
…………………………………………………………………………………
荣成俚岛人工鱼礁区游泳动物群落特征及其与主要环境因子的关系 吴忠鑫,张摇 磊,张秀梅,等 (6737)……
北黄海秋、冬季浮游动物多样性及年间变化 杨摇 青,王真良,樊景凤,等 (6747)………………………………
鄂尔多斯市土地利用生态安全格局构建 蒙吉军,朱利凯,杨摇 倩,等 (6755)……………………………………
村落文化林与非文化林多尺度物种多样性加性分配 高摇 虹,陈圣宾,欧阳志云 (6767)………………………
不同生计方式农户的环境感知———以甘南高原为例 赵雪雁 (6776)……………………………………………
两种预测模型在地下水动态中的比较与应用 张摇 霞,李占斌,张振文,等 (6788)………………………………
四川黄龙沟少花鹤顶兰繁殖成功特征 黄宝强,寇摇 勇,安德军 (6795)…………………………………………
硝化抑制剂对蔬菜土硝化和反硝化细菌的影响 杨摇 扬,孟德龙,秦红灵,等 (6803)……………………………
新疆两典型微咸水湖水体免培养古菌多样性 邓丽娟,娄摇 恺,曾摇 军,等 (6811)………………………………
白洋淀异养鞭毛虫群落特征及其与环境因子的相关性 赵玉娟,李凤超,张摇 强,等 (6819)……………………
双酚 A对萼花臂尾轮虫毒性及生活史的影响 陆正和,赵宝坤,杨家新 (6828)…………………………………
孵化温度对双斑锦蛇初生幼体行为和呼吸代谢的影响 曹梦洁,祝摇 思,蔡若茹,等 (6836)……………………
黄玛草蛉捕食米蛾卵的功能反应与数值反应 李水泉,黄寿山,韩诗畴,等 (6842)………………………………
互惠鄄寄生耦合系统的稳定性 高摇 磊,杨摇 燕,贺军州,等 (6848)………………………………………………
超微七味白术散对肠道微生物及酶活性的影响 谭周进,吴摇 海,刘富林,等 (6856)……………………………
专论与综述
氮沉降对森林生态系统碳吸存的影响 陈摇 浩,莫江明,张摇 炜,等 (6864)………………………………………
全球 CO2水平升高对浮游植物生理和生态影响的研究进展 赵旭辉,孔繁翔,谢薇薇,等 (6880)………………
跨界自然保护区———实现生物多样性保护的新手段 石龙宇,李摇 杜,陈摇 蕾,等 (6892)………………………
研究简报
会同和朱亭 11 年生杉木林能量积累与分配 康文星,熊振湘,何介南,等 (6901)………………………………
退化草地阿尔泰针茅生殖株丛与非生殖株丛的空间格局 任摇 珩,赵成章,高福元,等 (6909)…………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*326*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*35*
室室室室室室室室室室室室室室
2012鄄11
封面图说: 白洋淀是华北地区最大的淡水湖泊湿地。 淀区内沟壕纵横交织错落,村庄、苇地、园田星罗棋布,在水文、水化学、生
物地球化学循环以及生物多样性等方面,具有非常复杂的异质性。 随着上游城镇污废水、农田径流进入水域,淀区
富营养化日益加剧。 复杂的水环境特点、高度的景观异质性和良好的生物多样性,使得该地区成为探索规模性厌氧
氨氧化反应的良好研究地点(详见本期第 6591—6598 页)。
彩图提供: 王为东博士摇 中国科学院生态环境研究中心摇 E鄄mail: wdwangh@ yahoo. com
第 32 卷第 21 期
2012 年 11 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 32,No. 21
Nov. ,2012
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:国家自然科学基金项目(20877086); 国家 973 项目(2009CB421103); 国家科技重大专项(2008ZX07421-001); 北京市科技新星计划
项目(2011095)
收稿日期:2011-09-15; 　 　 修订日期:2012-03-26
∗通讯作者 Corresponding author. E-mail:gbzhu@ rcees. ac. cn
DOI:10. 5846 / stxb201109151354
王衫允, 祝贵兵, 曲冬梅, 尹澄清. 白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的分布及对氮循环的影响.生态学报,2012,32(21):6591-6598.
Wang S Y, Zhu G B, Qu D M, Yin C Q. Widespread of anaerobic ammonia oxidation bacteria in an eutrophic freshwater lake wetland and its impact on
nitrogen cycle. Acta Ecologica Sinica,2012,32(21):6591-6598.
