全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (1): 1–11, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00001
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收稿日期: 2013-10-30; 接受日期: 2014-02-23
基金项目: 国家自然科学基金(No.31171472)、高等学校博士学科点专项科研基金(No.20111302130001)、河北省应用基础研究计划重点
基础研究(No.08965505D)和河北省自然科学基金(No.C2007000515, No.C2010000787)
* 通讯作者。E-mail: gangliu2004@126.com; dongmeiwang63@126.com
小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中Ca2+和
NO的动态变化及其相互作用
乔妹, 孙嘉炜, 陈琰, 韩胜芳, 侯春燕, 刘刚*, 王冬梅*
河北农业大学生命科学学院, 保定 071001
摘要 以感染叶锈菌的小麦(Triticum aestivum)叶片细胞间隙液IWF-260作为激发子, 刺激小麦品种洛夫林10和郑州5389
的悬浮细胞, 探讨由激发子引发悬浮细胞过敏性反应中Ca2+和NO的变化及相互作用。以荧光分子探针Fluo-3AM和DAF-FM
DA分别对细胞内Ca2+和NO进行标记, 利用激光共聚焦扫描显微镜对其动态变化进行实时监测, 通过药物学实验对Ca2+和
NO的产生机制及其可能存在的相互关系进行探讨。结果表明, 2个小麦品种悬浮细胞的[Ca2+]cyt水平对激发子刺激的反应表
现出明显的差异, 对叶锈菌小种表现不亲和的洛夫林10悬浮细胞分别在激发子刺激后330秒和700秒出现2个钙峰; 而对该
小种表现亲和的郑州5389悬浮细胞在激发子刺激后[Ca2+]cyt水平稍有波动但变化不明显。药物学实验证明, [Ca2+]cyt的升高
依赖于胞外钙离子内流, 钙离子与激发子刺激诱发的过敏性防卫反应紧密相关。同样, 在激发子刺激后, 洛夫林10悬浮细
胞出现1个NO峰, 而郑州5389悬浮细胞胞质NO变化不明显。药物学实验初步证明, NO的产生与胞外钙离子内流密切相关。
由此推测, 在小麦悬浮细胞应答激发子刺激诱发的过敏性反应中, NO可能在钙的下游发挥作用。
关键词 Ca2+, 激发子, NO, 悬浮细胞, 小麦
乔妹, 孙嘉炜, 陈琰, 韩胜芳, 侯春燕, 刘刚, 王冬梅 (2015). 小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中Ca2+和NO的
动态变化及其相互作用. 植物学报 50, 1–11.
小麦(Triticum aestivum)是世界上重要的粮食作
物。小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病
是世界上最为严重的病害之一, 也是我国麦区的主要
病害。由于小麦叶锈菌具有高度的寄主专化性, 研究
和利用寄主抗病性就成为控制该病害的最基本且最
有效的措施之一。本课题组多年来一直从事小麦抗叶
锈病分子机制的研究工作, 从组织学、细胞学及分子
生物学等方面对小麦抗叶锈病机制进行了较为系统
的探索, 并形成了具有特色的研究体系。已经证明
Ca2+-CaM信号途径参与小麦抗叶锈菌侵染的信号转
导过程 (关春蕾等 , 2006; 刘刚等 , 2007; 张蓓等 ,
2010; Liu et al., 2010), 并证明H2O2(任丽梅等 ,
