全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (3): 209–216, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00209
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收稿日期: 2011-11-07; 接受日期: 2012-02-11
基金项目: 国家自然科学基金(No.31071240, No.31140071)、教育部科学技术研究重点项目(No.209075)和省部共建河南大学科研项目
(No.SBGJ090401)
* 通讯作者。E-mail: songcp@henu.edu.cn
ECS1参与调节CO2诱导的拟南芥气孔关闭和H2O2积累
安国勇, 丁秀艳, 武桂丽, 李海旺, 宋纯鹏*
河南大学生命科学学院, 河南省植物逆境生物学重点实验室, 棉花生物学国家重点实验室, 开封 475001
摘要 CO2浓度升高可以诱导植物叶片气孔关闭, 提高植物对高浓度CO2的适应性。但植物如何感知CO2浓度变化并启动气
孔关闭反应的分子机制至今仍不十分清楚。利用高通量、非侵入的远红外成像技术, 建立了拟南芥(Arabidopsis thaliana)
气孔对CO2浓度变化反应相关的突变体筛选技术, 筛选出对环境CO2浓度敏感的拟南芥突变体ecs1。遗传学分析表明, ecs1
为单基因隐性突变体, 突变基因ECS1编码一个跨膜钙离子转运蛋白。与野生型拟南芥相比, 360 μL·L–1CO2可引起ecs1突
变体叶片温度上升和气孔关闭, ecs1突变体对900 μL·L–1CO2长时间处理具有较强的适应性。进一步的实验表明, 360
μL·L–1CO2即可诱导ecs1突变体叶片积累较高浓度的H2O2, 而900 μL·L–1CO2才能够诱导野生型拟南芥叶片积累H2O2。因
此, ECS1可能参与调节高浓度CO2诱导的拟南芥气孔关闭和H2O2产生, H2O2可能作为第二信号分子介导CO2诱导拟南芥气
孔关闭的反应。
关键词 CO2, H2O2, 突变体, 信号转导, 气孔
安国勇, 丁秀艳, 武桂丽, 李海旺, 宋纯鹏 (2012). ECS1参与调节CO2诱导的拟南芥气孔关闭和H2O2积累. 植物学报 47,
209–216.
大气CO2浓度持续上升, 不仅对全球气候的变迁
产生重大影响, 而且对植物的形态、水分利用、蛋白
质合成、光合作用效率、抗逆反应和生物量积累等都
有不同程度的影响。因此, 揭示CO2浓度变化对植物
生长发育影响的分子机制, 具有重要的理论和现实意
义(殴志英和彭长连, 2003; Teng et al., 2006)。植物
气孔开度的变化可调节植物体内外的气体交换和水
分散失, CO2浓度升高可诱导植物气孔开度减小和气
孔密度降低, 从而减少CO2向植物体内扩散。因而,
气孔开度和气孔密度的改变是植物响应高浓度CO2
胁迫的主要调节方式。然而, 植物体如何感知CO2浓
度、并通过何种途径调节气孔开度和气孔密度变化这
一关键生物学过程至今还不十分清楚(Lake et al.,
2002; Vavasseur and Raghavendra, 2005)。
研究表明, 拟南芥成熟叶片可感知CO2浓度的变
化, 并由长距离信号分子的介导, 调节新生叶片的气
孔发育(Lake et al., 2001)。CO2作为光合作用的原料,
其信号转导过程中的长距离信号分子很可能是光合
作用的产物, 但叶片白化部位同样可感知CO2浓度的
变化并产生相应的生理反应(Beerling and Wood-
ward, 1995)。这说明存在不依赖于光合作用产物的
CO2信号转导途径。通过对fad-4、ein2、vtc-和aba-1
的分析表明, 可作为长距离信号分子的茉莉酸、乙烯、
ROS和ABA等都参与植物体内CO2信号转导过程; 但
在气孔发育方面, 这些信号分子的作用又与CO2存在
明显的差异 (Conklin et al., 1997; Johnson and
Ecker, 1998; Radunz et al., 2000; Woodward et al.,
2002)。拟南芥HIC基因突变虽然可以阻断CO2对气孔
密度的调控, 但并不影响高浓度CO2诱导的气孔关闭
反应。因此, CO2诱导气孔关闭和气孔密度降低是两
个相对独立的信号转导过程(Hetherington and Ra-
ven, 2005)。
实验表明, ABA和H2O2等逆境信号分子也参与高
浓度CO2诱导的气孔关闭反应(Lawson et al., 2003;
