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Distribution Characteristics of Arsenic in Medicinal Plants Panax notoginseng′s Taproots Tissue and Subcellular Components

砷在药用植物三七根部组织及其亚细胞分布特征


采用同步辐射X射线荧光分析(SRXRF)与亚细胞分布研究相结合的方法, 从细胞组织微区及亚细胞分布层面首次揭示了药用植物三七(Panax notoginseng)受砷(As)的毒害作用。研究结果表明, 三七根部的As元素多集中在表皮组织中, 且有向维管束运转的趋势; 细胞液是As主要富集的亚细胞组分, 用20 mg·L-1 As处理的三七细胞液中As含量约为不加As的200倍; 分析三七主根亚细胞组分的As含量与营养液As浓度的曲线拟合方程, 确定了营养液As浓度直接影响细胞液组分的As含量; 各组分所占比例从大到小表现为: 细胞液>细胞壁>细胞质, 20 mg·L-1 As处理的细胞液中砷含量约占三组分总量的65.78%, 达到最高比例, 细胞壁和细胞器中则始终维持较低的砷浓度。

We used synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) and subcellular distribution research methods to study the characteristics of arsenic (As) in roots of Panax notoginseng and subcellular distribution. Arsenic distributed on the root epidermis of P. notoginseng and had a tendency to migrate to vascular bundle. Cytoplasmic supernatant represented the mainly concentration of subcellular components, and the cytoplasmic supernatant arsenic content of 20 mg·L-1 was 200 times of CK. We analyzed the quadratic regression equation of arsenic content in subcellular constituents of P. notoginseng taproots and As concentrations in nutrient solution and found a direct relationship between As content in the subcellular constituents and the environment. The proportion of each constituent was in the order of cytoplasmic supernatant > cell wall > cytoplasmic organelles. The cytoplasmic supernatant content of 20 mg·L-1 As was the highest, accounting for about 65.78%, and cytoplasmic organelles and the cell wall always maintained low levels of As.