2010)、NO(陈阳辉等, 2011)和细胞骨架(陈晓波等,
2001, 2002)等组分也参与该过程且具有相互作用。
这些结果主要来自对2个互作体系的研究: 一个是小
麦叶片接种叶锈菌生理小种的互作体系; 另一个是小
麦悬浮细胞系与激发子形成的互作系统。悬浮细胞系
的利用体现了诸多优点, 比如携带方便、细胞状态均
一、短时间内可以大量获得以及能够提供单个完整细
胞的图像等。因此我们在探讨小麦抗叶锈病防卫反应
的信号转导机制方面(如对钙信号系统、活性氧信号
分子及NO等)的研究中均采用悬浮细胞系与激发子
的互作体系。
在植物中 , Ca2+(张国增等 , 2009; 陈阳辉等 ,
2011)和NO(刘国华等, 2009)均可作为信号分子在防
卫反应中起重要作用, 但二者的相互关系在不同体系
中结论不一(Ma and Berkowitz, 2007; Courtois et
al., 2008)。最新研究证据表明, 在植物与病原菌互作
过程中, 胞内短暂的[Ca2+]cyt升高与环核苷酸控制的
离子通道(CNGCs)有关(Ma and Berkowitz, 2011;
Cheval et al., 2013), 且[Ca2+]cyt上升与下游的NO变
化有密切联系(Ali et al., 2011)。也有报道指出, 在转
·研究报告·
2 植物学报 50(1) 2015
水母发光蛋白的烟草(Nicotiana plumbaginifolia)和拟
南芥(Arabidopsis thaliana)中若提供外源NO会诱发
[Ca2+]cyt瞬间升高(Lamotte et al., 2004, 2006; Bes-
son-Bard et al., 2008; Aboul-Soud et al., 2009)。在
拟南芥和蚕豆(Vicia faba)的保卫细胞中装载钙离子
荧光指示剂FLUO-2后也得到了相似的结果(Garcia-
Mata et al., 2003)。本实验室前期工作以激发子-原生
质体的实验系统来模拟叶锈菌侵染小麦叶片的互作
体系, 发现激发子刺激后胞质[Ca2+]cyt增加且与微管
骨架的解聚有关(刘刚和王冬梅, 2006), 并初步证明
胞外钙是[Ca2+]cyt增加的主要来源。陈阳辉等(2011)
利用激发子-悬浮细胞的实验系统并借助普通荧光显微
镜得到胞质NO应答激发子刺激的荧光强度变化特征,
且初步证明Ca2+和NO之间可发生相互作用。在此基础
上, 为了揭示小麦胞内Ca2+和NO在同一互作系统中的
变化规律及其相互作用机制, 本研究以激发子-悬浮细
胞为研究体系, 利用激光共聚焦扫描显微镜对激发子
刺激后胞内Ca2+和NO的变化进行timecourse作图, 探
讨不同抗叶锈病小麦品种洛夫林10和郑州5389在应答
激发子刺激诱发的过敏性反应中Ca2+和NO的变化特
征及其相互关系, 为深入阐明小麦应答激发子或叶锈
菌刺激的信号转导途径奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本实验选取2个小麦(Triticum aestivum L.)品种: 洛
夫林10(Lovrin 10, L10)和郑州5389。叶锈菌生理小
种为260(单孢菌系 )。L10与260组成不亲和组合 ;
5389与260组成亲和组合, 并制备小麦L10、5389的
悬浮细胞系。
1.2 细胞间隙液 (intercellular washing fluid,
IWF)的制备
采用扫描的方法将5389上的260夏孢子接种于7日龄
L10叶片上, 并于接种后第3天(即接种后72小时)取下
接种叶片切成4 cm叶段, 用4°C重蒸水浸没, 真空渗
入, 待叶片呈水浸状, 取出并晾干至表面无附水, 然
后以800 ×g离心12分钟, 收集离心甩出的液体并再
