全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 324–330, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00324
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收稿日期: 2010-11-12; 接受日期: 2010-12-06
基金项目: 国家自然科学基金(No.30671436)和林业公益性行业专项(No.201004048)
* 通讯作者。E-mail: peigu@caf.ac.cn
杨树试管苗嫩茎生根过程中内源IAA的免疫金银定位
董宁光1, 2, 高英2, 王伟2, 尹伟伦1, 裴东2*
1北京林业大学林学院, 北京 100083
2中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局森林培育重点实验室, 北京 100091
摘要 生长素类物质在木本植物生根过程中发挥重要作用。杨树生根与生长素的关系及生根过程中内源激素的变化已有大
量报道, 而生根过程中生长素的组织定位分析则尚未见报道。该文应用免疫化学分析方法对741杨(Populus alba × (P.
davidiana × P. simonii) × P. tomentosa)嫩茎生根过程中内源IAA在组织中的分布进行了研究。结果显示, 741杨的嫩茎在无
外源激素的1/2MS培养基上诱导10天后可生根, 14天后生根率达100%。诱导前, 嫩茎基部组织中几乎没有IAA信号; 诱导8
天后, 嫩茎基部维管组织中有大量的IAA积累, 而且中部的维管组织中也有明显的IAA信号(主要分布在韧皮部和维管形成
层); 10天后, 形成不定根原基, 此时IAA主要分布在根原基; 12天后, 根原基分化成不定根并突破表皮, IAA在不定根中的分
布主要集中在根尖和中柱。该文对741杨的嫩茎生根过程中IAA的组织分布特点及运输途径进行了讨论。
关键词 不定根, 吲哚乙酸, 免疫金银定位, 741杨, 嫩茎
董宁光, 高英, 王伟, 尹伟伦, 裴东 (2011). 杨树试管苗嫩茎生根过程中内源IAA的免疫金银定位. 植物学报 46, 324–330.
不定根发生既是植物器官分化的重要基础理论
问题, 又是关系到无性繁殖和完整植株再生等重大
实践问题。植物不定根发生机制的研究主要集中于不
定根发生的组织学、生理生化机制以及分子机制等方
面, 其中分子机制方面是目前研究的热点, 发展十
分迅速。大量实验证实, indole-3-acetic acid (IAA)
在调控植物不定根发生方面起着关键作用(Ludwig-
Müller et al., 2005; Ahmad et al., 2006; Xuan et al.,
2008)。通过施用外源生长素, 如IBA和NAA等, 已经
成功地诱导和促进了多种植物不定根的发生(马艳
等, 2004; 王清民等, 2006)。植物根原基的发生往往
伴随一个较高水平的生长素峰值的出现(Marks and
Simpson, 2000; 裴东等, 2003)。近年来, 随着植物
分子生物技术的应用, 特别是与生长素生物合成调
控和不定根发生相关基因的分离和鉴定 (Pagnu-
ssat et al., 2004; Sorin et al., 2005), 关于生长素调
控不定根发生的分子机制研究也取得了显著的进展。
虽然生长素调控不定根发生的分子机制研究在不断
深入, 但是细胞水平上的一些重要问题却仍不十分
清楚, 如: 调控不定根发生的生长素是在胞内作用
还是在胞外作用？是细胞本身产生的还是外运积累
的？不定根发生期间生长素水平的改变究竟发生在
哪部分组织或细胞中？在细胞水平上如何解释木本
植物不定根发生的难易？这些问题还有待进一步
研究。
过去研究激素的生理作用及其机理多采用整体
组织测定的方法, 但该方法存在很大的局限性, 如不
仅受到吸收、转运和内外因素的干扰, 而且也无法显
示出激素受体在细胞内的水平。而新近发展起来的免
疫金银技术为生长素的原位分析提供了可能, 特别是
近年来又对该分析技术进行了改进 (王幼群等, 2001;
Schwalm et al., 2003), 采用新型交联剂1-ethyl-3-
(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDAC)和制备
IAA单克隆抗体等手段, 成功解决了小分子IAA流动
性强和专一性的问题 , 获得了良好的 IAA原位分析
结果。
本研究使用IAA单克隆抗体并采用免疫金银技
术, 对杨树嫩茎不定根发生过程中IAA的空间分布和数
量变化进行了初步研究, 以期为进一步揭示IAA在调控
木本植物不定根发生过程中的作用机制奠定基础。
·技术方法·
董宁光等: 杨树试管苗嫩茎生根过程中内源 IAA的免疫金银定位 325
1 材料与方法
1.1 材料
在无菌条件下, 将741杨(Populus alba × (P. davidi-
ana × P. simonii) × P. tomentosa)的组培苗进行继代
培养, 培养基采用MS(Murashige and Skoog, 1962)
附加 0.3 mg·L–16-benzylaminopurine(6-BA)和 0.1
mg·L–1 indole butyric acid (IBA)。培养容器为圆柱状
培养瓶(350 mL), 培养温度(25±3)°C, 光照强度为
1 800 lux, 16小时光照/8小时黑暗。继代培养28次后,
选取生长健壮、高4.5–5.0 cm且基茎大于2 mm的嫩
茎为试材进行生根诱导。
1.2 方法
1.2.1 不定根的诱导
生根培养基为1/2MS培养基(不添加外源激素)。将嫩
茎扦插于内含100 mL固体培养基的350 mL培养瓶
中, 每瓶扦插4个嫩茎。培养条件同继代培养。培养
过程中观察并记录不定根的发生时间, 统计生根率。
所有实验处理数均不少于30个, 每个处理重复3次。

