全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 79-85, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-05-16; 接受日期: 2008-05-19
基金项目: 973计划(No. 2006CB101605)
* 通讯作者。E-mail: qck@jaas.ac .cn; w cyang@genetics .ac.cn
.研究论文.
甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性
董劲松 1 , 石东乔 3 , 高建芹2, 李成磊 1 , 刘洁 3 , 戚存扣2*, 杨维才 3 *
1南京农业大学农学院, 南京 210095; 2江苏省农业科学院经济作物研究所, 南京 210014
3中国科学院遗传与发育生物学研究所, 中国科学院分子发育生物学重点实验室, 北京 100101
摘要 利用荧光染料尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微观察技术, 建立了油菜油体观察或生物体内中性脂类物质定性鉴定
的研究体系。对高油品种宁油14号、宁油18号、ZH-088和低油品种ZL-366、NjY008、Westar共6个甘蓝型油菜品种子叶
贮藏细胞内的油体进行了观察。研究发现: 油菜种子成熟过程中, 油体从着色不明显的小颗粒, 逐渐发育形成着色清晰的球状
大油体。种子成熟干燥后, 油体间很少发生聚合。在成熟干燥的种子中, 油体集中分布于子叶贮藏细胞中央, 呈椭圆形或不规
则形状, 较少为圆形。通过研究种子内油体与含油量的关系, 发现高油品种组与低油品种组之间在单个子叶贮藏细胞内油体
数量和截面积之和存在明显差异, 而在高油品种组内或低油品种组内的差异不明显。结果显示, 油菜种子细胞中油体的数量
和总面积与含油量之间存在正相关, 可作为高油分材料的选择依据。
关键词 甘蓝型油菜, 尼罗红, 油体, 含油量
董劲松 , 石东乔 , 高建芹 , 李成磊 , 刘洁 , 戚存扣 , 杨维才 (2009). 甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性. 植物学报 44,
79-85.
脂类物质是生物机体内重要的贮藏物质之一, 在植
物种子内, 一般是以三酰甘油酯(triacylglycerols, TAGs)
的形式贮存于称为油体(oil body)的细胞器中(程红焱和宋
松泉, 2006)。油体是由半单位膜包裹液态基质三酰甘
油酯形成的球体(Tzen and Huang, 1992), 也称为脂质
体(lipid body)或油质体(oleosome)。目前, 已在藻类、
有花植物的种子、花粉、花、根、茎和无花植物的
孢子和营养器官中发现油体颗粒。另外, 油体也存在于
某些动物、真菌和裸藻细胞中(Huang, 1996)。在种子
发育过程中, 油体主要积聚在子叶、胚乳或盾片等贮藏
组织中(Huang, 1996; Murphy and Vance, 1999)。油
体的化学成分和结构简单, 其位于外围的半单位膜由一
层磷脂分子(phospholipids, PLs)和油体蛋白镶嵌而成。
每个磷脂分子的疏水酰基伸展到油体内侧的液态基质,
与疏水的三酰甘油分子相互作用; 其亲水头部基团位于
油体外侧, 与胞液接触(Tzen and Huang, 1992)。镶嵌
于半单位膜上的油体蛋白主要为油质蛋白(oleos in), 其
覆盖了油体表面的大部分(Frandsen et al., 2001; Tai et
al., 2002), 还有少量钙结合油质蛋白(caleosin, Sop1)、
固醇油质蛋白(s teroleosin, Sop2)和Sop3(Chen et al.,
1998)。油质蛋白在维持油体的稳定性(Tz en e t al . ,
1992)、油体的合成与降解(Huang, 1992)等方面发挥
着重要的生物学作用。不同植物种子中的油体大小存
在差异, 并且受到营养和环境因素的影响(Tzen et al. ,
1993 )。油体在细胞中或者在离体状态下都十分稳定;
在干燥种子细胞内或在体外经离心分离的上浮液中, 油
体间不发生融合或聚合, 甚至经过长时间的贮存, 油体也
能够保持稳定(Frandsen et al., 2001)。
Huang(1992)报道, 当种子发育到成熟阶段, 油体通
过“出芽”方式从内质网上游离到细胞质中。负责合成
油体 TAG和 PL 的酶均定位在内质网上。内质网上合
成的 TAGs 不断地在磷脂双分子层内积累, 形成一个由
磷脂单分子层包裹的 “芽体”, 内质网上合成的 PL结合
到芽体颗粒表面。同时, 位于内质网上的多聚核糖体合
80 植物学报 44(1) 2009
成的油质蛋白也结合到芽体颗粒上,最终形成由一层PLs
和油质蛋白包裹的 TAG基质(即成熟油体), 随后油体从
内质网释放到胞液中。当种子萌发时, 细胞质中游离多
聚核糖体合成的脂酶特异地结合到油体表面 , 水解
TAGs成甘油和脂肪酸, 油体的磷脂层与液泡膜融合, 最
