全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (2): 216–223, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00216
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收稿日期: 2010-08-30; 接受日期: 2010-12-22
基金项目: 广东省中国科学院全面战略合作项目(No.2009B091300161)和中国科学院植物研究所前沿研究项目(No.110700Q001)
* 通讯作者。E-mail: sqsong@ibcas.ac.cn
高粱遗传转化研究进展
刘宣雨1, 2, 王青云1, 刘树君1, 宋松泉1*
1中国科学院植物研究所能源植物研发中心, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 高粱(Sorghum bicolor)是一种重要的多用途作物, 其遗传转化研究对于高粱的分子育种和分子遗传学基础研究都具
有重要意义。该文对高粱遗传转化的方法、标记基因、遗传转化的启动子和受体系统进行了综述, 并提出了今后高粱遗传
转化应当集中研究的问题。
关键词 遗传转化, 标记基因, 启动子, 受体系统, 高粱
刘宣雨, 王青云, 刘树君, 宋松泉 (2011). 高粱遗传转化研究进展. 植物学报 46, 216–223.
在世界范围内, 高粱(Sorghum bicolor)是继小麦
(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea
mays)和大麦(Hordeum vulgare)之后位居第5位的重
要谷物(Saballos, 2008)。长期以来, 在亚洲、非洲和
美洲的高温少雨地区, 高粱作为一种多用途作物而被
广泛种植, 以提供粮食、饲料、燃料、酿酒原料以及
工业用淀粉(Liang and Gao, 2001)。随着生物质能源
需求的增加, 甜高粱作为粒用高粱的一个变种(杨明
等, 2009), 由于其生物学产量和茎秆含糖量较高, 同
时兼有耐旱、耐涝、耐贫瘠和耐盐碱等诸多优良特性,
被认为是最具开发潜力的能源植物之一(刘公社等,
2009)。由于有用种质资源的匮乏以及有性杂交不亲
和的原因, 采用传统育种方法对高粱进行遗传改良受
到了限制(Girijashankar and Swathisree, 2009); 而
基因工程通过转入新的基因为高粱的遗传改良提供
了一条新的途径(Jogeswar et al., 2007)。此外, 高粱
的遗传转化对于进行高粱基因功能分析、创建T-DNA
插入突变体库等基础研究也具有重要的意义。尽管高
粱被认为是组织培养和遗传转化最为困难的物种之
一(Gao et al., 2005a), 近年来国内外仍有一些成功
实现高粱遗传转化的报道。本文对近10年来关于高粱
遗传转化的研究进行了总结, 以期为高粱、尤其是甜
高粱的遗传转化提供参考。
1 高粱的遗传转化方法
目前已成功实现高粱遗传转化并获得转化植株的方
法有基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法。
1.1 基因枪法
基因枪法(biolistic method)又称微粒轰击法(micro-
projectile/partical bombardment), 是将外源DNA包
被在微小的金粉或钨粉表面, 然后在高压的作用下微
粒被高速射入受体细胞或组织, 微粒上的外源DNA
进入细胞后, 整合到植物染色体上从而实现基因转化
的一种方法(王关林和方宏筠, 2002)。基因枪法具有
无宿主限制的优点, 因而最初广泛应用于包括高粱在
内的对农杆菌不敏感的禾谷类作物转化中。Casas等
(1993)首次采用基因枪轰击高粱幼胚并成功获得了
具有除草剂抗性的高粱转化植株。随后也有一些采用
基因枪法转化高粱的研究报道(表1)。国内石太渊等
(2003)利用基因枪轰击由高粱幼穗诱导的愈伤组织,
将编码Bt杀虫蛋白的基因成功转入高粱。然而基因枪
法的缺点在于转化的基因往往多拷贝插入, 从而导致
基因沉默和低的转化频率。例如, 在应用基因枪法转
化高粱的报道中, Emani等(2002)获得的转化频率为
0.18%, Able等(2001)为1%, Zhu等(1998)为0.09%,

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刘宣雨等: 高粱遗传转化研究进展 217

218 植物学报 46(2) 2011
Casas等(1993, 1997)为0.33%和0.08%。影响基因枪
法转化频率的理化因素主要有微弹速度、靶距(阻挡
板与靶细胞间的距离)、轰击次数、微弹的理化性质、
DNA纯度和DNA沉淀剂等。微弹的理化性质主要包括
微弹的大小、团聚性及分散性, 这些性质与微弹的化
