全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (5): 611–617, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00611
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收稿日期: 2013-08-19; 接受日期: 2013-12-11
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金(No.GK201302048)、陕西师范大学科学研究项目(No.995878)和陕西省大学生创新创业训
练计划(No.CX13063)
* 通讯作者。E-mail: isaacsau@sohu.com
基于近红外漫反射光谱快速测定淫羊藿蛋白质含量
牛丽丽1, 张华峰1*, 陈乐1, 杨晓华2, 李璐1
1陕西师范大学食品工程与营养科学学院, 药用资源与天然药物化学教育部重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室,
西安 710062; 2西安交通大学医学院, 卫生部法医学重点实验室, 西安 710061
摘要 采用近红外漫反射光谱技术对淫羊藿(Epimedium)的蛋白质含量进行快速且无损检测。近红外漫反射光谱经二阶导
数处理、标准多元离散校正及主成分分析聚类处理后, 采用改进最小二乘法回归得到的定标模型预测效果最佳, 定标决定
系数、交互验证标准差及交互验证相关系数分别为0.923、0.554和0.717。近红外光谱分析法的测定结果与用凯氏定氮法
所得结果无显著差异, 两种方法测定值的相关性较高(R2=0.933 9)。重复性实验表明, 近红外光谱分析法的相对标准偏差为
0.937%。该研究首次采用近红外光谱分析法测定了8种淫羊藿的蛋白质含量。该方法简便、精确, 在淫羊藿资源开发利用
和药材质量控制方面具有参考意义。
关键词 近红外漫反射光谱, 蛋白质, 淫羊藿, 快速定量分析, 定标方程
牛丽丽, 张华峰, 陈乐, 杨晓华, 李璐 (2014). 基于近红外漫反射光谱快速测定淫羊藿蛋白质含量. 植物学报 49, 611–617.
凯氏定氮法(Aberoumand, 2009; Wu et al.,
2013)是目前主要的定量分析药用植物蛋白质的方
法。该方法的原理是蛋白质分解的氨与H2SO4结合后,
加碱使氨游离, 之后用硼酸吸收, 最后用HCl滴定,
根据含氮量计算出蛋白质的含量。经典的凯氏定氮法
包括消化、定容、蒸馏和滴定等实验步骤, 操作繁琐,
耗时较长, 并且需要消耗一定量的样品(Cerdà et al.,
1997)。近年采用的自动凯氏定氮法, 虽然简化了蒸
馏和滴定等步骤, 但是依然需要使用浓H2SO4等对样
品进行长时间的高温消化(Ferrara et al., 2011)。近红
外光谱检测技术具有快速、简单、准确、不损耗样品
(无损)和无污染等优点(Lu et al., 2012), 在药用植物
化学成分定量分析中具有良好的应用前景(Chen et
al., 2012)。本实验室与其它单位实验室分别开展了采
用近红外光谱检测技术鉴别药用植物淫羊藿产地和
测定淫羊藿黄酮类化合物含量的研究 (范茹军等 ,
2010; 于晓雪等, 2012; 薛耀碧等, 2013)。迄今尚未见
采用近红外光谱检测技术测定淫羊藿蛋白质含量的报
道。本研究拟建立一种简单、快速、准确且精密的淫
羊藿蛋白质近红外漫反射光谱检测的新方法, 并采用

该方法测定不同种淫羊藿的蛋白质含量, 为淫羊藿资
源开发利用和药用植物蛋白质定量分析提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与植物材料
Kjeltec2300型全自动凯氏定氮仪和InfraXact型多功
能近红外分析仪由瑞典FOSS公司生产。FW400A型
高速万能粉碎机购自北京科伟永兴仪器有限公司。
SZ-93型自动双重纯水蒸馏器由上海亚荣生化仪器厂
生产。BS224S型电子天平购自德国Sartorius公司。
浓H2SO4、K2SO4、CuSO4、HCl、NaOH、硼酸
和无水乙醇等均为分析纯。溴甲酚绿-甲基红指示液
用1%硼酸溶液将10 mL 1%溴甲酚绿溶液和7 mL 1%
甲基红溶液定容至1 L配制而成。
淫羊藿(Epimedium L.)药材采自全国10多个省
份, 共190个样品。药材采集后先拣去其中混杂的根
茎、杂草、虫卵和土块等, 然后用自来水及蒸馏水依
次清洗, 室温阴干后研磨、过筛(80目), 之后在55°C
下烘干(6小时), 冷却至室温后置于干燥器中贮存。