终形成大的中央液泡。
近 20 年来, 对于油体的研究趋向多样化。最近采
用油体构建的植物生物反应器— —油体表达系统, 在生
产外源蛋白方面得到了广泛的应用, 如药用蛋白、工业
用酶和动物饲料添加剂等( 勍曲 等, 2007)。在化石能源
日渐枯竭的形势下, 利用植物油作为生物柴油的主要原
料将是产生可再生能源的必要选择, 而油菜无疑是最为
理想的选择材料。但是, 目前缺乏快速便捷的用于油菜
种子中油体观察的技术方法, 限制了对油体发生、油体
与含油量的关系等关键性问题的探讨研究。迄今为止,
国内外对油菜油体的研究常采用透视电镜技术 , 如
Murphy 等(1989)、Tzen等(1993)、Cumm ins 等
(1993)、傅丽霞和瞿波(1993), 其不足之处在于实验过
程费时费力, 在一张切片上可观察的油体数目较少等。
Mantese 等(2006)对成熟期的玉米胚胎进行徒手切片或
油体提取分离处理、尼罗蓝染色和普通荧光显微镜观
察, 由于缺乏准确的测量方法, 所获得的数据准确性不
高。相比较而言, 尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微技
术相结合, 不仅检测速度快、灵敏度高和重复性好, 同
时还具有获得的实验数据准确性较高等优点。鉴于此,
本研究尝试利用尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微技术,
建立一个油菜种子油体观察体系, 并对 6个不同含油量
的甘蓝型油菜品种种子子叶贮藏细胞内油体进行了观察
比较, 通过对油体数量、截面积、分布和形态的研究,
探讨了油体与含油量之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所采用的6份油菜(Brass ica napus L.)种子材料
及其含油量数据均由江苏省农业科学院经济作物研究所
提供。甘蓝型半冬性油菜宁油 14号含油量44.82%, 宁
油 18号含油量 44.98%; 甘蓝型春性油菜 ZH-088含油
量 47.98%, ZL-366含油量 35.67%, Westar含油量
37.12%, NjY008含油量 34.43%。 ZH-088和 ZL-366
于2007年4月6日在西藏农牧科学院油菜试验田内种植,
同年 8月底收获; 其余 4个油菜材料于 2006年 9月 27
日在江苏省农业科学院油菜试验田种植, 2007年5月25
日左右收获。种子含油量测定采用近红外光谱分析法
(near infrared reflectance spectroscopy, NIRS)(甘莉
等, 2003)。
1.2 实验方法
1.2.1 尼罗红溶液配制和最适浓度的选择
配制尼罗红(Fluka, 72485)溶液时, 将 10 mg尼罗红粉
末溶于 10 mL丙酮中, 得到浓度为 1 mg.mL-1 的母液,
分装后在 4°C避光保存。为了确定染色的最适浓度, 用
双蒸水将尼罗红母液分别稀释到浓度为 100 mg.mL-1、
10 mg.mL-1、5 mg.mL-1、1 mg.mL-1、0.5 mg.mL-1、
0.1 mg.mL-1, 对成熟种子子叶贮藏细胞进行染色, 在激
光共聚焦显微镜下观察油体。
1.2.2 样品处理、染色与观察
在Olympus SZX12研究型体视显微镜下用解剖针剥出
油菜种子内的胚胎, 切取子叶, 放入稀释好的尼罗红溶液
中避光孵育 15分钟, 期间用枪头吹打几次, 以利于染料
与油体内脂类物质充分结合。随后用 0.1 mol.L-1 PBS
缓冲液冲洗 3次, 洗去未结合的染料。为了保证数据的
可比性, 应尽量取油菜种胚子叶中间部位进行观察统
计。先用刀片切掉子叶周边, 保留中部面积约为1 mm2
的部分, 切成碎块制片。在 ZEISS LSM 510 META激
光共聚焦显微镜下使用 40倍或 63倍物镜扫描观察, 扫
描参数为 HeNe1激光, 激发波长为 543 nm, 信号采集
设置为 BP 560-615 nm。
1.2.3 数据统计与处理分析
测定甘蓝型油菜品种宁油 14号、宁油 18号、ZH-088、
ZL-366、NjY008和Westar共 6个品种单个子叶贮藏
细胞内油体数量和截面积。每个品种均随机抽取 3个饱
81董劲松等:甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性
满、外观正常的种子进行染色, 取子叶中部面积约 1
mm2 制片观察。然后在激光共聚焦显微镜扫描的光切
片图片中, 筛选每个油体截面相对较大的图片来进行数
据统计处理。利用 LSM 5 Image Browser软件的面积
测量功能, 测量油体截面积。每个品种取 30 个子叶贮
藏细胞, 对油体数量和截面积之和进行测量, 重复 3次,
F 测验进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 油菜种子中油体观察
在染色过程中, 通过对荧光染料染色浓度和染色时间进
行摸索发现, 如果染色液浓度超过 5 mg.mL-1, PBS缓
冲液就不能将多余的染料冲洗干净, 扫描出来的图片荧