全 文 :植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (5): 591–597, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB14131
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收稿日期: 2014-07-16; 接受日期: 2014-12-23
基金项目: 国家自然科学基金(No.21267024)、云南省科技计划青年项目(No.2014FD063)和云南省创新人才培养计划项目(No.2014-
HB059)
* 通讯作者。E-mail: zhoumiqu@163.com
砷在药用植物三七根部组织及其亚细胞分布特征
陈璐1, 米艳华1*, 万小铭2, 袁志伟3, 尹本林1, 和丽忠1
1云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所, 昆明 650221; 2中国科学院地理科学与资源研究所, 北京 100101
3昆明医学院第二附属医院, 昆明 650101
摘要 采用同步辐射X射线荧光分析(SRXRF)与亚细胞分布研究相结合的方法, 从细胞组织微区及亚细胞分布层面首次揭
示了药用植物三七(Panax notoginseng)受砷(As)的毒害作用。研究结果表明, 三七根部的As元素多集中在表皮组织中, 且
有向维管束运转的趋势; 细胞液是As主要富集的亚细胞组分, 用20 mg·L–1 As处理的三七细胞液中As含量约为不加As的
200倍; 分析三七主根亚细胞组分的As含量与营养液As浓度的曲线拟合方程, 确定了营养液As浓度直接影响细胞液组分的
As含量; 各组分所占比例从大到小表现为: 细胞液>细胞壁>细胞质, 20 mg·L–1 As处理的细胞液中砷含量约占三组分总量
的65.78%, 达到最高比例, 细胞壁和细胞器中则始终维持较低的砷浓度。
关键词 三七, 砷, 同步辐射X射线荧光分析, 亚细胞分布
陈璐, 米艳华, 万小铭, 袁志伟, 尹本林, 和丽忠 (2015). 砷在药用植物三七根部组织及其亚细胞分布特征. 植物学报 50,
591–597.
三七(Panax notoginseng)是五加科人参属多年
生珍稀药用草本植物, 在我国中医药事业中占有重要
地位, 其原产地及主产区位于云南省文山州境内, 已
有400多年的栽培历史(王朝梁等, 2004)。同时文山矿
产资源丰富, 李卫东(2004)对三七种植区环境质量调
查结果显示, 砷的污染分担率为52.1%, 综合污染指
数为0.67, 已逼近警戒线。环境污染已威胁到区域内
种植三七的质量安全, 对三七的药用安全和出口贸易
有很大影响。此后, 阎秀兰等(2011)指出土壤中砷含
量会影响三七药用主根的安全品质及健康风险, 砷污
染日益受到社会的广泛关注。
已有学者从中药材三七对土壤砷累积过程、耐性
机理、含量测定及健康评价等方面进行了大量研究
(冯光泉等, 2004; 阎秀兰等, 2011; Yan et al., 2012;
Liu et al., 2013; 陈璐等, 2014), 但砷在三七细胞组
织微区及亚细胞分布层面的研究较少。同步辐射X射
线荧光分析(synchrotron radiation X-ray fluorescen-
ce, SRXRF)具有高灵敏度、低损伤、多元素同时检
测及可以进行活体分析等优点, 是目前研究生物和环
境样品中元素含量及微区分布的理想手段(陈同斌等,
2003; Wang et al., 2011; Lin et al., 2013), 有助于了
解元素在细胞 (或组织 )水平上的运移途径和过程
(Bhatia et al., 2003), 已广泛用于环境和生命科学等
领域(Wang et al., 2013)。但由于受射线聚焦光斑大
小的限制, 目前尚不能确定重金属在植物亚细胞水平
上的分布(Zeng et al., 2010; Zheng et al., 2011)。本
研究采用μ-SRXRF和组织分离-差速离心相结合的方
法, 对药用植物三七根系中砷元素的分布特征进行了
探讨, 以期揭示药用植物三七对As的吸附特征及As
对三七的毒害效应。
1 材料与方法
1.1 植物培养
选取实验基地生长环境良好、长势一致(株高、茎粗
和叶面积等基本相同)并且健壮的一年生三七(Panax
notoginseng (Burkill) F. H. Chen ex C. H. Chow)幼
苗进行不同浓度As的水培实验 , 添加砷化合物为
Na2HAsO4·12H2O。水培实验采用完全营养液配方(冯
光泉等, 2003), 并结合三七生长特性进行适当调整,
·研究报告·
592 植物学报 50(5) 2015
配置营养液的试剂均为分析纯。在加As处理前10天进
行预培养, 期间每3天更换1次营养液。设置4个处理,
分别为CK (不添加砷)、10 mg·L–1 As、20 mg·L–1 As
和40 mg·L–1 As。各处理设3次重复, 并放置于遮阴避
光处, 透光率为8%–12%, 温湿度适宜且通风较好的
环境中进行培养。
1.2 亚细胞组分的分离
培养10天后, 分别剪取生长良好植株的根、茎和叶组
织各2.00 g用于亚细胞组分分级实验。参照Weigel和
Jäger (1980)及Pathore等(1972)建立的亚细胞分级
方法, 将预冷的匀浆液在玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液
组成: 0.25 mmol·L–1蔗糖、50 mmol·L–1 Tris-HCl缓冲
液(pH7.8)和1 mmol·L–1赤藓糖醇, 匀浆液pH为7.8。
匀浆和分离过程温度均控制在4°C。具体步骤如下:
将体积为15–20 mL的匀浆液及组织放入50 mL离心
管中, 组织匀浆液在高速冷冻离心机中于225 ×g离
心10分钟, 下部沉淀中底层碎片为细胞壁(F1)组分;
上清液在18 450 ×g离心90分钟, 底层碎片为细胞质
(F2)组分, 主要为各种细胞器的膜结构; 上层清液为
细胞液(F3)组分, 包括细胞质和液泡内大分子有机物
及无机离子(周卫等, 1999)。将亚细胞组分F1、F2和
F3转入陶瓷坩埚中, 70°C烘干至恒重, 加入10 mL
HNO3和0.5 mL HClO4, 摇匀过夜, 在电热板上缓慢
加热消煮至清亮, 用超纯水定容至50 mL。样品中的
As用电感耦合等离子体质谱仪(ELAN DRC-e)测定,
植物样品分析中所用试剂均为优级纯, 并采用国家标
准参比物质(植物: GBW-07403)进行分析质量控制,
分析误差均在允许的范围内。
1.3 X射线吸收光谱测定
选取新鲜三七幼苗的主根中部 , 进口包埋剂OCT
(optimum cutting temperature compound)包埋后 ,
用LEICA CM1950冷冻切片机–20°C下切片(Ager et
al., 2002), 切片厚度为10 μm。将冷冻切片黏附于迈
拉膜固定在样品框上 , –80°C冷冻干燥后用于μ-
SRXRF扫描。μ-SRXRF分析在北京正负电子对撞机
同步辐射实验室(BSRF) 4W1B应用微束光束线站进
行。实验条件:储存环电子能量为2.5 GeV, 束流强
度为150–200 mA, 调节水平和垂直两个狭缝, 将入
射白光的光斑限制在大小为20 μm×20 μm, 探测器
为Si (Li)固体探测器及能谱仪系列。样品与入射光线
成45°角, 扫描步长为200 μm, 每个扫描点的时长为
60秒。同步辐射X荧光射线微束激发三七样品的能量
数据, 使用软件PyMCA进行处理, 用OriginPro8.0软
件绘制三七主根As元素分布图。另取对应部位冷冻切
片, 用稀番红液(1%)快速染色, 在OLYMPUS BH-2
型显微镜下观察其结构。
2 结果与讨论
2.1 As在三七主根微区的分布特点
为了解As在三七根部的分布特征 , 本研究利用
μ-SRXRF技术对4组实验处理的三七根部横切面上
的元素进行了荧光光谱分析, 结果见图1。图中绿色
至红色依次表示检测到As区域浓度由低到高, 图1E
和F为低倍显微镜下检测区域的全景图。从总体上看,
三七主根As元素分布多集中在表皮细胞组织中, 随
着处理营养液As浓度的提高, As元素在维管束组织
中出现且含量增加。不添加As处理(对照)的主根横切
面仍然可检测到少量的As (图1A), 可能是由于化学
试剂带入极微量的含As杂质, 使该处理营养液中也
含有极微量的As (5.0×10–4 mmol·L–1), 致使主根含
有少量As元素。随着实验处理营养液As浓度的增加,
检测出三七主根As区域和As含量都有增加, As含量
随着实验设置浓度的增加而升高, 最高值由49.80
mg·kg–1 (对照)上升至57.80 mg·kg–1 (20 mg·L–1 As)
(图1C); 而实验设置为10和40 mg·L–1 As (图1B, D)
处理时, 检测出的As含量最高值相近, 分别为53.40
和54.4 mg·kg–1, As含量呈现先增加后降低趋势, 且
在20 mg·L–1实验设置(图1C)中检测值达到最高。这可
能是由于微量或少量As有刺激植株生长的作用
(Wang et al., 2008; 丁枫华等, 2010), 促进了三七幼
苗的生长, 增加了植株的物质积累, 导致As含量呈增
加的趋势; 当参试植株在高As (40 mg·L–1 As)环境中
培养10天后, 与培养初期植株状态(图2A)和健康的根
部(图2C)相比, 表现出明显的As毒害症状, 植株叶片
边缘干枯、萎蔫死亡(图2B), 须根组织逐渐坏死并呈
腐烂状(图2D)。通过对其主根荧光扫描分析可以看出,
维管束组织中As的检出区域明显多于其它低浓度As
处理(图1D), 说明As出现向维管束组织转运的趋势,
但最高检出量却低于20 mg·L–1 As处理。这可能是由
陈璐等: 砷在药用植物三七根部组织及其亚细胞分布特征 593