Vavasseur and Raghavendra, 2005)。ABA不敏感突
变体abi1和abi2及ABA合成缺失突变体aba2(gac2)
可以强烈抑制CO2诱导的气孔关闭反应。同时, gac2
相关的下游信号成分, 比如胞质游离的Ca2+浓度、质
·研究报告·
210 植物学报 47(3) 2012
膜K+和Cl–通道等也参与CO2调节的气孔关闭反应
(Webb and Hetherington, 1997; Leymarie et al.,
1998; Raschke et al., 2003; Young et al., 2006;
Israelsson et al., 2006)。拟南芥ABC转运蛋白
AtABCB14和SLAC1蛋白家族受CO2浓度变化的影
响, 调节植物细胞质膜离子通道活性和气孔的开度
(Lee et al., 2008; Negi et al., 2008)。碳酸氢盐作为
CO2在溶液中的存在形式 , 可以诱导气孔关闭和
H2O2产生, 该过程可被外源的过氧化氢酶和二碘基
苯抑制。因而, H2O2也是CO2或碳酸氢盐诱导气孔关
闭的重要信使分子(Kolla et al., 2007)。
另外, OST1基因突变虽然可以阻断ABA诱导的保
卫细胞内H2O2产生和气孔关闭反应, 却不影响CO2诱
导的气孔关闭反应(Mustilli et al., 2002)。而HT1基因
的突变体虽然可以阻断拟南芥对高浓度CO2的超敏感
反应, 但不影响蓝光、壳羧孢菌素和ABA诱导的气孔
关闭反应(Hashimoto et al., 2006)。因此, CO2与ABA、
H2O2等在诱导气孔关闭途径上存在明显的区别。
CO2调节的气孔关闭反应还受光照、湿度等多种
环境因子的影响(Assmann, 1988; Vavasseur et al.,
1990; Lüttge, 2007)。这表明CO2信号转导是一个非
常复杂的过程。虽然已经分析得到了一些重要的中间
成分, 但CO2受体及其下游信号分子之间的关系还不
清楚。因而, 应用分子遗传学的方法和手段, 确定
CO2信号的感受位点、分析其下游信号分子之间的相
互关系, 是认识CO2信号转导机制的关键所在(Heth-
erington and Raven, 2005; Israelsson et al., 2006)。
气孔开度和气孔密度的变化影响植物的蒸腾速
率, 也是植物体重要的叶片冷却调温机制。CO2浓度
升高引起的气孔关闭反应最终可表现为叶片温度的
改变, 远红外成像技术可以通过观测叶片温度的变
化, 高通量分析CO2浓度变化对植物气孔运动的影
响, 为鉴定CO2信号通路的关键成分提供了技术支撑
(Song et al., 2006)。
本研究利用远红外成像技术, 根据叶片温度的变
化, 筛选得到了可高效感知CO2浓度变化的拟南芥突
变体ecs1(efficient apperceive CO2 in stomata)。在
低浓度(100 μL·L–1)CO2条件下, ecs1和野生型的气孔
都保持开放状态; 当CO2浓度升高到360 μL·L–1时,
ecs1叶片温度迅速升高, 气孔关闭; 而野生型拟南芥
在CO2浓度升高到900 μL·L–1时, 叶片温度才明显升
高。另外, ECS1突变可以增强拟南芥对CO2的适应性,
调节植物体内H2O2积累。这也表明了H2O2可能参与
介导CO2诱导气孔关闭的反应 , 即ECS1通过调节
H2O2的积累, 介导CO2诱导气孔关闭的反应。
1 材料与方法
1.1 植物材料
实验所用的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)分
别为Columbia(Col)和Lansberg erecta (Ler)生态型。
拟南芥突变体库由EMS诱变Columbia(Col)产生, 诱
变采用Song等(2006)的方法。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥培养
取拟南芥种子经75%乙醇表面消毒30秒, 去除乙醇,
再加入0.1%升汞表面消毒5–8分钟, 无菌水冲洗6–8
次后, 点播于MS固体培养基(MS盐+3%蔗糖+0.6%
琼脂, pH5.8)上。4°C条件下春化3天后, 移入培养室
(光/暗周期为16/8小时, 温度18–22°C, 光照强度为
150 μmol·m–2·s–1, 相对湿度80%)中培养1–2周, 此
时的幼苗可用于后续不同的实验处理。将培养基上生
长12天的幼苗转移到蛭石:营养土=1:1(v/v)的土壤中
继续培养14天后, 可用于突变体的筛选。