光背景色较重; 染色液浓度低于 0.5 mg.mL-1 时, 即使
将探针与油体孵育时间延长到 30-60分钟, 得到的图片
中油体的着色依然较浅,不利于观察。经过对不同浓度
尼罗红溶液的染色比较, 最终确定染色油菜成熟种子中
油体的最佳浓度为 1 mg.mL-1。
因为干燥种子有大量的干物质积累, 不利于染色制
片观察, 我们尝试用镊子夹碎种胚中子叶中部的组织, 使
其尽量分散, 取得了比较好的效果。另外, 在制片过程
中, 我们分别用水、甘油或 Im mers i on oi l (S igm a,
I1015)等进行封片。结果表明, Immers ion oi l效果较好,
能减少尼罗红荧光染料的淬灭并延迟子叶贮藏细胞的失
水收缩。
2.2 高、低油甘蓝型油菜种子子叶贮藏细胞内
油体的形态观察
从激光共聚焦显微镜扫描的图片(图 1 )中可以观察到
高、低油油菜种子的子叶贮藏细胞形状多为椭圆形, 少
数为多边形。细胞内的油体集中分布于细胞中央, 不与
细胞壁接触。大多数油体为椭圆形或不规则形状, 较少
为球形。高油品种单个子叶贮藏细胞内油体间排列紧
密, 几乎不存在空隙; 相对而言, 在低油品种中, 油体排
列疏松, 油体间空隙较大。类似的高、低油油菜品种
油体形态观察结果, 在傅丽霞和瞿波(1993)的报道中也
有描述。另外, 观察发现低油品种单个细胞内的油体数
量较少, 大小相对均匀, 单个油体的截面积比高油品种稍
大; 而在高油品种子叶贮藏细胞内, 油体数量明显多于
低油品种, 经常发现数个截面比较大的油体周围分布着
数量较多的小油体。
2.3 高、低油甘蓝型油菜子叶贮藏细胞内油体
的截面积统计分析
为了更准确地反映高、低油油菜品种油体大小的差异,
我们以单个子叶贮藏细胞为单位, 对不同光切面的各个
油体的最大截面积进行了统计分析。结果发现, 高油品
种宁油 14号、宁油 18号和 ZH-088的平均每个子叶贮
藏细胞内的所有油体截面积之和分别为 421 .6 ±17. 8
mm2、322.5±39.2 mm2和 349.4±38.9 mm2; 在低油品
种组内, NjY008、ZL-366和Westar的平均油体截面
积之和分别为 153.1±14.8 mm 2、183.7±8.5 mm2 和
107.9±20.1 mm2。高油品种组与低油品种组间油体截
面积之和差异明显, 而在高油组内或低油组内差异不明
显(图 2A)。分析结果显示, 高油品种组和低油品种组之
间单个子叶贮藏细胞内所有油体截面积和的差异达到极
显著水平(P<0.01), 相差幅度达 200 mm2。在高油品种
组内, 宁油 18号和ZH-088差异不显著, 宁油 14号分别
与宁油18号和ZH-088有一定差异, 但远小于组间差异;
在低油品种组内, Z L -36 6 与W es t a r 有一定差异,
NjY008分别与 ZL-366和Westar差异不明显。
2.4 高、低油甘蓝型油菜子叶贮藏细胞内油体
的数量统计分析
研究结果表明, 高油品种组内宁油 14号、宁油 18号和
ZH-088单个细胞内平均油体数量分别为 19.7、11.8和
14.0, 平均为 15.2。低油品种组NjY008、ZL-366和
Westar单个细胞内平均油体数量分别为 6. 6、5. 5和
4.4, 平均为 5.5(图 2B)。高油品种单个细胞内油体平均
数量约为低油品种的 3倍。对不同油菜品种单个细胞内
油体数量的分析结果表明: 高、低油品种组间差异非常
明显; 高油品种组内, 宁油 18号和 ZH-088差异不明显,
宁油14号分别与ZH-088和宁油18号有明显差异, 但幅
82 植物学报 44(1) 2009
度比组间要小得多 ; 低油品种组内, 3个品种间差异
不显著。
通过以上分析, 对6个不同含油量的油菜品种(系)种
子子叶贮藏细胞内油体观察结果表明, 与低油品种相比,
高油品种种子单个子叶贮藏细胞内油体数量较多, 截面
积之和较大。
图 1 甘蓝型油菜 6个品种成熟种子子叶贮藏细胞内油体的激光共聚焦显微镜观察
图片的获取过程: 尼罗红染色油菜成熟种子子叶, 徒手切片、制片, 激光扫描共聚焦显微镜观察。图片中红色结构为油体。
(A) 宁油 14号(含油量 44.82%)油体图片, 40X /0.75物镜下扫描; (B) 宁油 18号(含油量 44.98%)油体图片, 63 X /1.4油镜下扫描; (C)
ZH-088(含油量 47.98%)油体图片, 40X /0.75物镜下扫描; (D) NjY008(含油量 34.43%)油体图片, 63X/1.4油镜下扫描; (E) ZL-366(含
油量 35.67%)油体图片, 40X /0.75物镜下扫描; (F) Westar (含油量 37.12%)油体图片, 63X /1.4油镜下扫描。
Bar=5 mm
Figur e 1 Observation of oil bodies in the cotyledon storage cells of mature seeds from s ix cultivars of B. napus w ith confocal
laser scanning microscope