图1 不同处理三七主根横切片中As的分布及其同步辐射X射线荧光元素图
(A) 0 mg·L–1 As; (B) 10 mg·L–1 As; (C) 20 mg·L–1 As; (D) 40 mg·L–1 As; (E) 显微镜扫描区域图; (F) 区域放大图

Figure 1 The Arsenic distribution in cross sections and synchrotron X-ray fluorescence elemental maps for As of taproots of
Panax notoginseng
(A) 0 mg·L–1 As; (B) 10 mg·L–1 As; (C) 20 mg·L–1 As; (D) 40 mg·L–1 As; (E) Microscope scanned bitmaps; (F) Regional enlargement
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图2 三七植株的表型
(A) 水培实验初期 (B) 水培10天后; (C) 正常根系; (D) 腐烂根系(40 mg·L–1 As处理)

Figure 2 The phenotype of Panax notoginseng
(A) The initial stage of hydroponics experiment; (B) 10-day later; (C) Normal root system; (D) Root-rots of 40 mg·L–1 As


表1 不同浓度As处理对三七主根中As亚细胞分布的影响
Table 1 As concentration in subcellular fractions from Panax notoginseng taproots with different As levels
Arsenic contents (mg·kg–1) Arsenic concentration
(mg·L–1) Cell wall Cytoplasmic organelles Cytoplasmic supernatant
0 0.723±0.136 Aa 2.640±0.000 Ab 0.354±0.264 Aa
10 18.910±4.709 Ba 19.870±3.691 Ba 48.425±6.640 Bb
20 17.120±0.000 Ba 19.715±3.670 Ba 70.795±1.633 Cb
40 26.747±1.701 Ca 28.237±3.808 Ba 64.255±0.544 Cb
不同大写字母表示相同组分不同浓度As处理间差异显著(P<0.05); 不同小写字母表示相同浓度As处理下不同组分间As含量差异显
著(P<0.05)。
Different capital letters indicate significant difference between different concentrations of As (P<0.05); Different lowercase letters
indicate significant difference in As content among different groups (P<0.05) at the same concentration of As.