1.2.2 IAA的免疫金银定位
从诱导生根培养开始, 每隔1–2天取材1次。切取嫩茎
基部5 mm长的茎段, 用2%EDAC在室温下抽气固定
2小时, 经0.2 mol·L–1二甲砷酸钠缓冲液(pH7.2)冲洗
后, 转入4%多聚甲醛+1%戊二醛中, 室温下抽气固
定2小时, 4°C保存7–8小时。用0.2 mol·L–1二甲砷酸钠
缓冲液(pH7.2)将固定好的材料冲洗18–24小时, 然
后用50%乙醇开始的系列乙醇脱水后石蜡包埋, 转动
切片机切片, 切片厚度为8 μm, 明胶粘片剂粘片。染
色方法参照王幼群等(2001)所述方法并稍做改动。具
体操作步骤如下: (1) 切片常规脱蜡; (2) 用0.1%的胰
蛋白酶溶液于37°C处理5分钟; (3) 用含2.5%BSA的
TBST(0.05 mol·L–1Tris-HCl+0.15 mol·L–1NaCl+0.3%
Triton X-100, pH7.6)洗涤3次, 每次5分钟; (4) 用3
mol·L–1尿素消化20分钟; (5) 用TBST(含2.5%BSA)
洗涤3次, 每次5分钟; (6) 用TBSTG(TBST+10%正
常羊血清+2.5%BSA)37°C封闭1小时 ; (7) 加入经
TBSTG稀释400倍的一抗(购于中国农业大学), 37°C
静置温育2小时; (8) 用TBST(含2.5%BSA)洗涤3次,
每次5分钟; (9) 加入经TBSTG稀释50倍的金标二抗,
37°C静置温育30分钟; (10) 用TBST(含2.5%BSA)洗
涤3次, 每次5分钟; (11) 蒸馏水冲洗3次, 每次10分
钟 ; (12) 硝酸银显影剂(0.1 mol·L–1柠檬酸缓冲液
+2%明胶+1 g·L–1AgNO3, 17 g·L–1对苯二酚, pH3.5)
在25°C下避光显色10–15分钟; (13) 自来水冲洗以
终止反应, 显微镜下观察并拍照。
为了验证结果的可靠性, 本实验设置了如下对
照: (1) 省略IAA抗体, 其余染色程序相同; (2) 不用
EDAC进行固定, 其余染色程序相同; (3) 用正常血
清代替IAA抗体, 其余染色程序相同。

1.2.3 银颗粒的统计
IAA的免疫信号为银颗粒, 代表IAA在组织中的原位
分布。在油镜(物镜100×, 目镜10×)下统计各个组织
的银颗粒数量, 并计算单位面积上的银颗粒数量。每
个组织观察30个视野。最后进行显著性统计分析。