1.2.2 CO2处理和突变体的筛选
将土壤中生长14天的野生型拟南芥幼苗转移到加装
CO2控制器的培养箱中, 用360 μL·L–1和900 μL·L–1
CO2分别处理, 在0、1、2和3小时观察气孔的开度变
化, 并利用远红外成像仪分析叶片温度的变化(Song
et al., 2006), 依此确立突变体的筛选条件。
根据以上实验确立的筛选条件, 利用远红外成像
仪监控CO2胁迫对拟南芥叶片温度的影响。选取叶片
温度明显不同于周围植株的拟南芥, 作为CO2信号相
关的突变体。
实验所用远红外热成像仪ThermaCAM SC3000
(美国)配备有320×240 PtSi探测器, 它能够探测短波
红外线(8–9 μm)。在室温条件下, 该成像仪的温度分
辨率可小于0.03°C。监控过程中, 热成像仪安装在距
叶片35–45 cm的高度, 并通过与热成像仪相连的监
视器观察叶片温度的变化。
安国勇等: ECS1参与调节CO2诱导的拟南芥气孔关闭和H2O2积累 211
1.2.3 突变体的遗传分析和图位克隆
以野生型Ler植株作为父本、突变体作为母本进行杂
交获得F1代种子。F1代自交产生F2代种子, 种植下去。
观察CO2对F2代幼苗叶片温度的影响, 统计F2代幼苗
中CO2反应特性不同的植株比例, 确定突变基因的遗
传特性 , 并进行突变基因的图位克隆 (赵孝亮等 ,
2011)。