于高浓度(40 mg·L–1) As处理导致参试三七出现毒害
症状, 抑制了根系活性, 阻碍了其吸收营养成分, 并
抑制其向地上部输送水分及养分的能力(Bunzl et al.,
2001)。这与陈同斌等(2003)研究超富集植物蜈蚣草
(Pteris vittata)及田生科(2010)研究超积累植物东南景
天(Sedum alfredii)时, 得出的As和Cd的运转趋势相
似; 不同之处在于高浓度As对药用植物三七会产生根
部腐烂、植株萎蔫直至死亡的毒害症状, 而超累积植
物却仍能正常生长。
2.2 三七主根中As的亚细胞分布
三七主根亚细胞组分中As的分布情况如表1所示。不
加As (对照)处理, 根部各组分的As浓度均很低, 除
细胞质As含量(2.64 mg·kg–1)高出1 mg·kg–1外, 细胞
壁和细胞液均低于1 mg·kg–1。与对照相比, 所有处理
各组分的As含量均明显增加, 其中细胞壁和细胞质
组分均在40 mg·L–1 As处理时As含量最高, 分别为
26.747和28.237 mg·kg–1, 显著高于低浓度As处理;
陈璐等: 砷在药用植物三七根部组织及其亚细胞分布特征 595
10和20 mg·L–1 As处理间无显著差异, 但20 mg·L–1
As处理的细胞壁和细胞质组分中检测出As含量略低
于10 mg·L–1 As处理。细胞液组分检测出在20 mg·L–1
As处理时As含量最高, 约是对照处理的200倍, 增幅
最大; 而高浓度(40 mg·L–1) As处理时却出现As含量
减少的现象。综合分析, 随着营养液As浓度的不断升
高, 细胞壁和细胞质组分的As含量也明显增加, 而细
胞液组分中As含量在高浓度(40 mg·L–1) As处理时略
有下降, 最高As含量为20 mg·L–1 As处理。出现这种
情况的原因是根部细胞液对As的耐受程度有限, 超
过其耐受限度之后出现抑制植株生长和萎蔫死亡的
砷中毒症状, 使植株减少或不再吸收As, 从而导致高
浓度As处理的三七植株As含量呈下降趋势。这与之
前的研究结果一致, 细胞液较细胞壁和细胞质中As
元素浓度高(陈同斌等, 2003, 2005; Wang et al.,
2008), 可能是由于细胞液是新陈代谢的主要场所(郑
国锠, 2000)及植物细胞代谢副产品和废物囤积的场
所(汪良驹和刘友良, 1998)。詹宝等(2006)对原生质
体的研究发现, 蜈蚣草叶片体内的原生质体有明显的
耐砷性, 这可能是其自身缓解As毒害的机制之一, 同
时原生质体主要存在于细胞液中, 三七是否也存在类
似的原生质体还有待进一步研究。
分别对添加As浓度与细胞壁、细胞质及细胞液中
砷含量进行曲线拟合, 结果表明亚细胞水平的As含
量与实验设置营养液的As浓度呈显著二次相关(图
3)。其中主根的细胞液As含量与营养液As浓度的相关
性最好, 说明营养液中As浓度直接影响细胞液中As
含量。随着营养液中As浓度的增加, 根系中细胞壁、
细胞质和细胞液三组分中的As含量也不断增加, 但
当营养液达到一定As浓度时, 三七主根亚细胞组分
出现As含量下降的趋势, 在细胞液中这种趋势尤为
明显。其原因可能是三七体内相关酶因受As的毒害活
性降低, 植株生长受抑制或死亡, 对As的吸收量减少
所致。
2.3 各亚细胞组分中As分布的相对比例
图4显示三七根部不同亚细胞组分中As的相对分布比
例(某一组分的As浓度占三组分As浓度之和的比例)。
不同浓度As处理的各组分中As的相对比例表现为:
细胞液>细胞壁>细胞质。各处理根部的亚细胞组分都
以细胞液组分中As的相对比例最高, 且随着营养液

图3 不同As处理浓度与三七亚细胞组分间曲线相关性分析

Figure 3 Curve regression between different As concentra-
tion and subcellular fractions in Panax notoginseng


图4 不同As处理浓度的三七亚细胞组分间相对分布比例

Figure 4 Relative distribution ratio between different As
concentration and subcellular fractions in Panax notoginseng