白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的分布
及对氮循环的影响
王衫允1, 2, 祝贵兵1,∗, 曲冬梅3, 尹澄清1
(1. 中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室,北京　 100085; 2. 北京科技大学 土木与环境工程学院,北京　 100083;
3. 中国科学院青藏高原研究所 中国科学院青藏高原环境变化与地表过程重点实验室,北京　 100085)
摘要:随着生物反应器和海洋生态系统中厌氧氨氧化反应的发现,自然生态系统的氮循环过程被重新认识,但是目前厌氧氨氧
化过程是否也存在于富营养化湖泊湿地并发挥着重要作用,还未见报道。 结合15N 同位素示踪与分子生物学技术研究了白洋
淀湖泊湿地沉积物中厌氧氨氧化菌的分布、菌群结构特性、生物多样性及其活性。 结果表明,在藻类影响导致的高氨氮沉积物
中,厌氧氨氧化菌具有广泛存在性。 通过构建 16S rRNA克隆文库发现,沉积物中厌氧氨氧化菌的生物多样性相对较低,在 2%
差异度的条件下,30 个克隆序列只分为 5 个操作分类单元 (OTUs),代表序列与 Genebank 数据库中已探明的厌氧氨氧化菌
Candidatus Brocadia fulgida和 Candidatus Brocadia anammoxidans同源性最高,分别可达 97%和 96% 。 同位素示踪结果表明,白
洋淀湖泊湿地沉积物中厌氧氨氧化活性为 0. 19—7. 78 nmol N g-1 h-1,空间差异较大,产生的氮气占此沉积物总氮气生成量的
0. 64%—20. 65% ,体现了湿地的异质性。 通过得出的厌氧氨氧化反应速率推算每年由厌氧氨氧化反应损失的氮量为 1. 8—78
gN m-2 a-1,对白洋淀氮循环起到非常重要的作用。 富营养化湖泊湿地沉积物中厌氧氨氧化反应的发现为研究厌氧氨氧化对氮
循环的重要影响提供了新证据。
关键词:厌氧氨氧化;生物多样性;活性;富营养化湖泊;沉积物;氮循环
Widespread of anaerobic ammonia oxidation bacteria in an eutrophic freshwater
lake wetland and its impact on nitrogen cycle
WANG Shanyun1,2, ZHU Guibing1,∗, QU Dongmei3, YIN Chengqing1
1 State Key Laboratory of Environmental Aquatic Quality, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing
100085, China
2 Civil & Environmental Engineering School, University of Science & Technology Beijing, Beijing 100083, China
3 Key Laboratory of Tibetan Environment Changes and Land Surface Processes, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
Abstract:Anaerobic ammonia oxidation (anammox) is one of the most innovative discoveries in field of microbial nitrogen
cycle with its direct oxidation of ammonia to nitrogen gas with no N2O production. At present the anammox researches are
limited to two areas: biological wastewater treatment and marine ecosystems. Evidence for anammox was obtained from
Baiyangdian, the largest freshwater lake in North China, using an isotope pairing technique and molecular analysis. This
lake is characterized by hyper-eutrophic conditions with a great amount of accumulated ammonia nitrogen (95—336 mg / kg)
in surface sediments (0—5cm). The anammox processes were detected on an extensive spatial scale (n = 10) in the lake
sediments by PCR and 16S rRNA gene clone libraries, using primers combination pla46f-630r and Amx368f-Amx820r. The
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30 sequences sharing 98% similarity were grouped into only five operational taxonomic unit (OTU) using software DOTUR
by the furthest neighbor approach. The biodiversity indicator “ Shannon (1. 4) and Chao 1 estimator (5)冶 were also
calculated with DOTUR software. The result of biodiversity analysis showed that anammox bacteria biodiversity in the lake
sediments was low. Phylogenetic trees were constructed by neighbor鄄joining ( NJ) with the Jukes鄄Cantor correction in
MEGA 4 package. The 16S rRNA gene sequences of anammox bacteria in the surface sediments were closely related to the
known anammox bacteria Candidatus Brocadia fulgida (97% ) and Candidatus Brocadia anammoxidans (96% ), and it
revealed most of anammox bacteria from Baiyangdian Lake may belong to “Brocadia冶 . Isotope analyses were based on 15N
labeled ammonium and nitrate. Three treatments (1) 15NH+4 ( negative control) (2)
15NH+4 and
14NO-3 ( positive control)
(3) 14NH+4 and
15NO-3(test group) was prepared and experiments were operated in hermetic anaerobic containers at 19益 .
Outcome gaseous N2 was delivered to Gas chromatography鄄isotope ratio mass spectrometry for separation of
28N2,
29N2 and
30
N2 . Then the rates of anammox and denitrification activities were calculated. The anammox rates ranged between 0. 19 to
7郾 78 nmol N g-1 h-1 with significant spatial heterogeneity, which contributed 0. 64 to 20. 65 precent to sediments N2
production with the remainder being due to denitrification. It was estimated that the total removed N (1. 8—78 gN m-2 a-1)
was linked to anammox in this eutrophic freshwater lake. About 56 to 9426 t / a of N was removed by way of anammox
process with the water level changing from 5. 5 to 9. 5 m of Baiyangdian Lake. This research provided some new knowledge
on anammox in freshwater ecosystems.