学成分有关(王雷, 2002)。Able等(2001)对影响高粱
基因枪转化的参数进行了优化, 认为DNA输送压力
为2 200 kPa, 靶距为15 cm, 氦气放气阀旋转1周为
最优参数组合。目前通常使用钨粉和金粉作为微弹,
但钨粉与DNA结合时间长会引起DNA降解, 而且钨
粉对靶细胞有毒性, 从而减少转化细胞的再生。金粉
作为微弹则无上述缺点, 而且其粉粒形状、均一性和
惰性等方面均优于钨粉。
1.2 农杆菌介导法
根癌农杆菌Ti质粒转化系统是利用农杆菌的天然侵
染过程, 实现外源基因转化的方法。与其它植物转化
方法相比, 农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated
transformation)具有费用低、能转移大片段DNA、外
源基因拷贝数低并能稳定遗传且转化频率相对较高
的优点(张素芝和荣廷昭, 2008)。但是, 由于单子叶植
物尤其是禾本科植物不是农杆菌的天然宿主, 最初农
杆菌介导转化单子叶植物的研究进展缓慢。随着人们
对农杆菌侵染机制的进一步了解和转化技术的不断
完善, 农杆菌介导的遗传转化首先在水稻(Chan et
al., 1993)和玉米(Ishida et al., 1996)中取得了突破性
进展。Zhao等(2000)采用农杆菌介导法将uidA基因和
bar基因成功导入高粱, 在6 175个幼胚中最终获得了
131个稳定转化事件, 平均转化频率达2.1%。近年来
农杆菌介导法成功转化高粱的报道不断增多, 目前已
成为高粱遗传转化的最主要方法(表1)。肖军等(2004)
和林凤等(2004)均采用农杆菌转化法, 成功地将杀虫
晶体蛋白基因cryIAb转入高粱中。同样, 张明洲等
(2009)也利用农杆菌侵染高粱幼穗诱导的愈伤组织,
将杀虫晶体蛋白基因cryIAb导入高粱 , 并获得了
1.9%的平均转化频率。
影响农杆菌介导法转化高粱的因素包括农杆菌菌株、
Vir区基因的活化、受体材料预处理和培养基成分等。

1.2.1 农杆菌菌株
遗传转化中常用的农杆菌菌株可分为3大类菌系, 即
胭脂碱型(Nop, 代表菌株为C58)、章鱼碱型(Oct, 代
表菌株为LBA4404)和农杆碱型又称琥珀碱型(Suc,
代表菌株为EHA101、EHA105)。不同的农杆菌菌株
具有不同的宿主范围。高粱遗传转化中常用的农杆菌
菌株为LBA4404和EHA105(表1)。

1.2.2 Vir区基因的活化
植物受到损伤后从伤口分泌的酚类物质能诱导农杆
菌Vir区基因的表达, 从而使T-DNA进行转移和整合。
单子叶植物由于不分泌酚类物质或酚类物质含量低
而不能诱导Vir区基因的活化 (Smith and Hood,
1995)。因此, 单子叶植物的转化中可以添加酚类物
质作为Vir区基因的诱导物。高粱转化中常用的诱导物
为乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)。Zhao等(2000)
在农杆菌介导的高粱遗传转化条件优化的研究中, 使
用100 μmol·L–1的AS作为诱导物。Jeoung等(2002)
通过比较4种不同浓度的AS(200–1 000 μmol·L–1)对9
种不同的农杆菌/高粱基因型转化组合的gfp瞬时表达
的影响, 表明对于不同的农杆菌/高粱基因型组合,
使gfp表达频率达到最高的相应AS的浓度不同。肖军
等(2004)和林凤等(2004)均报道100 μmol·L–1AS对促
进高粱愈伤组织的遗传转化有非常显著的效果。

1.2.3 受体材料预处理
Gurel等(2009)报道, 将高粱幼胚在农杆菌侵染前进
行热处理可以提高绿色荧光蛋白(green fluorescent
protein, GFP)的瞬时表达频率, 而4°C冷处理及离心
处理则不利于转化; 最佳处理组合为将幼胚在43°C
热处理3分钟, 然后在25°C冷却, 不经过离心处理即
可获得49.1%的愈伤组织GFP瞬时表达频率和8.3%
的稳定转化频率。

1.2.4 培养基成分
在农杆菌介导的遗传转化中, 共培养的培养基成分不
仅要有利于农杆菌的高效转染, 而且要有利于植物细
胞的旺盛生长和分裂状态的维持。目前, 大多数研究
中共培养的培养基成分与愈伤组织诱导或不定芽诱
导的培养基相同。Carvalho等(2004)报道, 共培养培
养基成分显著影响β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase,
GUS)的瞬时表达以及共培养后高粱幼胚的存活率。
此外, 在共培养培养基中添加椰子汁, 并且使用高生
刘宣雨等: 高粱遗传转化研究进展 219
活力的幼胚作侵染受体, 以及除去过量的农杆菌可以
显著提高共培养后外植体的成活率, 从而对成功转化
起重要的促进作用(Carvalho et al., 2004)。
1.3 花粉管通道法
花粉管通道法(pollen-mediated transformation)是指