·技术方法·
612 植物学报 49(5) 2014
1.2 实验方法
1.2.1 蛋白质化学分析法
采用国家标准GB 5009.5-2010所述的自动凯氏定氮
仪测定淫羊藿样品粉末中蛋白质的含量(化学分析
值)。

1.2.2 近红外光谱分析法
取适量淫羊藿样品粉末倒入多功能近红外分析仪的
测量杯中 , 按照仪器使用规程进行扫描 , 波长为
570–1 848 nm, 每隔2 nm取1个点, 每个样品扫描3
次, 取平均值(薛耀碧等, 2013)。之后, 按照4:1的比
例将扫描得到的样品平均光谱值随机分成定标集和
验证集, 定标集与验证集分别用来建立和验证定标方
程。最后, 根据定标方程计算淫羊藿样品中蛋白质的
含量(近红外光谱分析值)。

1.2.3 软件分析方法
近红外漫反射光谱使用WinISI III软件进行分析(Zh-
ang et al., 2011; 薛耀碧等, 2013)。实验数据采用
SPSS 13.0软件进行统计和分析 (Zhang et al.,
2013)。
2 结果与讨论
2.1 蛋白质化学分析
表1列出了定标集、验证集和样品全集的化学分析值。
从表1可以看出, 2个子集——定标集和验证集中蛋白
质含量的最大值、最小值及平均值与样品全集十分接
近, 说明定标集和验证集的分组较为合理, 数据分散
程度较高且代表性较强。验证集中蛋白质含量的平均
值、标准差与定标集也很接近, 说明验证集数据的选
择较为合理, 可用于定标方程的验证。
2.2 蛋白质近红外光谱分析
2.2.1 近红外定标方程的建立
2.2.1.1 光谱扫描
图1为淫羊藿样品粉末的近红外光谱图。在扫描过程
中, 光谱信号内除了样品本身的结构信息外, 还夹杂
着散光和噪声等干扰信息。为了消除干扰信息的影响,
对近红外光谱的原始数据进行了一阶导数处理(1st
derivative)和二阶导数处理(2nd derivative)(图1)。

2.2.1.2 数学处理
先按照马氏距离H=3从定标样品中剔除超常样品 ,
再按照马氏距离H=0.6剔除定标时过剩的样品, 之后
利用剩余样品建立定标方程。通过无导数处理、一阶
导数处理和二阶导数处理3种方法对定标样品的近红
外光谱进行数学处理。结果见图1和表2。当光谱散
射处理方法为标准正则变换+散射处理(standard nor-
mal variant and de-trending, SNV+D)、聚类分析方
法为主成分分析 (principal components analysis,
PCA)及回归方法为改进最小二乘法(modified partial
least squares, MPLS)时, 二阶导数处理所得交互验
证相关系数(1 minus variance ratio, 1-VR)和定标决
定系数(R squared, RSQ)普遍比一阶导数处理及无
导数处理的1-VR与RSQ高; 交互验证标准差(stan-
dard error of cross-validation, SECV)和定标标准差
(standard error of calibration, SEC)普遍比一阶导数
处理及无导数处理的SECV与SEC低(表2); 二阶导
数处理图也相对光滑、集中且易于分辨(图1), 说明
二阶导数处理能够较好地消除基线漂移与背景干
扰。因此, 将数学处理条件确定为(2,4,4,1), 即对光
谱进行二阶导数处理, 导数处理的数据间隔点、平
滑处理间隔点和二次平滑处理间隔点分别为4、4
和1。