Key Words:anammox; abundance; activity; eutrophication lake; sediments; nitrogen cycle
随着新型反应机制和功能微生物的发现,人们对氮循环过程有了新的认识。 传统氮迁移转化的过程为:
氨氮在好氧条件下由氨氧化细菌(AOB)在氨单加氧酶(amoA)的催化条件下,氧化为亚硝酸盐,由此开始生
物氮循环。 最新的研究发现,氨的氧化不仅在有氧条件下进行,还可以在厌氧氨氧化菌的作用下,在厌氧 /缺
氧的条件下被亚硝酸盐氧化,定义为厌氧氨氧化(Anammox) [1鄄2]。
厌氧氨氧化反应的发现是近 10 年环境科学领域的重要突破,使人们重新认识氨氧化过程这一氮循环中
的限速步骤,也改变了人们对全球氮循环通量的认识[3]。 目前已探明,海洋生态系统中 24%—67%的氮气由
厌氧氨氧化反应完成[4]。 但是目前关于厌氧氨氧化反应的研究多限于海洋生态系统中,在大陆表层,还很少
报道。 作者前期研究在河流表层沉积物和稻田深层土壤中发现了厌氧氨氧化菌[5鄄6],但是目前尚无富营养化
湖泊湿地厌氧氨氧化的相关报道[7鄄9]。
本研究选择河北省安新县的白洋淀湖泊湿地为研究地点,通过 PCR 扩增、测序、构建克隆文库及生物多
样性分析,揭示湖泊湿地沉积物中厌氧氨氧化菌的存在、生物多样性及菌群结构特征,并通过15N 同位素示踪
证实厌氧氨氧化反应的发生与过程效应以及其活性表现。 在此基础上,结合本研究组在白洋淀 30 多年的研
究基础,推算厌氧氨氧化过程对白洋淀湖泊湿地沉积物氮流失量的具体效能。
1摇 材料与方法
1. 1摇 研究区概况
白洋淀是华北平原最大的淡水湖泊湿地,位于华北平原中部,地理位置为北纬 38毅43忆—39毅02忆,东经 115毅
38忆—116毅07忆,总面积 366 km2,约 85%水域在安新县境内。 白洋淀汇集了唐河、府河、漕河、拒马河等 9 条河
流河水,属海河流域大清河水系,对整个华北地区具有重要生态价值。 白洋淀是渤海湾西面低洼地经海陆变
迁形成的特殊生态系统,淀区地形复杂,淀内纵横沟壕 3700 余条交织错落,将全淀分割成 143 个大小不等的
淀泊(图 1 A)。 其水陆交错带发育相对较好,在全淀范围内,以芦苇植被为景观特征的水陆交错带湿地系统
约占 36% ,主要由芦苇群落、苇地间小沟以及浅水区组成,苇地和水面的面积之比约为 1颐3. 5。 随着历史变迁
以及人为活动的影响,导致白洋淀生态环境恶化,富营养化和沼泽化状况严重。
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在分析了大量背景资料和野外调查基础上,兼顾采样可行性和代表性,在白洋淀湖区,设置 10 个采样点
(图 1 B),采集表层沉积物(0—5 cm)样品置于无菌自封袋中,冰盒保存带回实验室。 一部分 4 益保存用
于15N同位素示踪试验,一部分进行基本理化指标测定,剩余部分保存在-80 益超低温冰箱直至 DNA提取。
图 1摇 白洋淀芦苇型湖泊湿地景观结构特点(A)及采样点布设(B)
Fig. 1摇 The landscape view of Baiyangdian reed鄄bed / ditch systems (A), and geographical distribution of sampling sites (B)
1. 2摇 样品理化指标分析
选择总有机质(TOM)、氨氮(NH+4 鄄N)、硝氮(NO
-
3 鄄N)、总氮(TN)、总磷(TP)、pH 值为基本理化指标进行
检测;同时,测定了上覆水的溶氧(DO)、温度(T)。 沉积物样品现场采集,经 4益保存回实验室后,依照《土壤
农化分析》(第 5 版)方法进行相应测定[10],其中氨氮和硝氮用浓度为 2 mol / L的 KCl溶液浸提 2 h,抽滤后用
连续流动分析仪测定(SAN plus, Skalar Analytical B. V. the Netherlands)。 水样常规指标溶氧(DO)、温度(T)
采取 YSI美国维赛仪器公司出品的 YSI 6600 主导型多参数水质监测仪进行现场检测。
1. 3摇 DNA提取和聚合酶链式反应(PCR)
称取 0. 30 g左右经-50 益冷冻干燥处理的沉积物样品,利用 FastDNA SPIN Kit for Soil (Bio 101, Vista,
CA)提取试剂盒提取样品中的总 DNA。 厌氧氨氧化菌的聚合酶链式反应采用巢式 PCR 途径:首先使用引物
pla46f(5忆鄄GGATTAGGCATGCAAGTC鄄3忆)和通用引物 630r(5忆鄄CAKAAAGGAGGTGATCC鄄3忆)对浮霉菌属进行
PCR扩增[11鄄12];第二步以第一步 PCR 产物作为模板,使用厌氧氨氧化细菌特异性引物 Amx368f (5忆鄄
TTCGCAATGCCCGAAAGG鄄3忆)和 Amx820r ( 5忆鄄AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC鄄3忆) 进行厌氧氨氧化菌 16S
rRNA全长 PCR扩增[13]。 PCR扩增的 50 滋L体系配置如下:10伊buffer 5 滋L,dNTP(2. 5 mmol / L)4 滋L,正反向
引物(浓度为 10 mmol / L)各 1 滋L,BSA 0. 5 滋L,Taq酶(2. 5U)0. 25 滋L,稀释 DNA模板 2 滋L,ddH2O补足至 50
滋L。 PCR反应扩增程序见文献[14]。
1. 4摇 克隆、测序和系统发育分析
使用 Promega Agarose Gel DNA (Promega, Madison, WI) 纯化试剂盒对 PCR扩增产物进行切胶纯化,将
胶回收产物与 pGEM鄄Teasy (Promega, Madison, WI) 载体进行连接后,转入 JM109 感受态细胞(大肠杆菌),
涂布于 Luria鄄Bertani (LB)培养基培养,最后进行蓝白斑筛选。 随机选取 100 个白色克隆,采用菌落 PCR 扩增
的方法鉴定阳性克隆,所用引物为载体通用引物 T7、SP6。 挑取阳性克隆子,用限制性内切酶 Hha玉分型,选
取不同酶切类型 1—2 个菌株进行测序。 应用 DNASTAR 软件对测序结果进行编辑,去除载体序列后应用
NCBI鄄BLAST在基因库中搜索相似序列。 同时将该序列与已发表的相关细菌的 16S rRNA序列进行多重序列
对齐,使用 MEGA 4. 1 软件以邻接法构建进化树。 操作分类单元( operational taxonomic unit, OTU)利用
DOTUR软件进行划分。 将序列提交 Genbank数据库登录号 HQ847787鄄HQ847799、HQ847808鄄HQ847824。
1. 5摇 15N同位素测定厌氧氨氧化菌活性及其造成的氮损失量