在植物授粉后, 利用植物在开花、受精过程中形成的
花粉管通道, 将外源DNA导入受精卵细胞, 并进一步
被整合到受体细胞的基因组中, 随着受精卵的发育而
成为携带目标基因的新个体。采用的具体方法有微注
射法、柱头滴加法、花粉粒携带法和子房注入法等(魏
俊杰, 2010)。花粉管通道法利用植物的自然生殖过
程, 避免了繁琐的离体培养过程, 是一种简便、快捷、
经济的转化方法。然而, 该方法产生的后代容易发生
大量的性状分离, 而且外源基因的整合机理尚不清
楚。利用花粉管通道法对高粱进行转基因的研究相对
滞后。石太渊等(2001)利用花粉管通道法将广谱抗病
基因PHY157成功地转入高粱。Wang等(2007)将携带
有nptII和uidA基因的质粒与花粉一同浸没在蔗糖溶
液中, 经过超声波处理后, 将花粉涂抹于高粱雄性不
育系的柱头上, 最终经筛选得到了转基因植株。
2 高粱遗传转化的标记基因
转化体的筛选和早期检测是遗传转化过程中的一个
重要问题。标记基因可分为选择标记基因(selectable
marker gene)和筛选标记基因 (screening marker
gene), 后者又称为报告基因(reporter gene)。
2.1 选择标记基因
选择标记基因的功能是使转化体在选择压力下(向选
择培养基中添加选择剂)被选择出来。在高粱成功转
化的报道中, 使用最广泛的选择标记基因为bar基因
(表1)。bar基因编码草丁膦乙酰转移酶(phosphinoth-
ricin acetyltransferase, PAT)而使转化体对除草剂草
丁膦 (phosphinothricin, PPT)及其类似物 basta或
bialophos产生抗性。但是, 使用bar基因容易导致许
多逃逸株的产生。此外, 人们担心bar基因可能会通过
花粉转移到高粱的野生近缘植物中, 从而产生抗除草
剂的烈性杂草(Gao et al., 2005b)。一些抗生素抗性
基因, 如新霉素磷酸转移酶基因(nptII)、潮霉素磷酸
转移酶基因(hpt)等也经常被用于高粱的转化。使用抗
生素抗性选择标记基因的主要问题是人们担心这些
基因可能会转移到致病菌中, 从而导致医疗上抗生素
使用无效(Balter, 1997)。目前由于转基因的生物安全
性问题已成为社会关注的焦点, 生物安全性标记基因
(biosafety marker gene)的研究将会显得非常重要
(李俊等, 2009)。
传统的通过抗生素或者除草剂杀死未转化细胞
的选择属于负向选择(negative selection), 而正向选
择(positive selection)是通过使转化细胞获得代谢某
种特殊底物(未转化前不能利用或者不能高效利用)的
能力, 因而最终能够从未转化组织中“脱颖而出”。
正向选择可以不考虑抗生素和除草剂带来的隐患, 还
可避免负向选择过程中对转化细胞生长不利的酚类
化合物的产生, 因而有助于转化效率的提高(Wenck
and Hansen, 2005)。甘露糖选择体系 (mannose
selection system)作为一种正向选择体系近年来被广
泛用于高粱转化。manA基因编码的磷酸甘露糖异构
酶(phosphomannose isomerase, PMI)能够使转化细
胞具有将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸的能力,
并以此作为碳源(Joersbo et al., 1998)。此外, 对PMI
潜在致敏性的评价表明, PMI缺少许多食源性致敏原
的特征(Privalle, 2002)。Gao等(2005b)将甘露糖选择
体系成功用于高粱转化, 并最终获得了高的转化频
率, 平均为2.91%; 同时证明在避免使用抗生素或除
草剂的情况下, 该体系可作为进行高粱转化的一种有
效筛选方法。Gurel等(2009)也采用甘露糖选择体系,
用农杆菌侵染高粱幼胚最终获得了高达8.3%的转化
频率。
2.2 报告基因
利用报告基因可以方便地通过瞬时及稳定表达检测
来确定转化的基因能否得到表达(王关林和方宏筠,
2002)。敏感、易检测的报告基因可被用来对影响高
粱转化体系的参数进行优化。高粱转化研究中应用最
广泛的报告基因为编码GUS的uidA基因(表1)。uidA
基因的表达可通过用β-葡萄糖苷酶的底物X-gluc处理
来检测, 但检测过程具有损伤性。近年来高粱转化研
究中经常使用编码GFP的gfp基因(表1)。GFP无需添
加任何底物、酶和辅助因子等物质, 只需暴露于395
nm的远紫外光或490 nm的蓝光下便可受激而发出绿
220 植物学报 46(2) 2011
色荧光(508 nm)。此外, 对GFP的观察检测可以随时、
重复进行, 而且可以在不损伤或破坏细胞的情况下进
行。作为一种可视的筛选标记 (visual screening
marker), gfp基因已成功应用于高粱的遗传转化研究
中。Jeoung等(2002)通过比较uidA和gfp在基因枪和
农杆菌法中对转基因表达的早期检测效果, 证实对于