表1 定标集和验证集淫羊藿的蛋白质含量
Table 1 Protein content in Epimedium in dataset
Dataset Maximum value (%) Minimum value (%) Mean (%) Standard deviation
Total 14.895 10.418 12.979 0.925
Calibration set 14.892 10.418 12.982 0.933
Validation set 14.895 11.359 12.970 0.915

牛丽丽等: 基于近红外漫反射光谱快速测定淫羊藿蛋白质含量 613


图1 淫羊藿样品的近红外光谱(A)、一阶导数处理(B)和二阶导数处理(C)

Figure 1 Raw near infrared spectra (A), preprocessed spectra by 1st derivative (B) and preprocessed spectra by 2nd derivative
(C) of Epimedium samples


表2 定标样品经数学处理后的定标结果
Table 2 Results of calibration samples processed by mathematical treatments
SEC: 定标标准差; RSQ: 定标决定系数; SECV: 交互验证标准差; 1-VR: 交互验证相关系数
SEC: Standard error of calibration; RSQ: R squared; SECV: Standard error of cross-validation; 1-VR: 1 minus variance ratio



Derivative Gap Smooth Smooth 2 SEC RSQ SECV 1-VR
0 0 1 1 0.393 0.852 0.605 0.662
1 4 2 1 0.359 0.857 0.584 0.630
1 4 4 1 0.386 0.857 0.602 0.666
1 8 6 1 0.369 0.873 0.567 0.712
1 8 8 1 0.354 0.880 0.602 0.666
2 4 2 1 0.262 0.934 0.554 0.717
2 4 4 1 0.270 0.930 0.549 0.722
2 8 6 1 0.384 0.859 0.588 0.681
2 8 8 1 0.381 0.861 0.573 0.697
614 植物学报 49(5) 2014
2.2.1.3 光谱散射处理
光谱散射处理是消除系统噪音干扰定标模型的重要
方法(Zhang et al., 2011)。无散射处理(no scatter
correction, None)、SNV+D、标准正则变换(standard
normal variant, SNV)、散射处理(de-trending, D)、标
准多元离散校正(standard multiplicative scatter cor-
rection, SMSC)、加权多元离散校正(weighted multi-
plicative scatter correction, WMSC)和反相多元离散
校正(inverse multiplicative scatter correction, IM-
SC)7种光谱散射处理方法对定标方程的影响见表3。
当数学处理条件为(2,4,4,1)、聚类分析方法为PCA及
回归方法为MPLS时 , SNV+D、SNV与SMSC的
RSQ(0.930、0.923、0.923)和1-VR(0.722、0.717、
0.717)均分别高于None、D、WMSC与IMSC的RSQ
和1-VR; 同时, SNV+D、SNV与SMSC的SEC(0.270、
0.283、0.283)和SECV(0.549、0.554、0.554)也普遍
低于None、D、WMSC与IMSC的SEC和SECV。

2.2.1.4 聚类分析
为了提高定标样品集的代表性, 比较了PCA和单主
成分实验室分析(one principal component and labo-
ratory analysis, PL1)两种聚类分析方法对定标方程
的影响(表4)。PL1通过给扫描数据和蛋白质的实验室