将 2. 5 g左右的新鲜土壤样品放入 12. 0 mL柱状玻璃瓶(Labco,UK)中,同时加入一颗玻璃珠以利于反应
3956摇 21 期 摇 摇 摇 王衫允摇 等:白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的分布及对氮循环的影响 摇
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时摇匀,然后注满饱和氮气无氧水,使其形成缺氧环境,室温下培养 30 h左右保证去除其中的 NO-3。
然后,通过分别注入一定浓度15N丰度为 99. 29%的 Na15NO3 或15N丰度为 98. 2%的( 15NH4) 2SO4,对样品
进行 3 种处理:淤仅加15NH+4(阴性对照);于加15NH
+
4 和14NO
-
3(阳性对照);盂加14NH
+
4 和15NO
-
3(试验组)。 在
旋转发生器上现场温度条件下(19 益)进行培养,并按 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h时间点取样,最终分别注入 200 滋L
7M ZnCl2 溶液以终止反应。 气体通过气相色谱鄄同位素比值质谱仪 ( Gasbench鄄MAT253),分别测得其
中28N2,29N2 和30N2 的浓度[15鄄16]。
处理淤、于分别为阴性和阳性对照,处理盂为正常反应。 反硝化及厌氧氨氧化速率通过各自氮气产生量
对时间的回归获得。 以处理盂为例说明计算过程。 厌氧氨氧化反应产生的氮气是由 NH+4 和 NO
-
3 各提供一个
氮原子组成。 因此,处理盂中厌氧氨氧化反应产生的氮气为28N2 和29N2,二者的量由加入 NO
-
3 中15NO
-
3 的比
例决定:
A28 = Atotal伊 (1 - FN), A29 = Atotal伊 FN (1)
式中,Am 表示厌氧氨氧化反应的氮气产生量,FN 为 NO
-
3 中15N的比例。
反硝化反应产生氮气的两个氮原子均来自于 NO-3。 因此,处理盂中反硝化反应产生的氮气应该
为28N2、29N2 和30N2:
D2 8 = Dtotal伊 (1 - FN) 2, D2 9 = Dtotal伊 2 伊 (1 - FN) 伊 FN, D30 = Dtotal伊 FN2 (2)
式中,Dm 为反硝化反应的氮气产生量。
记 Pm 为气相色谱鄄同位素比值质谱仪测得的氮气总量,结合公式(1)和(2),且 D30 =P30 而得:
Dtotal = P30伊 FN
-2 (3)
D29 = P30伊 2 伊 (1 - FN) 伊 FN
-1 (4)
A2 9 = P29- D29 = P29 – P30伊 2 伊 (1 - FN) 伊 FN
-1 (5)
A28 = A29伊 FN
-1伊 (1 - FN) (6)
叠加公式(5)和(6)得
Atotal = FN
-1伊 [ P29+ 2 伊 (1 - FN
-1) 伊 P30] (7)
式中,Dtotal 和 Atotal 即为各样品中反硝化和厌氧氨氧化反应的氮气产生量。 将所得各样品氮气产生量与相应
样品采集时间点进行线性回归,得到该样品的反硝化速率 VD 和厌氧氨氧化速率 VA。
由于厌氧氨氧化菌为自养细菌,因此在实验过程中未考虑碳源损耗的影响。 另外,同位素分析和计算过
程中也忽略了氮元素不同核素在反应中的同位素的热力学平衡分馏。
由已测得的厌氧氨氧化速率 VA 计算相应采样点单位面积厌氧氨氧化年速率 VA忆。
VA忆 = VA伊 MN伊 籽s伊 HS伊 T (8)
式中,MN 为氮元素的摩尔质量,籽s 为沉积物样品的平均密度,HS 为沉积物样品的厚度(0—5 cm),T为对应采
样时间点。
由前人研究[18]知各采样点对应湖泊水位的水域面积 SW,依据公式(9)计算得到由厌氧氨氧化反应造成
的氮损失量 Q。
Q = VA义伊 SW (9)
式中,VA义是各采样点单位面积厌氧氨氧化年速率 VA忆的平均值。
2摇 结果
2. 1摇 白洋淀采样点沉积物基本理化指标
白洋淀湖泊湿地沉积物和上覆水基本的理化指标见表 1。 从结果可看出,白洋淀湿地沉积物氨氮含量很
高,这也是选择白洋淀作为研究地点主要原因。 在已知的生物反应器中,高氨氮浓度有利于厌氧氨氧化反应
的进行[17]。
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表 1摇 白洋淀湖泊沉积物基本理化指标
Table 1摇 Characteristics of the sediment samples in Baiyangdian Lake
采样点
Sampling
sites
地理坐标
Geographic coordinates
上覆水 Overlying water
温度
/ 益
DO
/ (mg / L)
沉积物 Sediments
NH+4 鄄N
/ (mg / kg)
NO-3 鄄N
/ (mg / kg)
TN
/ (g / kg)
TP
/ (g / kg) pH
TOM
/ (g / kg)
1 54忆27. 1义 (N), 56忆57. 7义 (E) 7. 7 13. 6 427. 2 11. 6 3. 4 1. 0 7. 66 47. 5
2 54忆45. 7义 (N), 57忆29. 6义 (E) 6. 9 15. 5 256. 6 18. 8 3. 9 1. 1 7. 56 42. 6
3 55忆05. 1义 (N), 57忆58. 5义 (E) 6. 7 20. 2 241. 7 21. 0 4. 6 0. 7 7. 56 73. 4
4 54忆24. 9义 (N), 58忆21. 3义 (E) 7. 0 9. 0 209. 1 14. 8 1. 9 0. 6 7. 72 26. 6
5 54忆44. 2义 (N), 58忆26. 6义 (E) 6. 8 11. 1 158. 7 7. 9 2. 1 0. 7 7. 63 31. 3
6 55忆05. 1义 (N), 58忆50. 9义 (E) 6. 4 7. 9 209. 1 14. 8 1. 9 0. 6 7. 6 26. 6
7 54忆05. 9义 (N), 58忆42. 6义 (E) 6. 1 6. 0 241. 7 21. 0 2. 6 0. 7 8. 26 73. 4
8 54忆27. 0义 (N), 58忆52. 7义 (E) 5. 9 10. 8 536. 3 14. 6 4. 2 1. 0 7. 71 57. 9
9 54忆40. 4义 (N), 59忆06. 8义 (E) 6. 4 6. 9 398. 1 12. 4 2. 9 1. 0 7. 77 41. 8
10 55忆04. 4义 (N), 59忆15. 9义 (E) 6. 3 5. 8 538郾 0 7. 9 2. 1 0. 7 8. 04 31. 3