1.2.4 气孔开度和叶片失水率的测定
取土壤中生长14天的拟南芥植株, 放置在不同浓度
CO2下。在不同处理时间点, 摘取完全展开的叶片,
迅速用蒸馏水洗涤, 用镊子撕取下表皮, 用毛刷刷去
叶肉细胞后, 置于Mes-KCl缓冲液(10 mmol·L–1Mes,
50 mmol·L–1KCl, 0.1 mmol·L–1CaCl2, pH6.24)中, 在
倒置显微镜(10×40)下观察气孔开度的大小。每个处理
至少观察3个表皮条, 每个表皮条随机选取4个视野,
每个视野随机测10个气孔开度, 每处理至少重复8次
(不少于400个气孔)。计算平均值和标准误, 并绘制
CO2浓度与气孔开度变化关系的折线图。取土培14天
的拟南芥叶片, 用蒸馏水冲洗干净并称重, 在不同浓
度CO2下处理2小时, 重新称重。处理前后的叶片重量
差值与处理前的叶片重量的比值即为叶片的失水率。

1.2.5 H2O2含量的测定
H2O2含量的测定方法参照Zhang等(2007)的方法。
2 结果与讨论
2.1 突变体筛选条件的确立和ecs1突变体的获得
研究表明, CO2浓度的倍增, 可诱导植物气孔关闭和
多种生理变化。表皮条分析实验表明, 在900 μL·L–1
CO2浓度条件下, 随着处理时间的延长, 野生型拟南
芥叶片的气孔开度逐渐减小; 处理1小时左右, 气孔
开度接近最小值。而在此后的1小时内, 气孔开度维
持在较小的状态, 且比较稳定。通过远红外热成像仪
监控叶片温度变化的实验表明, 900 μL·L–1CO2处理
超过1小时 , 拟南芥叶片的温度明显升高 ; 而360
μL·L–1CO2却不能够诱导拟南芥叶片气孔关闭及其温
度升高(图1)。因此, 我们利用远红外成像仪, 在360
μL·L–1和900 μL·L–1CO2浓度条件下, 分析拟南芥叶

图1 CO2浓度变化对拟南芥叶片温度和气孔开度的影响
(A) 在360 μL·L–1CO2条件下, 拟南芥植株的红外成像图; (B)
在900 μL·L–1CO2条件下, 拟南芥植株的红外成像图; (C) CO2
对拟南芥气孔开度的影响

Figure 1 The change of the leaf temperature and the
stomatal aperture of Arabidopsis thaliana under different
concentrations of CO2
(A) The infra-red images of Arabidopsis thaliana plants under
360 μL·L–1CO2; (B) The infra-red images of Arabidopsis
thaliana plants under 900 μL·L–1CO2; (C) The effect of CO2 on
stomatal aperture


片温度的差异, 筛选和分离气孔对CO2胁迫反应相关
的拟南芥突变体。
利用上述筛选方法, 从EMS诱变产生的拟南芥
突变库中, 筛选得到对CO2反应敏感的拟南芥突变体
ecs1。实验表明, 在正常大气CO2浓度(360 μL·L–1)
下 , ecs1突变体的叶片温度明显高于周围植株(图
2A), 而只有在CO2浓度达到900 μL·L–1时, ecs1突变
体周围植株的叶片温度才升高到与ecs1突变体相似
的程度(图2B)。从形态上, ecs1突变体的植株个体也
比较小(图2C)。通过对ecs1突变体后代植株的进一步
分析表明, ecs1突变体对CO2浓度敏感的特征可稳定
遗传给后代植株(图3)。
212 植物学报 47(3) 2012


图2 远红外成像技术筛选得到拟南芥突变体ecs1
(A) 360 μL·L–1CO2处理下ecs1的红外成像图(箭头所示); (B) 900 μL·L–1CO2处理下ecs1的红外成像图(箭头所示); (C) ecs1突变体
(箭头所示)

Figure 2 The screening of Arabidopsis thaliana ecs1 mutant by far infra-red technology
(A) The infra-red images of ecs1 under 360 μL·L–1CO2 (arrow indicate); (B) The infra-red images of ecs1 under 900 μL·L–1 CO2
(arrow indicate); (C) The ecs1 mutant (arrow indicate)




图3 拟南芥ecs1突变体植株的表型验证
(A) ecs1突变体和野生型(WT)拟南芥; (B) 360 μL·L–1CO2处理下ecs1和野生型(WT)拟南芥的红外成像图; (C) 900 μL·L–1CO2处理下
ecs1和野生型(WT)拟南芥的红外成像图

Figure 3 The identification of Arabidopsis thaliana ecs1 mutant
(A) The ecs1 mutant and wild type (WT); (B) The infra-red images of ecs1 and wild type (WT) under 360 μL·L–1CO2; (C) The
infra-red images of ecs1 and wild type (WT) under 900 μL·L–1CO2


2.2 不同浓度CO2对ecs1突变体气孔开度的影响
气孔开度变化可引起蒸腾作用强度和水分散失速率
的变化, 是引起叶片温度变化的直接原因。为了分析
不同CO2浓度条件下, ecs1突变体叶片温度的改变与
气孔开度的关系, 我们采用表皮条分析法。研究结果
表明, 随着CO2浓度的升高, 野生型和ecs1突变体的
气孔开度逐渐减小, 叶片温度升高(图4A, B)。但野生
安国勇等: ECS1参与调节CO2诱导的拟南芥气孔关闭和H2O2积累 213