1.2.4 数据统计分析
数据使用SAS系统中AVOVA程序进行统计分析, 按
照邓肯氏新复极差分析法进行多重比较。如无特殊标
记, 每个处理包含30个外植体, 设3次重复。
2 结果与讨论
2.1 嫩茎不定根的发生
杨树嫩茎在无外源激素的1/2MS基本培养基上其生
根结果见图1。经过10天的培养, 可以直接观察到不
定根的发生, 多发生于嫩茎基部3 mm处; 12天后可
以明显地看到粗而长的不定根, 每个嫩茎发根3–4条;
14天后统计其生根率为100%。
2.2 嫩茎生根诱导过程中的IAA分布规律和特点
采用免疫组织化学定位方法, 研究了741杨嫩茎生根
过程不同时期IAA的分布情况, 并统计了银颗粒密度,
结果如图2–图4所示。
嫩茎不定根诱导前期, 基部组织中的IAA分布较
少(图2A), 银颗粒在皮层、维管束和髓的密度分别为
3.9/100、4.1/100和3.8/100·μm–2(图3)。在生根培养
基中培养8天, 茎基部开始局部(或全部)膨大。镜检结
果显示, 维管形成层细胞已经分裂, 由原来的2–3层
细胞增至5–6层, 此时维管组织中的IAA含量明显增
326 植物学报 46(3) 2011


图1 741杨嫩茎在1/2MS培养基上的生根培养

Figure 1 In vitro rooting of poplar 741 shoots on 1/2 MS
medium


加(图2B)。统计结果显示, 此时银颗粒在维管组织中
的密度显著增加, 从4.1/100·μm–2增加到286.8/100·
μm–2(P<0.01)(图3), 而皮层和髓中的银颗粒密度则
没有显著性变化。培养8天后, 嫩茎中部的维管组织
中也有明显的 IAA分布(图2C), 且主要分布在韧皮
部、形成层及其周围的衍生细胞(图2C1, C2)。统计
结果显示, 银颗粒在嫩茎中部维管组织中的密度为
205.3/100·μm–2(图4), 低于基部维管组织中银颗粒
的密度。
2.3 新生根原基和幼根中IAA的分布规律及特点
培养10天后, 镜检结果显示, 形成层进行平周和垂周
分裂, 形成一球形细胞团, 朝向韧皮部突起, 发育成
根原基轮廓, 此时IAA主要集中分布在根原基(图2D),
在维管组织中的分布有所降低。统计结果显示, 此时
银颗粒在根原基的密度明显高于皮层、维管组织和髓
(P<0.01)(图3)。培养12天后, 根原基不断生长分裂,
进而穿越韧皮部、皮层和表皮, 形成不定根。同时, 靠
近原形成层的细胞分化形成维管分子并与母体维管
组织相连, 此时IAA主要分布在根尖生长点和根维管
柱 (图2E), 其银颗粒密度分别为218.9/100·μm–2和
50.7/100·μm–2(图3)。为了检验IAA免疫金银定位结果
的可靠性, 本研究设立了相应的对照实验。图2F是诱
_______________________________________________________________________________________________
→
图2 741杨嫩茎生根过程中的IAA免疫金银定位
(A) 741杨嫩茎诱导生根前的基部横切片, IAA分布很少(Bar=100 μm); (B) 培养8天后嫩茎基部的横切片, IAA主要分布在维管组织
(Bar=100 μm); (C) 培养8天后嫩茎中部的横切片, IAA主要分布在维管组织(Bar=100 μm); (C1) 图(C)中黑色方框区域的放大, IAA
主要分布在形成层和韧皮部(Bar=200 μm); (C2) 图(C1)中白色方框区域的放大, 有明显的银颗粒(Bar=10 μm); (D) 培养10天后嫩
茎基部的横切片, IAA主要分布在根原基(Bar=100 μm); (E) 培养12天后根的纵切片, IAA主要分布在根尖和根维管柱(Bar=200 μm);
(F) 培养8天后嫩茎基部的横切片, 染色时省略了IAA单克隆抗体, 没有IAA信号显示。组织切片在固定时不用EDAC进行前固定, 或
者在染色时用正常的小鼠血清代替IAA单克隆抗体, 结果相同(Bar=100 μm)。 Co: 皮层; Ph: 韧皮部; Pi: 髓; Rp: 不定根原基; Rt:
根尖; Rv: 根维管柱; Vb: 维管束; Vc: 维管形成层; Xy: 木质部