这两种不同的转化方法, gfp在转基因瞬时表达分析
上均比uidA敏感。Gao等(2005a)利用gfp进行可视筛
选, 通过农杆菌介导法成功地将抗病基因tlp导入高
粱, 获得了高达2.5%的平均转化率; 同时证明检测
高粱转化, 选择药剂和底物的使用是没有必要的, 因
为gfp提供了一种有效、可靠且非破坏性的标记来识
别转化愈伤、幼苗和植株。Gao等(2005b)在农杆菌
介导高粱转化中使用由pmi基因和gfp基因组成的双
标记进行了成功筛选。Gurel等(2009)在研究各种预
处理对高粱幼胚转化影响的实验中, 通过计算含有表
达GFP的细胞的幼胚比例来定量评价不同处理对农
杆菌侵染后gfp瞬时表达的影响。但是, 使用gfp作为
报告基因也有缺陷, 即需要使用荧光体式显微镜, 而
且高浓度的GFP通过干扰器官发生可能会导致转基
因植株不育(Jeoung et al., 2002)。
3 高粱遗传转化的启动子
合适的启动子有助于提高转基因的转化频率和表达
水平(Hill-Ambroz and Weeks, 2001)。目前, 用于高
粱遗传转化的启动子可分为组成型启动子(constitu-
tive promoter)和诱导型启动子(inducible promoter)
(表1)。
3.1 组成型启动子
用于高粱遗传转化研究的组成型启动子主要有花椰
菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、水稻肌动蛋白基因启
动子actin1、玉米乙醇脱氢酶基因启动子adh1和玉米
泛素蛋白基因启动子ubi1。有研究将不同启动子与
uidA或gfp连接, 通过比较报告基因的瞬时表达来选
择最适合高粱的启动子。在Able等(2001)采用基因枪
法进行高粱遗传转化的研究中, ubi1启动子驱动的
uidA基因的瞬时表达水平显著高于actin1和35S启动
子。Jeoung等(2002)通过比较基因枪轰击高粱幼胚诱
导的愈伤组织后uidA或gfp的瞬时表达情况, 发现对
于 uidA各启动子的强度顺序为 ubi1>CaMV35S>
HBT; 对于gfp各启动子的强度顺序为ubi1>CaMV
35S>actin1>adh1。Tadesse等(2003)在采用基因枪
对高粱幼胚和芽尖2种受体材料进行轰击的实验中,
通过比较uidA基因的瞬时表达结果, 发现在高粱中4
种 启 动 子 的 强 度 顺 序 为 ubi1>actin1>actin1D>
CaMV35S。
3.2 诱导型启动子
利用伤害诱导型启动子(wound-inducible promoter)
驱动编码杀虫蛋白的转基因表达, 不仅能够节省植物
的能量消耗而且能够延缓害虫抗性的出现 (De
Maagd et al., 1999)。Girijashankar等(2005)采用基
因枪法将伤害诱导型启动子mpiC1(玉米蛋白酶抑制
因子基因启动子)驱动的编码杀虫蛋白的基因cry1Ac
转入高粱, T1代转基因高粱植株的受损新鲜叶组织中
Cry1Ac蛋白的积累量可达1–8 ng·g–1叶组织。
4 高粱遗传转化受体系统
4.1 愈伤组织再生系统
目前高粱转化中所用受体材料多集中于幼胚或幼穗
诱导的愈伤组织(表1)。但是无论何种来源的外植体,
试图先通过诱导愈伤组织而建立起来的高粱离体培
养再生体系已被证明具有很强的基因型依赖性
(Zhong et al., 1998)。粒用高粱遗传转化的成功实例
主要限于几个品系如P898012、Tx430和C401等, 而
一些具有优良农艺性状的品系却由于再生能力低而
无法进行遗传转化研究。赵利铭等(2008)利用甜高粱
品种考利和M81-E的成熟种子和成熟胚作为外植体,
通过愈伤组织再生途径成功地获得了甜高粱的再生
植株。刘宣雨等(2010b)利用甜高粱品种凯勒的幼穗
进行愈伤组织诱导及再生培养, 获得了稳定、高频、
高效的再生体系。
4.2 直接分化再生系统
直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生
愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株的
受体系统。以从高粱幼苗分离得到的芽顶端分生组织
(shoot apical meristem)为外植体直接诱导丛生芽的
离体培养被认为具有基因型依赖性弱、高效再生以及
刘宣雨等: 高粱遗传转化研究进展 221
遗传稳定性好的优点, 因而受到重视而被应用于禾谷
类作物的遗传转化中(Sticklen and Oraby, 2005)。
Zhong等(1998)以高粱芽顶端分生组织为外植体直接
诱导丛生芽, 获得了每个外植体可诱导出超过200个
芽的高再生效率, 同时实验中所用的18个粒用高粱
品系也表现出类似的结果。Sai Kishore等(2006)以芽
顶端分生组织为外植体直接诱导丛生芽, 3个粒用高
粱品系均表现出高的诱导频率。Girijashankar等