图4 不同CO2浓度条件下突变体ecs1和野生型(WT)拟南芥的叶片温度、气孔开度和失水率变化
(A) 不同CO2浓度下突变体ecs1和野生型拟南芥的叶片温度变化; (B) 不同CO2浓度下突变体ecs1和野生型拟南芥的气孔开度变化;
(C) 360 μL·L–1CO2下突变体ecs1和野生型拟南芥的离体叶片失水情况; (D) 不同CO2浓度下突变体ecs1和野生型拟南芥离体叶片的
失水率变化

Figure 4 The change of temperature, stomatal aperture and water loss rate of the leaves of ecs1 and wild type (WT) Arabi-
dopsis thaliana under different CO2 concentrations
(A) The changes of leaf temperature of ecs1 and wild type under different CO2 concentrations; (B) The change of stomatal ap-
erture of ecs1 and wild type under different CO2 concentrations; (C) The water loss of detached leaves under 360 μL·L–1CO2; (D)
The effects of CO2 concentration on water loss rates of detached leaves of ecs1 and wild type


型和ecs1突变体之间又存在明显的差异。在低浓度
(100 μL·L–1) CO2条件下, 野生型和ecs1的气孔开度
基本一致, 均维持着较大的气孔开度状态; 当CO2浓
度升高到360 μL·L–1时, ecs1突变体的气孔开度明显
减小, 接近关闭状态, 而野生型拟南芥的气孔开度变
化不明显; 当CO2浓度进一步升高到900 μL·L–1时,
ecs1突变体与野生型拟南芥的气孔开度没有明显的
差异, 都接近于关闭状态(图4B)。气孔开度变化会影
响植物的蒸腾作用强度和叶片失水率。通过对离体叶
片的失水率分析发现 , 在360 μL·L–1CO2条件下 ,
ecs1突变体叶片的失水率明显小于野生型; 而在900
μL·L–1 CO2条件下, 野生型与ecs1突变体的失水率都
比较小, 差异也不明显(图4C, D)。这些结果表明, 较
低浓度的CO2可以诱导ecs1突变体的气孔关闭。因此,
ecs1是对CO2浓度敏感的气孔反应突变体。
2.3 ecs1突变体的遗传分析和ECS1基因的定位
为了确定ecs1突变体的遗传学特性, 以野生型Ler作
214 植物学报 47(3) 2012


图5 900 μL·L–1CO2处理10天的拟南芥ecs1突变体表型和叶
片H2O2的积累
(A) 900 μL·L–1CO2处理10天, ecs1突变体和野生型(WT)拟南芥
表型特征; (B) 900 μL·L–1CO2处理10天, ecs1突变体和野生型
(WT)拟南芥叶片中H2O2的含量

Figure 5 Phenotype and H2O2 content in leaves of ecs1 and
wild type (WT) Arabidopsis thaliana under 900 μL·L–1CO2 for
10 days
(A) Phenotype of ecs1 and wild type under 900 μL·L–1CO2 for
10 days; (B) H2O2 content in leaves of ecs1 and wild type
under 900 μL·L–1CO2 for 10 days