表3 定标样品经光谱散射处理后的定标结果
Table 3 Results of calibration samples processed by spec-
trum scatter treatments
Scatter SEC RSQ SECV 1-VR
None 0.360 0.856 0.570 0.647
SNV+D 0.270 0.930 0.549 0.722
SNV 0.283 0.923 0.554 0.717
D 0.412 0.811 0.562 0.657
SMSC 0.283 0.923 0.554 0.717
WMSC 0.267 0.921 0.519 0.708
IMSC 0.283 0.923 0.559 0.712
None: 无散射处理; SNV+D: 标准正则变换+散射处理; SNV:
标准正则变换 ; D: 散射处理 ; SMSC: 标准多元离散校正 ;
WMSC: 加权多元离散校正; IMSC: 反相多元离散校正。SEC、
RSQ、SECV和1-VR同表2。
None: No scatter correction; SNV+D: Standard normal vari-
ant and de-trending; SNV: Standard normal variant; D:
De-trending; SMSC: Standard multiplicative scatter correc-
tion; WMSC: Weighted multiplicative scatter correction;
IMSC: Inverse multiplicative scatter correction. SEC, RSQ,
SECV and 1-VR see Table 2.

表4 定标样品经聚类分析后的定标结果
Table 4 Results of calibration samples processed by load-
ing types
Loading type Scatter SEC RSQ SECV 1-VR
PCA SNV+D 0.270 0.930 0.549 0.722
SNV 0.283 0.923 0.554 0.717
SMSC 0.283 0.923 0.554 0.717
PL1 SNV+D 0.331 0.887 0.521 0.719
SNV 0.333 0.885 0.529 0.711
SMSC 0.333 0.885 0.531 0.709
PCA: 主成分分析; PL1: 单主成分实验室分析。SEC、RSQ、
SECV和1-VR同表2。SNV+D、SNV和SMSC同表3。
PCA: Principal components analysis; PL1: One principal
component and laboratory analysis. SEC, RSQ, SECV and
1-VR see Table 2. SNV+D, SNV and SMSC see Table 3.


表5 定标样品经回归分析后的定标结果
Table 5 Results of calibration samples processed by re-
gression methods
Regression Scatter SEC RSQ SECV 1-VR
PCR SNV+D 0.734 0.400 0.791 0.321
SNV 0.734 0.400 0.791 0.320
SMSC 0.886 0.221 0.935 0.155
PLS SNV+D 0.47 0.784 0.649 0.606
SNV 0.47 0.784 0.649 0.606
SMSC 0.568 0.698 0.781 0.451
MPLS SNV+D 0.270 0.930 0.549 0.722
SNV 0.283 0.923 0.554 0.717
SMSC 0.283 0.923 0.554 0.717
PCR: 主成分回归; PLS: 最小二乘法; MPLS: 改进最小二乘法。
SEC、RSQ、SECV和1-VR同表2。SNV+D、SNV和SMSC同表3。
PCR: Principal component regression; PLS: Partial least-
squares; MPLS: Modified partial least-squares. SEC, RSQ,
SECV and 1-VR see Table 2. SNV+D, SNV and SMSC see
Table 3.

数据(化学分析值)打分来统计光谱间的差异; 而PCA
仅通过给扫描数据打分统计样品间的差异(Wu and
Shi, 2007)。当数学处理条件为(2,4,4,1), 回归方法为
MPLS, 光谱散射处理方法分别为SNV+D、SNV和
SMSC时, PCA的SEC均比PL1低, RSQ均比PL1高,
两者的SECV和1-VR则无明显差异, 因此选择PCA
为定标聚类分析方法。

2.2.1.5 回归分析
主成分回归(principal component regression, PCR)、
最小二乘法(partial least-squares, PLS)和MPLS三种

牛丽丽等: 基于近红外漫反射光谱快速测定淫羊藿蛋白质含量 615
回归分析方法对定标方程的影响见表5。当数学处理
条件为(2,4,4,1), 聚类分析方法为PCA, 光谱散射处
理方法分别为SNV+D、SNV和SMSC时 , MPLS的
RSQ(0.930, 0.923和0.923)和1-VR(0.722, 0.717和
0.717)均高于PCR与PLS的RSQ和1-VR, 因此选择
MPLS作为定标回归分析方法。