(2005)利用基因枪直接轰击从无菌实生苗上分离的
含芽顶端分生组织的外植体, 通过直接诱导丛生芽的
离体培养途径将抗虫基因cry1Ac成功转入粒用高粱。
Pandey等(2010)用农杆菌侵染高粱芽顶端分生组织
获得了GUS的瞬时表达。刘宣雨等(2010a)以芽顶端
分生组织为外植体建立了甜高粱的高频、高效离体培
养再生体系, 该体系具有外植体来源不受限制、基因
型依赖性弱和遗传稳定性好的优点。
4.3 种质系统
种质系统是利用植物自身的生殖过程, 以生殖细胞如
花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统, 也
称生殖细胞受体系统。目前应用种质系统进行高粱遗
传转化的研究主要采用花粉管通道法 (石太渊等 ,
2001; Wang et al., 2007)。该系统的不足之处是转化
受到季节的限制, 只能在短暂的开花期内进行。
5 结语
高粱作为一种重要的多用途作物, 其遗传转化研究却
远远落后于其它禾谷类作物。高粱遗传转化面临的困
难主要有: (1) 组织培养困难, 如培养过程中酚类物
质积累, 再生效率低和基因型依赖性强; (2) 缺少高
效的转化方法; (3) 基因沉默和嵌合体现象。因此, 今
后高粱的遗传转化研究可集中在以下几个方面。(1)
进一步优化转化方法, 以提高转化频率。农杆菌介导
法容易获得高的转化频率, 可以作为首选的转化方
法。此外, 使用gfp作为报告基因, 采用甘露糖正向选
择体系也可提高高粱的转化频率。通过构建合适的表
达载体, 在目的基因的一侧或两侧连接基质附着区
(matrix attachment regions, MARs)以增强转基因的
表达, 减少由位置效应引起的转基因沉默(黄慧珍等,
2004)。(2) 应加强重要农艺性状相关的基因如改善籽
粒品质、抗生物或非生物胁迫基因的转化研究。已有
的高粱转化研究大多是关于筛选标记基因和报告基
因的转化, 具有优良农艺性状的基因转化较少(表1)。
(3) 通过共转化(co-transformation)法进行多基因转
化, 将控制抗病、抗虫及抗逆性状的多种基因转入高
粱获得多功能的转基因植株, 或者利用多基因控制的
代谢途径来实现高粱性状的遗传改良, 或者是将标记
基因与目的基因共转化同一植株, 在后代中获得剔除
标记基因的转基因植株, 解决转基因植物的安全性问
题(燕丽等, 2008)。
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Advances in the Genetic Transformation of Sorghum bicolor
Xuanyu Liu1, 2, Qingyun Wang1, Shujun Liu1, Songquan Song1*
1The Research and Development Center for Energy Plants, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing
100093, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract Sorghum (Sorghum bicolor) is an important crop with multiple purposes. Research into the genetic transfor-
mation of sorghum benefits molecular breeding and molecular genetics studies. This paper reviews advances in the
methods, marker genes, promoters and receptor systems of the genetic transformation of sorghum. We also give some
suggestions for research into the genetic transformation of sorghum.
Key words genetic transformation, marker gene, promoter, receptor system, sorghum
Liu XY, Wang QY, Liu SJ, Song SQ (2011). Advances in the genetic transformation of Sorghum bicolor. Chin Bull Bot
46, 216–223.
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* Author for correspondence. E-mail: sqsong@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 刘慧君)