Figure 2 Immunogold silver localization of IAA in poplar 741 during rooting
(A) Immunolocalization of IAA in transverse sections of the basal regions of poplar 741 shoots prior to in vitro culture, a weak IAA
signal was detected (Bar=100 μm); (B) Immunolocalization of IAA in transverse sections of the basal regions of poplar 741
shoots after 8 days of in vitro culture, IAA was mainly distributed in vascular tissues (Bar=100 μm); (C) Immunolocalization of IAA
in transverse sections of the middle regions of poplar 741 shoots after 8 days of in vitro culture, IAA was mainly distributed in
vascular tissues (Bar=100 μm); (C1) Details of boxed area in (C), IAA was mainly distributed in cambium and phloem (Bar=200
μm). (C2) Details of boxed area in (C1), a strong IAA signal was detected (Bar=10 μm); (D) Immunolocalization of IAA in trans-
verse sections of the basal regions of poplar 741 shoots after 10 days of in vitro culture, IAA was mainly distributed in root pri-
mordium (Bar=100 μm); (E) Immunolocalization of IAA in longitudinal sections of adventitious roots on the basal regions of poplar
741 shoots after 12 days of culture, IAA was mainly distributed in root tip and root vascular cylinder (Bar=200 μm); (F) Transverse
sections of the basal regions of poplar 741 shoots after 8 days of culture when the primary antibody was omitted. Sections of the
following controls also resulted in no signal, similar to (F): without EDAC pre-fixation and incubation with substitute normal mouse
serum (Bar=100 μm). Co: Cortex; Ph: Phloem; Pi: Pith; Rp: Root primordium; Rt: Root tip; Rv: Root vascular cylinder; Vb: Vas-
cular bundle; Vc: Vascular cambium; Xy: Xylem
董宁光等: 杨树试管苗嫩茎生根过程中内源 IAA的免疫金银定位 327
导8天后嫩茎基部的横切照片, 在免疫程序中省略了
IAA单克隆抗体, 其它步骤相同, 结果显示几乎没有
IAA信号。组织切片在固定时不用EDAC进行前固定,
或者在染色时用正常的小鼠血清代替IAA单克隆抗
体 , 所得结果与图2F类似 , 也几乎没有 IAA信号显
示。实验结果表明本研究所用的免疫分析方法可靠。
2.4 讨论
本研究中, 741杨嫩茎在无外源激素的培养基上培养
10天后可以生根。由于在该不定根发生体系中没有施
加外源生长素, 故此体系非常适合研究生根过程中内
源IAA的动态含量变化。因为没有外源生长素的参与,
可以假设诱导培养导致了内源IAA在嫩茎中的合成、


328 植物学报 46(3) 2011


图3 741杨嫩茎生根过程中基部不同组织部位的银颗粒密度
Co、Vb、Pi、Rp、Rt和Rv同图2。

Figure 3 Density of silver particles in sections of the basal
regions of poplar 741 shoots at different points during de-
velopment
Co, Vb, Pi, Rp, Rt and Rv see Figure 2.




图4 诱导8天后741杨嫩茎中部不同组织部位的银颗粒密度
Co、Vb和Pi同图2。

Figure 4 Density of silver particles in sections of the middle
regions of poplar 741 shoots after 8 days of in vitro culture
Co, Vb and Pi see Figure 2.