次以800 ×g离心除去细胞碎片 , 所得液体记作
IWF260。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。以
同样的方法提取未接种的小麦叶片IWF作为对照, 记
作IWFck。详细步骤参见王庆梅等(2000)的方法。
1.3 悬浮细胞系的建立
L10和5389悬浮细胞系的建立分别参见陈琰等(2005)
和乔妹等(2010)的实验方法。将生长旺盛的黄色、松
脆、颗粒状的愈伤组织1–2 g转入盛有40 mL液体培养
基的三角瓶中悬浮培养。开始每隔5天继代1次, 1个月
后得到稳定的悬浮系, 以后每隔7天继代1次。
1.4 药物配制及使用浓度
实验中选用Ca2+载体A23187的终浓度为10 μmol·L–1;
Ca2+漂白剂Mn2+的终浓度为10 mmol·L–1; SNP终浓
度为2.5 mmol·L–1; NO清除剂c-PTIO的终浓度为100
μmol·L– 1; 胞外钙离子螯合剂EGTA的浓度为10
mmol·L–1; 质膜钙通道抑制剂LaCl3浓度为25 μmol·
L–1。需要说明的是, 在预备实验中对上述药物均进行
了浓度梯度实验, 观察不同浓度的药物对小麦悬浮细
胞正常生长的影响, 以使用药物浓度处理后72小时
细胞的死亡率在5%以下来确定上述药物的实验浓
度。以上药物均在IWF260处理前0.5小时施加。
1.5 钙离子荧光指示剂 Fluo-3AM 的装载及
[Ca2+]cyt动态变化的观察
参考刘刚等(2004)的方法, 取适量L10和5389悬浮细
胞置于Pipes缓冲液中。Pipes缓冲液的组成为: 12.5
mmol·L–1Pipes, 1 mmol·L–1CaCl2, 1 mmol·L–1MgCl2,
1%甘露醇, pH6.9 。
取保存于Pipes缓冲液中的悬浮细胞500 μL, 加
入Fluo-3AM(molecular probes)母液 (5 mmol·L–1)2
μL至终浓度为20 μmol·L–1, 混匀后于25°C避光孵育,
在装载后不同时间以150 ×g离心3分钟, 弃上清, 用
Pipes缓冲液洗涤3次, 经检测合格后备用。
将装载了Fluo-3AM的悬浮细胞滴于激光共聚焦
专用培养皿上, 将培养皿放在激光共聚焦扫描显微镜
(OLYMPUS FV1000型, 配备50 mV氩激光器)的载
物台上, 在不同药物处理后要保持液面水平。以氩激
光为激发光源, 激发光波长为488 nm。选取装载完好
的悬浮细胞进行断层扫描。通过计算机控制扫描和数
据采集系统(timecourse), 将采集图像和数据记录于
计算机中。
乔妹等: 小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中 Ca2+和 NO 的动态变化及其相互作用 3
1.6 NO荧光指示剂DAF-FM DA的装载及胞质
NO动态变化的观察
装载探针DAF-FM DA(molecular probes, 母液浓度
为5 mmol·L–1)的终浓度为1 μmol·L–1。其它操作同1.5
节所述。
1.7 测定小麦悬浮细胞的死亡率
参考齐放军等(2006)报道的溴酚蓝染色方法测定细
胞死亡率。以相同时间点不经任何处理的正常细胞为
负对照, 以经过无水甲醇处理10分钟完全致死的悬
浮细胞为正对照。每种处理均设置3次独立实验, 每
次实验所有处理都设3个重复。
细胞死亡率(%)=100×(处理细胞OD595–负对照
OD595)/(正对照OD595–负对照OD595)。
1.8 图像和数据处理
储存于计算机中的图像文件, 用Confocal Assistant
4.0软件对数字化图像按时间点选取并进行加工处理,
而后用Adobe Photoshop 7.0软件对图片进行编辑排