父本、ecs1突变体作母本, 杂交得到F1代。F1代植株
表现出野生型表型, F1代自交得到的F2代群体中出现
性状分离。在196株F2代植株中, 51株的表型与ecs1
突变体类似, 表现出气孔和叶片温度对CO2敏感的表
型特征, 其余植株的表型与野生型类似, 两者比例接
近3:1, 符合孟德尔遗传定律。表明ecs1是单基因隐性
突变的突变体。基因克隆分析表明, 该基因可能编码
一个钙离子跨膜转运蛋白。
2.4 ecs1突变体对高浓度CO2长时间处理的反应
特征和叶片H2O2含量的变化
为了分析ecs1突变体对CO2胁迫的适应性, 实验采用
900 μL·L–1CO2连续处理ecs1突变体和野生型拟南
芥。结果显示, 在处理10天左右, 野生型拟南芥出现
叶片黄化和枯萎 ; 而ecs1突变体生长基本正常(图
5A)。因此, 与野生型相比, ecs1突变体具有较强的高
浓度CO2胁迫适应性。图4的实验结果表明, ecs1突变
体是气孔对CO2浓度敏感的拟南芥突变体。说明拟南
芥的气孔运动和植株对高浓度CO2适应性之间存在
一定联系。也就是说, 气孔关闭反应可能是植物适应
高浓度CO2的一种重要调节机制。
已有的研究表明, H2O2和其它活性氧分子可能参
与调节CO2诱导的气孔关闭反应 (Lawson et al.,
2003; Vavasseur and Raghavendra, 2005)。为了分
析ecs1突变体在CO2胁迫下植株体内H2O2含量的变
化, 我们利用分光光度法测定拟南芥叶片中H2O2含
量。结果表明 (图5B), 在正常大气CO2浓度 (360
μL·L–1)下, ecs1突变体比野生型积累更多的H2O2; 当
CO2浓度升高到900 μL·L–1时, 野生型拟南芥叶片的
H2O2含量才明显上升, 且高于ecs1突变体。通过比较
分析发现, CO2诱导气孔关闭(图4B)与叶片H2O2的产
生(图5B)存在相似的变化趋势。因此, H2O2可能参与
介导CO2诱导气孔关闭的反应, ECS1可能通过调节
拟南芥叶片的H2O2含量来介导CO2诱导气孔的关闭
反应。
本研究利用远红外热成像技术, 建立了高通量、
非侵入的拟南芥气孔对CO2反应敏感或不敏感的突
变体筛选方法, 并筛选得到气孔对CO2敏感的拟南芥
突变体ecs1。研究结果表明, 较低的CO2浓度即可引
起ecs1气孔关闭和H2O2积累, 同时ecs1也表现出对
高浓度CO2具有较强的适应性。因此, H2O2可能是
CO2诱导气孔关闭的信使分子, ECS1通过调节H2O2
的积累介导CO2诱导气孔的关闭反应。对ECS1基因
功能的进一步分析将为认识气孔对CO2浓度变化的
感知及信号转导的分子机制提供证据和资料。
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216 植物学报 47(3) 2012
ECS1 Mediates CO2-induced Stomatal Closure and the Production
of H2O2 in Arabidopsis thaliana
Guoyong An, Xiuyan Ding, Guili Wu, Haiwang Li, Chunpeng Song*
State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology of Henan Province, School of Life Sciences,
Henan University, Kaifeng 475001, China
Abstract Elevating atmospheric CO2 concentration greatly affects global climate changes and the development and
production of crops. Stomatal closure can be induced by high concentration CO2 and improves the plant’s adaptation to
elevated levels of atmospheric CO2. However, the mechanism is still unclear. Using infrared thermography, we isolated an
Arabidopsis mutant ecs1. Genetic analysis revealed that the mutant is controlled by a single recessive nuclear gene.
Map-based cloning revealed that the mutant gene encodes an integral membrane protein that homologizes with calcium
transporter. Compared with wild-type Arabidopsis, ecs1 showed stomatal closure and increased leaf temperature under
360 μL·L–1CO2. ecs1 had enhanced adaptation to stress of 900 μL·L–1CO2 for a long time. In addition, ecs1 produced
more H2O2 under 360 μL·L–1CO2 than wild type. Under 900 μL·L–1CO2, both ecs1 and wild type produced more H2O2.
Therefore, H2O2 mediates CO2-induced stomatal closure and is involved in the ECS1 signal pathway in Arabidopsis.
Key words carbon dioxide, hydrogen peroxide, mutant, signal transduction, stomata
An GY, Ding XY, Wu GL, Li HW, Song CP (2012). ECS1 mediates CO2-induced stomatal closure and the production of
H2O2 in Arabidopsis thaliana. Chin Bull Bot 47, 209–216.
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* Author for correspondence. E-mail: songcp@henu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)