As浓度的增加, 出现相对比例逐渐增加的趋势, 40
mg·L–1 As处理的细胞液组分中As所占比例却有所减
少。As元素细胞壁组分的相对比例随着营养液中As
浓度的升高呈现先增加后降低趋势, 在As浓度为10、
20和40 mg·L–1的实验处理中细胞壁组分中As相对含
量比例分别为21.68%、15.91%和22.43%。由此可见,
三七在含少量As的营养液中生长时, 吸收的As主要
富集在细胞壁上; 当三七生长在高浓度As营养液中
时, 吸收的As主要富集在细胞液中。随着营养液As
浓度的增加, 细胞液中As含量也逐渐增加, 20 mg·L–1
As处理时达到最高, 约占三组分总量的65.78%。各
596 植物学报 50(5) 2015
处理(对照除外)中细胞质As所占的分布比例均低于
细胞壁和细胞液; 加As与不加As处理, 细胞质中的
As含量均较低 , 且加As处理低于不加As处理 , 20
mg·L–1 As处理细胞质中As元素的相对分布比例最低,
仅为18.23%, 10与40 mg·L–1 As处理的相对分布比例
持平, 分别为22.79%和23.68%, 表明被吸收的As在
细胞质中不易积累。因此, 针对三七根部细胞液中As
的转运机制和赋存形态进行深入研究, 可以进一步揭
示As对药用植物三七的毒害机理。
3 结论
三七根部细胞组织中As元素多集中在表皮细胞组织,
随着营养液As浓度的升高, 维管束组织中As的检出
区域逐渐增加, 表明As有向维管束组织转运的趋势
且含量逐渐增加, 但高浓度As处理最高检出量却低
于20 mg·L–1 As处理。三七主根检测出在20 mg·L–1 As
处理时, As浓度达到最高值57.8 mg·kg–1, 呈现先增
加后降低趋势。
亚细胞组分重金属As的测定结果表明, 根部细
胞液是As的主要富集组分, 随着营养液As浓度的增
加, 主根亚细胞组分中As含量均逐渐增加, 其中细胞
液组分增幅最明显, 20 mg·L–1 As处理细胞液组分中
As含量约是对照的200倍, 而细胞壁和细胞质与细胞
液相比始终维持较低的As含量。
对营养液不同浓度As处理的细胞壁、细胞质和细
胞液中As含量进行曲线拟合分析, 结果表明亚细胞
组分的As含量与实验设置的As浓度呈显著的二次相
关。其中主根的细胞液As含量与营养液As浓度的相
关性最好, 说明营养液中As浓度可以直接影响细胞
液中的As含量。
不同浓度As处理的各组分中As的相对比例表现
为: 细胞液>细胞壁>细胞质, 以细胞液组分中As的
相对比例最高, 且随着营养液As浓度的增加而增加。
20 mg·L–1 As处理时As所占比例最高, 约为三组分总
量的65.78%; 细胞质和细胞壁所占的分布比例均较
低。
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Distribution Characteristics of Arsenic in Medicinal Plants Panax
notoginseng′s Taproots Tissue and Subcellular Components
Lu Chen1, Yanhua Mi1*, Xiaoming Wan2, Zhiwei Yuan3, Benlin Yin1, Lizhong He1
1Agri-Food Quality Standard and Testing Technology Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650221,
China; 2Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101,
China; 3The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China
Abstract We used synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF) and subcellular distribution research methods to
study the characteristics of arsenic (As) in roots of Panax notoginseng and subcellular distribution. Arsenic distributed on
the root epidermis of P. notoginseng and had a tendency to migrate to vascular bundle. Cytoplasmic supernatant repre-
sented the mainly concentration of subcellular components, and the cytoplasmic supernatant arsenic content of 20 mg·L–1
was 200 times of CK. We analyzed the quadratic regression equation of arsenic content in subcellular constituents of P.
notoginseng taproots and As concentrations in nutrient solution and found a direct relationship between As content in the
subcellular constituents and the environment. The proportion of each constituent was in the order of cytoplasmic super-
natant > cell wall > cytoplasmic organelles. The cytoplasmic supernatant content of 20 mg·L–1 As was the highest, ac-
counting for about 65.78%, and cytoplasmic organelles and the cell wall always maintained low levels of As.
Key words Panax notoginseng, arsenic, synchrotron radiation X-ray fluorescence (SRXRF), subcellular distribution
Chen L, Mi YH, Wan XM, Yuan ZW, Yin BL, He LZ (2015). Distribution characteristics of arsenic in medicinal plants
Panax notoginseng′s taproots tissue and subcellular components. Chin Bull Bot 50, 591–597.
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* Author for correspondence. E-mail: zhoumiqu@163.com
(责任编辑: 孙冬花)