The cotyledons of B. napus mature seeds w ere stained w ith Nile red, sectioned freehand and scanned w ith confocal microscopy.
Oil bodies appear red in the above pictures.
(A) Ningyou 14 (oil content of 44.82%), Plan-Neof luar 40X /0.75 objec tive w as used; (B) Ningyou 18 (oil content of 44.98%), Plan-
Apochromat 63X /1.4 Oil DIC objec tive w as used; (C) ZH-088 (oil content of 47.98%) , Plan-Neof luar 40X /0.75 objec tive w as used;
(D) NjY008 (oil content of 34.43%), Plan-Apochromat 63X /1.4 Oil DIC objective w as used; (E) ZL-366 (oil content of 35.67%), Plan-
Neofluar 40X /0.75 objective w as used; (F) Westar (oil content of 37.12%), Plan-A pochromat 63X /1.4 Oil DIC objective w as used.
Bar=5 mm
83董劲松等:甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性
3 讨论
20世纪 70-80年代, 已有国内外学者陆续采用透视电
子显微镜、免疫组化等实验技术相结合的方法, 对油菜
种子子叶贮藏细胞内油体的大小、分布和形态特征等
方面进行了研究。但因整个实验过程周期较长、不易
操作、费时费力, 并且存在同一个组织中的多个细胞分
布在不同切片上而不利于整体观察分析, 其研究结果难
以进行比较。Mantese 等(2006)采用徒手切片、尼罗
蓝染色和荧光显微镜观察的方法研究了成熟期玉米胚胎
中的油体分布情况, 但此方法获得的数据准确性不高。
在本研究中, 我们以不同含油量的甘蓝型油菜品种成熟
种子为材料, 采用徒手切片、尼罗红染色和先进的激光
共聚焦显微镜观察方法, 可同时对子叶贮藏细胞内的油
体数目、大小和形态进行观察和统计。其优点在于检
测速度快、有效、重复性好; 另外, 通过使用 LS M
5 Image Browser软件中的面积测量工具测定油体截
面积, 方便、高效, 提高了统计结果的精确性。目前,
利用尼罗红染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察油菜
种子子叶贮藏细胞内油体的超微结构, 研究油菜品种含
油量与油体的大小、形态和分布情况的关系, 在国内
外未见报道。
植物种子中油体大小、油质蛋白与含油量的关系
一直受到人们的关注。Ting等(1996)研究发现, 高油玉
米品种具有较大的油体和较高的 TA G / 油质蛋白比。
Peng等(2003)对芝麻油体进行了人工合成, 合成的油体
大小与 TAG/油体蛋白成正比。Lu等(2006)利用过量表
达油质蛋白的方法, 改变了拟南芥种子内TAG中的脂肪
酸组分。Siloto等(2006)通过在拟南芥中调控油质蛋白
基因的表达水平, 直接证明了油质蛋白的积累情况决定
种子中油体的大小, 而且油体大小的变化会影响种子内
脂肪酸的累积。本研究结果表明, 甘蓝型油菜高油品种
与低油品种子叶贮藏细胞内的油体本身形态无太大差别,
但在细胞内分布和数量上差别明显。高油油菜品种的
油体间排列紧密, 空隙小; 低油品种油体间排列疏松, 空
隙大, 这与傅丽霞和瞿波(1993)的观察结果一致。通过
对高、低油品种间单个油体大小的比较发现, 低油材料
中油体大小分布相对均匀, 单个油体截面积大; 而高油
材料单位细胞内单个油体截面积相对较小, 与傅丽霞和
瞿波(1993)、Ting等(1996)观察结果不一致, 其原因可
能与物种或品种、取样观察部位或种子发育阶段不同
有关。另外, 观察结果显示, 高油品种组单个子叶贮藏
细胞内的油体个数较多, 单个细胞内油体截面积之和较
图 2 高、低油甘蓝型油菜种子单个子叶贮藏细胞内所有油体
截面积之和(A)及数量(B)的比较
高油品种(系) : 宁油 14号、宁油 18号和ZH-088;
低油品种(系) : ZL-366、NjY008和Westar
Figur e 2 Comparison of the sum of areas (A) and the
quantit ies (B) of all oil bodies in a coty ledon cell of high or low
oil-content seeds of Brass ica napus
High oil- content cultivars: Ningyou 14, Ningyou 18 and ZH-088;