摇 摇 总有机质 Total organic matter,TOM; 氨氮 NH+4 鄄N; 硝氮 NO-3 鄄N; 总氮 Total nitrogen,TN; 总磷 Total phosphorus,TP; 上覆水的溶氧 Dissolved
oxygen,DO; 温度 Temperature,T
2. 2摇 厌氧氨氧化菌的广泛存在及其生物多样性
应用分子生物学方法,对厌氧氨氧化菌的 16S rRNA基因进行巢式 PCR扩增,对扩增产物构建克隆文库,
比对测序所得基因序列,发现 10 个湿地采样点沉积物中均存在厌氧氨氧化菌,说明厌氧氨氧化菌在白洋淀富
营养化湖泊湿地系统中具有广泛存在性。
对所获得的厌氧氨氧化序列进行生物多样性分析,发现其生物多样性较低;经分子生物学克隆鄄酶切处
理,选取 30 个阳性克隆子进行测序。 返回序列进行 BLAST网上比对,全部为厌氧氨氧化序列。 在 1% 、2%和
3%差异度条件下,应用 DOTUR 软件将 30 条厌氧氨氧化菌序列相应划分为 7 个、5 个和 3 个操作分类单元
OTU(图 2)。 在 2%差异度的条件下,生物多样性其他重要指数分别为:chao1 estimator(5)Shannon 为 1. 4;稀
疏分析图也证实了白洋淀湖泊湿地系统厌氧氨氧化菌生物多样性较低。
基于 2%的差异度构建系统发育树发现,OTU 1#中所含序列有 20 条,在 5 个 OTU 分支中最多,分析得
OTU 1#与厌氧氨氧化菌 Candidatus Brocadia fulgida 和 Candidatus Brocadia anammoxidans 的同源性都达到
96% ;而分析 OTU(2—5)# 与厌氧氨氧化菌 Candidatus Brocadia fulgida 和 Candidatus Brocadia anammoxidans
同源性最高可达 97% ,说明白洋淀富营养化湖泊湿地系统中的厌氧氨氧化菌很可能大多数隶属于
Brocadia属。
2. 3摇 厌氧氨氧化菌活性及其对氮循环的影响
为测定白洋淀沉积物中厌氧氨氧化的活性以及其对氮循环的影响,采用15N同位素示踪技术在现场温度
条件下,按 1. 5 节所述15N 同位素的培养和示踪方法,进行了 3 种形式的培养和处理(阴性对照处理:只
加15NH+4;阳性对照处理:15NH
+
4 +14NO
-
3;速率测定处理:14NH
+
4 +15NO
-
3),以验证其中是否存在厌氧氨氧化反应,
以及测定厌氧氨氧化和反硝化反应的活性。 3 种处理形式所得29N2 和30N2 气体产生量随时间变化的情况如
图 3 所示。
只加15NH+4 的沉积物处理样品,未见任何29N2 和30N2 气体,说明经过 30 h 的培养,沉积物样品中残存的
NO-3 已完全耗尽,不会对后续处理产生影响。 加入15NH
+
4 + 14NO
-
3 的处理,样品中29N2 随时间延长而增加,说
明厌氧氨氧化反应在该处理形式中确实存在且具有一定活性,而该处理形式中未探测到30N2,说明30N2 只由
反硝化反应产生。 加入14NH+4 + 15NO
-
3 的活性污泥处理样品,29N2 和30N2 均随时间延长而增加,说明了反硝化
反应和厌氧氨氧化反应同时存在于该处理形式中。
对于加入14NH+4 + 15NO
-
3 的沉积物样品中29N2 和30N2 的产气数据,按照方法 1. 5 所述的分析方法,计算各
5956摇 21 期 摇 摇 摇 王衫允摇 等:白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的分布及对氮循环的影响 摇
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图 2摇 基于 16S rRNA基因的厌氧氨氧化菌系统发育树
Fig. 2摇 Phylogenetic trees of anaerobic ammonia鄄oxidizing bacteria targeted on 16S rRNA gene
本文中的参比序列引自 GenBank数据库,序列名称后的字母加数字代表提交序号,分支节点上的数字表示每 1000 次 bootstrap 分析所支持
的次数;线段表示 1%序列差异的分支长度;OTU A#(N)表示 OTU A#所含序列的条数
图 3摇 基于15N示踪的被试沉积物样品中厌氧氨氧化与反硝化过程图(以 2 号采样点为例)
Fig. 3摇 The anaerobic ammonium oxidation coupled to nitrate reduction in sampled sediments amended with 15N labeled on ammonium and
nitrate separately(example as sample site 2#)
6956 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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时间点下反硝化过程与厌氧氨氧化过程的总氮气产生量。 将两过程的总氮气产生量对时间进行回归,分别得
到白洋淀五个采样点沉积物的反硝化过程与厌氧氨氧化过程的速率(表 2)。 由数据可看出,在白洋淀 5 个沉
积物中厌氧氨氧化的活性为 0. 19—7. 78 nmol N g-1 h-1,占总氮气生成量的比值(ra% )为 0. 64%—20郾 65% 。
结合沉积物样本的密度,得出厌氧氨氧化对氮损失的贡献量为 1. 79—78. 72 gN m-2 a-1。 结合以往的研究结
果,可以估算在白洋淀水位波动范围为 5. 5—9. 5 m 的条件下[18],由厌氧氨氧化损失的氮量为 56—9426 t / a
(表 2)。
表 2摇 白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的活性、对氮气生成量的贡献及对湖体沉积物中氮流失量的贡献
Table 2摇 Biogeographical distribution of anammox bacterial abundance, activity and contribution to N2 production (ra) in Baiyangdian Lake
采样点
Sampling
sites
厌氧氨氧化速率
Anammox rate
/ (nmol N g-1 h-1)
平均值
Average
标差
Standard
deviation
反硝化速率
Denitrification rate
/ (nmol N g-1 h-1)
平均值
Average
标差
Standard
deviation
N2 贡献率
Contribution
to N2
production
( ra / % )
沉积物
平均密度
Sediments