2.2.1.6 建立定标方程
根据定标参数优化结果和验证样品预测检验结果, 优
选出定标建模参数, 即数学处理条件为(2,4,4,1), 聚类
分析方法为PCA, 回归分析方法为MPLS, 光谱散射
处理方法为SMSC。在该条件下得到的定标方程即为
淫羊藿蛋白质快速且无损检测模型, 定标集预测模型
的RSQ、SECV与1-VR分别为0.923、0.554与0.717。

2.2.2 近红外光谱分析法的验证与评价
2.2.2.1 定标方程的验证
为了验证定标方程的可靠性 , 在数学处理条件为
(2,4,4,1)、聚类分析方法为PCA, 回归分析方法为
MPLS, 光谱散射处理方法分别为SNV+D、SNV和
SMSC条件下, 采用验证样品对定标方程进行验证,
结果见表6。从表6可以看出, 光谱散射处理方法为
SMSC时 , 验证样品预测检验所得到的RSQ高于
SNV+D及SNV的RSQ, 偏差 (Bias)低于SNV+D及
SNV的Bias, 说明定标时最佳的光谱散射处理方法为
SMSC。对于淫羊藿蛋白质的快速且无损检测在该参
数条件下定标方程的精确度可以接受。

2.2.2.2 近红外光谱分析法与凯氏定氮法的比较
为了进一步验证定标方程的可靠性和实用性, 将近红
外光谱分析法与凯氏定氮法的淫羊藿蛋白质测定结
果进行了比较, 发现两者无显著差异(P>0.05)。近红
外光谱分析值 (y)与化学分析值 (x)的回归方程为
y=0.933 9x+0.849 6 (R2=0.933 9)(图2)。

2.2.2.3 重复性实验
从定标集中随机选取淫羊藿样品粉末, 采用凯氏定氮
法与近红外光谱分析法分别多次重复测定蛋白质含
量。结果表明, 近红外光谱分析法的相对标准偏差
(relative standard deviation, RSD)为0.937%, 优于
凯氏定氮法(1.713%)。t检验分析显示, 近红外光谱分
析法与凯氏定氮法测得的蛋白质含量无显著差异(P>
0.05)。

2.2.3 样品测定
采用本研究建立的近红外漫反射光谱定量分析技术
测定了8种淫羊藿的蛋白质含量, 发现淫羊藿蛋白质
含量在种间差异较大, 其中长蕊淫羊藿(E. dolicho-
stemon)的蛋白质含量最高(14.852%), 偏斜淫羊藿
(E. truncatum)最低(12.262%)(表7)。
2.3 讨论
本研究建立了一种基于近红外漫反射光谱的淫羊藿
蛋白质定量分析方法, 该方法具有5方面优点。(1) 操
作步骤简单。淫羊藿样品检测流程如下: 制备淫羊藿
样品粉末→扫描近红外光谱→使用软件按照定标方
程计算蛋白质含量。(2) 检测速度快。省去了凯氏定
氮法的样品消化等环节。(3) 不破坏淫羊藿样品。样
品粉末在检测完成后还可用于其它实验。(4) 环境友
好。凯氏定氮法需要消耗浓H2SO4等化学试剂。(5) 准
确度和精密度均较好。作为一种新的蛋白质定量分析
方法, 该技术的局限性主要是定标方程建立过程中


表6 定标样品和验证样品经不同光谱散射处理后的定标结果
Table 6 Results of calibration and validation samples processed by different spectrum scatter treatments
Calibration sample Validation sample Scatter
SEC RSQ SECV 1-VR SEP RSQ SEC Bias
SNV+D 0.270 0.930 0.549 0.722 0.519 0.756 0.520 0.107
SNV 0.283 0.923 0.554 0.717 0.478 0.783 0.485 0.069
SMSC 0.283 0.923 0.554 0.717 0.497 0.824 0.509 0.019
SEP: 检验标准差。SEC、RSQ、SECV和1-VR同表2。SNV+D、SNV和SMSC同表3。
SEP: Standard error of performance. SEC, RSQ, SECV and 1-VR see Table 2. SNV+D, SNV and SMSC see Table 3.