重新分布或者从非活性状态释放。用常规的激素测定
方法, 如酶联免疫测定法或高效液相色谱法等, 则不
能检验这个假设, 原因是在IAA的抽提过程中, IAA的
空间分布信息被破坏了。此外, 用常规测定方法检查
内源激素, 需要大量的材料, 且所测的激素浓度实际
上是几百乃至几千个细胞的平均值, 可事实上在很多
植物的生长发育时期, 激素变化的最初阶段往往仅限
于几个或几十个细胞。本研究中, 我们采用免疫金银
定位技术对741杨嫩茎生根过程中IAA的原位分布进
行了初步研究。
Blakesley等(1991)的研究表明, 内源激素水平
与不定根的发生能力有关, 一些可以增加内源生长素
水平的突变体能够产生较多的不定根(Barlier et al.,
2000)。另外一些研究显示, 不定根的发生能力与内
源IAA水平没有直接的联系(Ford et al., 2002; Kri-
santini et al., 2006)。本研究发现, 在嫩茎未被诱导
前, 其基部组织中的IAA分布很少(图2A), 此结果与
Gatineau等(1997)的研究结果相反。可见仅仅通过嫩
茎基部的起始IAA水平并不能够判断不定根的发生能
力, 因为在不定根发生的起始阶段, 嫩茎基部的IAA
水平会受到多种因素的影响 , 如 IAA在嫩茎中的合
成、运输、代谢、贮藏以及在组织中的重新分布。
在不定根诱导的早期阶段, 内源IAA水平有一个
短暂的升高(Gatineau et al., 1997), 但具体在哪部分
组织或细胞中升高, 目前仍不清楚。本研究结果发现,
生根诱导8天后 , 嫩茎基部的维管组织中有强烈的
IAA信号(图2B), 说明IAA在维管组织的积累启动了
不定根的发生。维管组织中IAA水平的改变可以调控
不定根的发生还表现在对转“抗生长素”基因植物的
研究, IAAL基因是吲哚乙酰胺赖氨酸酯合成酶基因,
该酶能够催化游离的IAA与赖氨酸形成无生理活性的
结合物 IAA-lysine, 将该基因在烟草 (Nicotiana ta-
bacum)维管组织中特异表达可降低烟草不定根的发
生能力(徐莺等, 1999)。生长素的极性运输与韧皮部
的参与密切相关(Goldsmith, 1977)。在本实验中我们
发现, 嫩茎生根诱导8天后, 基部维管组织中有大量
的 IAA积累 , 而且嫩茎中部维管组织中也有明显的
IAA信号, 主要分布在韧皮部、形成层及其衍生细胞
中(图2C1、C2)。我们推测积累在嫩茎基部调控不定
根发生的IAA并非原位产生, 而是由其它组织器官运
输而来, 运输途径是维管组织的韧皮部。本研究不仅
在细胞水平上用免疫金银定位技术对不定根诱导早
期的IAA进行了定位, 而且为韧皮部是内源IAA的运
输途径提供了直接证据。
Blakesley(1994)认为不定根原基的诱导与局部
IAA水平的升高同时发生, 早期的细胞分裂和根原基
的组建则伴随发生IAA水平的下降。但是本研究结果
董宁光等: 杨树试管苗嫩茎生根过程中内源 IAA的免疫金银定位 329
表明, 根原基显示明显的IAA信号(图2D), 本结果与
前人研究结果不同的原因可能是: 在不定根发生时,
只有少数细胞参与了不定根的形成(Li et al., 1991),
而前人用常规测定激素的方法则无法测得IAA在靶细
胞内的真实水平, 其所得数据必然与实际IAA水平有
差距。当根原基进一步分化形成不定根后, IAA信号在
根尖生长点强烈分布(图2E), 该结果与Shi等(1993)
和Sabatini等(1999)的研究结果一致。Shi等(1993)运
用免疫胶体金电镜技术, 研究发现在玉米(Zea mays)
的根尖中IAA主要分布在细胞核、液泡、线粒体、高
尔基体及其衍生囊泡中。Sabatini等(1999)运用DR5::
GUS生长素报告基因间接发现IAA积累在根尖细胞的
囊轴中。
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Immunogold Silver Localization of Indole-3-acetic Acid (IAA)
During the Rhizogenesis of In Vitro Poplar
Ningguang Dong1, 2, Ying Gao2, Wei Wang2, Weilun Yin1, Dong Pei2*
1College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2Key Laboratory of Silviculture of the State Forestry
Administration, Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract Endogenous auxin, or indole-3-acetic acid (IAA), plays a central role during root induction in woody plants. The
relationship between auxin and root formation and the changes in levels of endogenous hormones in the rhizogenesis of
poplar has been studied for many years, but the tissue-specific localization of auxin in rhizogenesis has not been reported.
We investigated the distribution of endogenous IAA in shoots of poplar in vitro using immunocytochemistry during root
induction. Poplar 741 shoots were rooted at day 10 of in vitro culture on 1/2 MS medium without exogenous growth
regulators. The rooting rate was up to 100% at day 14. Before root induction, a weak signal was detected throughout the
basal region of the freshly excised shoots. At 8 days after induction, a strong IAA immune reaction was observed in the
vascular bundle tissues of the basal region of the shoots, and the vascular bundle tissues of the middle region also
showed an IAA signal mainly distributed in phloem and vascular cambium. At 10 days after induction, the cells of the
vascular cambium dedifferentiated and developed into visible root primordia, which bore a strong IAA signal. At 12 days
after induction, the root primordia developed into adventitious roots and broke through the stem epidermis, with marked
IAA signal detected in root tips and root vascular cylinder. We discuss the characteristics of tissue-specific distribution of
IAA and the likely transport route during the rhizogenesis of poplar 741 shoots.
Key words adventitious root, IAA, immunogold silver localization, poplar 741, shoots
Dong NG, Gao Y, Wang W, Yin WL, Pei D (2011). Immunogold silver localization of indole-3-acetic acid (IAA) during the
rhizogenesis of in vitro poplar. Chin Bull Bot 46, 324–330.
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* Author for correspondence. E-mail: peigu@caf.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)