average
density
/ (g / cm3)
单位面积
厌氧氨氧
化年速率
Anammox
rate per
square
meter per
year
/ (gN m-2
a-1)
单位面积
年平均速率
Average rate
per square
meter per
year
/ (gN m-2
a-1)
湖泊水位
Lake
water level
/ m
水域面积
Water area
/ km2
氮损失量
N loss
/ ( t / a)
2 7. 78 0. 83 29. 90 5. 59 20. 65 1. 65 78. 72 27. 97 5. 5 2. 0 56
3 0. 19 0. 16 29. 62 4. 19 0. 64 1. 54 1. 79 6. 5 72. 0 2014
5 1. 82 0. 10 84. 66 8. 89 2. 11 1. 6 17. 86 9. 5 337. 0 9426
7 1. 25 0. 36 8. 96 1. 70 12. 28 1. 4 10. 73 8. 5 292. 0 8167
10 2. 95 0. 14 20. 39 1. 80 12. 64 1. 7 30. 75 7. 5 150. 0 4196
3摇 讨论
对于厌氧氨氧化的探究,本研究第一次报道在富营养化淡水湖泊湿地普遍存在厌氧氨氧化菌,且具有一
定的活性。 本研究对于重新认识淡水生态系统的氮循环过程具有重要作用。 根据沉积物的比重以及相关含
水率,通过同位素示踪实验得出,在白洋淀湖泊湿地厌氧氨氧化过程对于氮损失的贡献量为 1. 8—78 gN m-2
a-1,对于白洋淀的氮循环起到重要的贡献。
采用分子生物学对于厌氧氨氧化菌生物多样性的考察,全世界范围内已有较多报道。 在海洋生态系统
中,已有的厌氧氨氧化菌都严格隶属于 Scalindua[19]。 在淡水系统中,厌氧氨氧化菌的生物多样性也很低,例
如在坦噶尼喀湖中发现的厌氧氨氧化菌种 Candidatus Scalindua brodae[8],以及在河流湿地沉积物中发现的厌
氧氨氧化菌种 Candidatus Brocadia anammoxidans[9]。 在本研究中发现,厌氧氨氧化菌的生物多样性依然很低,
所监测到的厌氧氨氧化菌都隶属于 Brocadia,仍然保持在较低的生物多样性水平。
本研究还采用同位素示踪的方法,对厌氧氨氧化的速率进行了测定,并得出了其在氮循环中的贡献。 研
究结果表明,厌氧氨氧化菌的活性为 0. 19—7. 78 nmol N g-1 h-1,其产生的氮气量占总氮气生成量的 0. 64%—
20. 65% 。 本研究得出的厌氧氨氧化菌活性与其他海洋和淡水环境得出的活性在相同的范围内[3,20鄄21]。 在本
研究组此前在白洋淀近 30 年的研究基础,结合同位素示踪实验得出的厌氧氨氧化速率估算了其在整个白洋
淀富营化湖泊氮循环过程中,所起到的作用。 结果发现,在白洋淀水位波动 5. 5—9. 5 m 的条件下,通过厌氧
氨氧化损耗的氮量,每年约为 56—9426 t,起了非常重要的作用。
在测定厌氧氨氧化速率的同时也发现,厌氧氨氧化反应在湖泊湿地沉积物具有很强的异质性。 异质性的
原因,可能与白洋淀的围网捕鱼,游船、当地人民工农业生产等有关[18]。 由于本研究所采集的样本量有限,采
用相关性分析并不具备很好的准确性和科学性。 但是从沉积物的理化指标数据可以看出,沉积物中氨氮的浓
度显著高于硝态氮的浓度。 由于厌氧氨氧化反应体系中氨与硝酸盐是 1颐1 的摩尔比例关系,因此可以推断硝
酸盐很可能是白洋淀富营养化湖泊湿地沉积物中厌氧氨氧化反应的限制性因子。
综上,本研究同步应用分子生物学和同位素示踪技术首次发现在富营养化湖泊湿地广泛存在厌氧氨氧化
7956摇 21 期 摇 摇 摇 王衫允摇 等:白洋淀富营养化湖泊湿地厌氧氨氧化菌的分布及对氮循环的影响 摇
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菌及厌氧氨氧化反应。 分子生物学研究发现白洋淀沉积物中厌氧氨氧化菌都隶属于 Brocadia,具有较低的生
物多样性。 同位素示踪试验的结果表明厌氧氨氧化的活性在 0. 19—7. 78 nmol N g-1 h-1 范围,每年对氮损失
的贡献量为 56—9426 t / a。 本研究对于重新认识富营养化湖泊湿地的氮循环机理具有一定作用。
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8956 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 32,No. 21 November,2012(Semimonthly)
CONTENTS
Widespread of anaerobic ammonia oxidation bacteria in an eutrophic freshwater lake wetland and its impact on nitrogen cycle
WANG Shanyun, ZHU Guibing, QU Dongmei, et al (6591)
………
………………………………………………………………………
Responds of soil enzfyme activities of degraded coastal saline wetlands to irrigation with treated paper mill effluent
XIA Mengjing, MIAO Ying, LU Zhaohua, et al (6599)
…………………
……………………………………………………………………………
Wetland ecosystem health assessment of the Tumen River downstream ZHU Weihong,GUO Yanli,SUN Peng,et al (6609)…………
An index of biological integrity:developing the methodology for assessing the health of the Baiyangdian wetland
CHEN Zhan, LIN Bo, SHANG He,et al (6619)
………………………
……………………………………………………………………………………
MODIS鄄based analysis of wetland area responses to hydrological processes in the Dongting Lake
LIANG Jie, CAI Qing, GUO Shenglian, et al (6628)
………………………………………