616 植物学报 49(5) 2014


图2 凯氏定氮法与近红外光谱分析法测得淫羊藿蛋白质含量
的相关性

Figure 2 Correlation between protein contents in Epime-
dium determined by Kjedahl nitrogen determination method
and near-infrared reflectance spectroscopy method


表7 8种淫羊藿的蛋白质含量
Table 7 Contents of protein in eight species of Epimedium
Species Content (%) RSD (%)
Epimedium wushanense 13.622d 0.62
E. boreali-guizhouense 13.141e 1.45
E. chlorandrum 12.601f 2.13
E. myrianthum 14.126c 1.00
E. brevicornu 14.539ab 0.91
E. dolichostemon 14.852a 0.78
E. pubescens 14.199bc 0.60
E. truncatum 12.262f 0.73
RSD: 相对标准偏差。第2列中不同字母上标表示数据具有显著
差异(P<0.05)。
RSD: Relative standard deviation. Different superscript letters
in the second column mean significant differences (P<0.05).


对操作者的软件学习和运用能力要求较高, 但是方法
建立之后的实际样品检测过程则简便而精确。淫羊藿
是我国重要的药用植物, 在骨质疏松症防治中具有重
要作用(张华峰等, 2009; Zhang and Yang, 2012)。药
理学和营养学研究表明, 蛋白质摄入量对骨质疏松症
的防治具有重要影响, 蛋白质水平是衡量骨质疏松症
相关药物或保健食品质量的指标之一(Genaro and
Martini, 2010; Brown et al., 2011)。然而, 目前有关
淫羊藿化学成分的研究主要集中在黄酮类化合物、生
物碱、木脂素和萜类化合物等次生代谢产物方面(张
华峰和杨晓华, 2010), 缺乏蛋白质等初生代谢产物
的研究数据。本文报道了一种快速定量分析淫羊藿蛋
白质的近红外光谱分析法, 并采用该方法首次测定了
8种淫羊藿的蛋白质含量, 对淫羊藿资源开发利用和
药用植物蛋白质定量分析具有一定的参考价值。
致谢 陕西师范大学的牛鹏飞老师在仪器使用方面
给予了技术指导, 特此致谢！
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Rapid Quantification of Protein in Epimedium by
Near-infrared Reflectance Spectroscopy
Lili Niu 1, Huafeng Zhang 1*, Le Chen 1, Xiaohua Yang 2, Lu Li 1
1National Engineering Laboratory for Resources Development of Endangered Crude Drugs in Northwest China, Key
Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, College of Food Engi-
neering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China; 2Key Laboratory of Ministry of Health for
Forensic Sciences, School of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China
Abstract Near-infrared reflectance spectroscopy was used for rapid and nondestructive determination of proteins in
Epimedium. The calibration model was developed under the following conditions: second-derivative, standard
multiplicative scatter correction, principal component analysis and modified partial least-squares regression. R squared,
standard error of cross-validation and 1 minus variance ratio values were 0.923, 0.554 and 0.717, respectively. Protein
content did not differ by near-infrared reflectance spectroscopy or Kjedahl nitrogen determination methods, and their
relationship was close (R2=0.933 9). The proposed near-infrared reflectance spectroscopy method is a simple analytical
technique with satisfactory accuracy and repeatability (RSD=0.937%). Protein content in 8 species of Epimedium were
determined by near-infrared reflectance spectroscopy. The method shows great potential for protein assay in quality
control and resource utilization of Epimedium.
Key words near-infrared reflectance spectroscopy, protein, Epimedium, rapid determination, calibration equation
Niu LL, Zhang HF, Chen L, Yang XH, Li L (2014). Rapid quantification of protein in Epimedium by near-infrared
reflectance spectroscopy. Chin Bull Bot 49, 611–617.
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* Author for correspondence. E-mail: isaacsau@sohu.com
(责任编辑: 孙冬花)