Low oil-content cult ivars: ZL-366, NjY 008 and Westar
84 植物学报 44(1) 2009
大; 低油品种组油体数量相对较少, 截面积之和较小, 两
组间差别明显。
综上所述, 通过尼罗红染色、激光共聚焦显微镜观
察油菜种子子叶贮藏细胞内油体的数量与截面积之和及
其形态特征, 是一条判断油菜品种含油量高低的方便高
效的可行途径。利用油菜含油量与油体数量和总体积
存在着的对应关系, 在采用连续单株选择或杂交育种法
选育高油品种的初期, 不断地鉴定种子中的含油量, 选择
高含油量的种子进行繁殖, 可以尽可能地减小选育过程
中的盲目性, 节省了大量的人力、物力和财力, 可有效
缩短育种年限, 提高育种效率。可见, 该方法在油菜高
油育种中具有重要的应用价值。
致谢 感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所唐
祚舜老师在数据统计方面给予的帮助。
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85董劲松等:甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性
(责任编辑: 刘慧君)
Correlation Between the Quantity and the Sum of Areas of Oil Bodies
and Oil Content in Rapeseed (Brassica napus)
Jinsong Dong1, Dongqiao Shi3, Jianqin Gao2, Chenglei Li1, Jie Liu3, Cunkou Qi2*, Weicai Yang3*
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Sciences, Be ijin g 1 001 01, Chi na
Abstr act We repor t an eff icient method for observing oil bodies in rapeseed w ith the aid of Nile Red f luorescent dye and laser
scanning conf ocal mic roscopy. Oil bodies in the cotyledon s torage cells of mature seeds of s ix cultivars of Brassi ca napus L.,
Ningyou14, Ningyou18, ZH-088, ZL-366, NjY008 and Westar, w ere inves tigated. With seed maturation, staining show ed oil bodies
changing morphologically from s lightly s tained granules to subs tantially stained globoid bodies . In mature seeds, oil bodies w ere
distr ibuted at the central region of the cotyledon s torage cells and largely show ed an ellipt ical or ir regular shape. The cor relation
of oil bodies and oil content in seeds w as inves tigated. Seeds f rom the high oil- content group contained more oil bodies per cell and
had larger volume than the low oil-content group. These results provide evidence that the quantity and total volume of oil bodies
correlate w ell w ith the oil content of rapeseed.
Ke y w ords Brassi ca napu s, Nil e Re d, oil bo dy, oil co nte nt
Dong JS, Shi DQ, Ga o J Q, Li CL, Liu J, Qi CK, Yang WC (2009 ). Correlat ion betwee n th e q uant ity and the su m of areas of o il bodi es
an d o il content in ra pese ed (Brassi ca napu s). Ch in Bull Bo t 44 , 7 9-85 .
* Author for correspondence. E-mail: qck@jaas .ac .cn; w cyang@genetics.ac.cn