………………………………………………………………………………
The diversity of invasive plant Spartina Alterniflora rhizosphere bacteria in a tidal salt marshes at Chongming Dongtan in the Yangtze
River estuary ZHANG Zhengya, DING Chengli, XIAO Ming (6636)………………………………………………………………
Analyzing the azimuth distribution of tree ring 啄13C in subtropical regions of eastern China using the harmonic analysis
ZHAO Xingyun, LI Baohui,WANG Jian, et al (6647)
………………
……………………………………………………………………………
In the process of grassland degradation the spatial pattern and spatial association of dominant species
GAO Fuyuan, ZHAO Chengzhang (6661)
…………………………………
……………………………………………………………………………………………
Activities of soil oxidordeuctase and their response to seasonal freeze鄄thaw in the subalpine / alpine forests of western Sichuan
TAN Bo, WU Fuzhong, YANG Wanqin, et al (6670)
………
………………………………………………………………………………
Simulating the effects of forestry classified management on forest biomass in Xiao Xing忆an Mountains
DENG Huawei, BU Rencang,LIU Xiaomei, et al (6679)
…………………………………
…………………………………………………………………………
The simulation of three鄄dimensional canopy net photosynthetic rate of apple tree
GAO Zhaoquan,ZHAO Chenxia, ZHANG Xianchuan, et al (6688)
………………………………………………………
………………………………………………………………
The effect of Phomopsis B3 and organic fertilizer used together during continuous cropping of strawberry (Fragaria ananassa Duch)
HAO Yumin, DAI Chuanchao, DAI Zhidong, et al (6695)
…
…………………………………………………………………………
Temporal and spatial variations of DOC, DON and their function group characteristics in larch plantations and possible relations
with other physical鄄chemical properties SU Dongxue,WANG Wenjie,QIU Ling,et al (6705)……………………………………
Comparisons of quantitative characteristics and spatial distribution patterns of Eremosparton songoricum populations in an artificial
sand fixed area and a natural bare sand area in the Gurbantunggut Desert, Northwestern China
ZHANG Yongkuan, TAO Ye, LIU Huiliang, et al (6715)
…………………………………
…………………………………………………………………………
Comparison study on macroinvertebrate assemblage of riffles and pools:a case study of Dong River in Kaixian County of Chongqing,
China WANG Qiang,YUAN Xingzhong,LIU Hong (6726)…………………………………………………………………………
Nekton community structure and its relationship with main environmental variables in Lidao artificial reef zones of Rongcheng
WU Zhongxin,ZHANG Lei,ZHANG Xiumei,et al (6737)
………
…………………………………………………………………………
Zooplankton diversity and its variation in the Northern Yellow Sea in the autumn and winter of 1959, 1982 and 2009
YANG Qing, WANG Zhenliang, FAN Jingfeng, et al (6747)
………………
………………………………………………………………………
Building ecological security pattern based on land use:a case study of Ordos, Northern China
MENG Jijun,ZHU Likai,YANG Qianet al (6755)
…………………………………………
…………………………………………………………………………………
Additive partition of species diversity across multiple spatial scales in community culturally protected forests and non鄄culturally
protected forests GAO Hong, CHEN Shengbin, OUYANG Zhiyun (6767)…………………………………………………………
Environmental perception of farmers of different livelihood strategies: a case of Gannan Plateau ZHAO Xueyan (6776)………………
Application and comparison of two prediction models for groundwater dynamics
ZHANG Xia,LI Zhanbin,ZHANG Zhenwen, et al (6788)
………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Pollination success of Phaius delavayi in Huanglong Valley, Sichuan HUANG Baoqiang, KOU Yong, AN Dejun (6795)……………
Mechanism of nitrification inhibitor on nitrogen鄄transformation bacteria in vegetable soil
YANG Yang, MENG Denglong, QIN Hongling, et al (6803)
………………………………………………
………………………………………………………………………
Archaea diversity in water of two typical brackish lakes in Xinjiang DENG Lijuan, LOU Kai, ZENG Jun, et al (6811)……………
Abundance and biomass of heterotrophic flagellates in Baiyangdian Lake, as well as their relationship with environmental factors
ZHAO Yujuan,LI Fengchao,ZHANG Qiang,et al (6819)
……
…………………………………………………………………………
Effects of bisphenol A on the toxicity and life history of the rotifer Brachionus calyciflorus
LU Zhenghe, ZHAO Baokun, YANG Jiaxin (6828)
……………………………………………
…………………………………………………………………………………
Effect of incubation temperature on behavior and metabolism in the Chinese cornsnake, Elaphe bimaculata
CAO Mengjie, ZHU Si, CAI Ruoru, et al (6836)
…………………………
…………………………………………………………………………………
Functional and numerical responses of Mallada besalis feeding on Corcyra cephalonica eggs
LI Shuiquan, HUANG Shoushan, HAN Shichou,et al (6842)
……………………………………………
………………………………………………………………………
Stability analysis of mutualistic鄄parasitic coupled system GAO Lei, YANG Yan, HE Junzhou, et al (6848)…………………………
Effect of ultra鄄micro powder qiweibaishusan on the intestinal microbiota and enzyme activities in mice
TAN Zhoujin,WU Hai,LIU Fulin,et al (6856)
………………………………
……………………………………………………………………………………
Review and Monograph
The effects of nitrogen deposition on forest carbon sequestration:a review
CHEN Hao, MO Jiangming, ZHANG Wei, et al (6864)
………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Effect of enhanced CO2 level on the physiology and ecology of phytoplankton
ZHAO Xuhui, KONG Fanxiang, XIE Weiwei, et al (6880)
…………………………………………………………
………………………………………………………………………
Transboundary protected areas as a means to biodiversity conservation SHI Longyu, LI Du, CHEN Lei, et al (6892)………………
Scientific Note
The energy storage and its distribution in 11鄄year鄄old chinese fir plantations in Huitong and Zhuting
KANG Wenxing,XIONG Zhengxiang,HE Jienan,et al (6901)
…………………………………
………………………………………………………………………
Spatial pattern of sexual plants and vegetative plants of Stipa krylovii population in alpine degraded grassland
REN Heng, ZHAO Chengzhang, GAO Fuyuan, et al (6909)
………………………
………………………………………………………………………
《生态学报》2013 年征订启事
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新方法、新技术介绍;新书评介和学术、科研动态及开放实验室介绍等。
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