版。用与激光共聚焦扫描显微镜配套的 Laser
Pix(Version 4.0)分析软件对所获得的timecourse扫
描图进行分析。具体方法为: 圈定一个悬浮细胞胞质
的某一特定区域, 经软件处理后得到这个悬浮细胞在
特定层面上的Ca2+或NO荧光强度相对值的变化数据,
然后用Excel软件导出此悬浮细胞特定区域相对荧光
强度的比率变化(未处理前的相对荧光强度比率记作
1 000), 即可表示胞质Ca2+浓度[Ca2+]cyt和NO的变化
(Garcia-Mata et al., 2003)。每个实验至少进行3次生
物学重复。
2 结果与讨论
2.1 IWF诱导小麦悬浮细胞死亡
采用蛋白终浓度为150 μg·mL–1的IWFck和IWF260分
别处理小麦悬浮细胞, 在处理后不同时间检测细胞死
亡率。结果(图1A)显示, 无论IWFck还是IWF260处理均
能引起细胞死亡, 并随着时间的延长而加剧。比较
IWF260和IWFck处理后不同时间的细胞死亡率, 发现
IWF260诱发的细胞死亡率均比IWFck高, 在处理后72
小时IWF260可导致约20%的细胞死亡; 而IWFck仅能
引起8%左右的细胞死亡。这一结果与本实验室任丽
梅等(2010)和陈阳辉等(2011)的报道一致。本实验室
前期工作已经证明激发子刺激诱发的细胞死亡具有
植物细胞程序性死亡的特征(马云鹏等, 2005)。
2.2 IWF刺激后悬浮细胞[Ca2+]cyt的变化
2.2.1 Fluo-3AM装载的适宜条件
本实验参照刘刚等(2004)的方法, 在25°C黑暗条件
下, 对悬浮细胞进行Fluo-3AM装载。发现装载后35
分钟, 在488 nm激发光下观察到Fluo-3AM能进入大
部分悬浮细胞的胞质中, 且在此后30分钟内染料不
会进入液泡, 这为检测[Ca2+]cyt的动态变化提供了充
裕时间。但在装载60分钟后, 大部分Fluo-3AM都进入
到了液泡, 不能准确反应[Ca2+]cyt的动态变化(图2)。
通过上述实验, 确定Fluo-3AM装载到悬浮细胞胞质
中的最佳条件为: 黑暗, 温度为25°C, 装载时间为35
分钟, 装载浓度为20 μmol·L–1。
2.2.2 CLSM测定悬浮细胞[Ca2+]cyt变化方法的建
立及验证
为了使装载Fluo-3AM的悬浮细胞能够准确反映出胞
质Ca2+浓度的变化, 本实验选用了Ca2+载体A23187
和Ca2+漂白剂Mn2+进行实验。A23187是一种移动性
离子载体, 它的功能是运送Ca2+和Mg2+等二价阳离
子进入细胞内, 在细胞生物学研究中被广泛用于增加
[Ca2+]cyt(刘刚等, 2004; 王文莉等, 2010)。而Mn2+也
能通过质膜Ca2+通道进入胞内, 且Mn2+与荧光探针
Fluo-3AM的结合能力远远大于Ca2+, 但结合了Mn2+
的Fluo-3AM不像结合Ca2+那样受一定波长的激发光
照射而发出一定波长的荧光, 即Ca2+荧光探针的发射
荧光被Mn2+漂白了。
将装载了Fluo-3AM的悬浮细胞置于激光共聚焦
扫描显微镜专用培养皿上, 在CLSM下观察[Ca2+]cyt
的动态变化。结果(图3A)显示, 未经任何处理的L10
悬浮细胞在测定时间内[Ca2+]cyt相对稳定, 只在一定
范围内有微小的波动; 加入终浓度为10 μmol·L–1
A23187后, 悬浮细胞[Ca2+]cyt迅速升高, 在约250秒
后呈现平稳的上升趋势, 说明A23187能迅速把Ca2+
带入悬浮细胞。5389悬浮细胞表现出相似的变化趋势
(图略 )。当在悬浮细胞体系中加入终浓度为1 0
μmol·L–1A23187和终浓度为10 mmol·L–1Mn2+后, 发
4 植物学报 50(1) 2015

图1 不同处理对小麦悬浮细胞死亡率的影响
(A) IWF对悬浮细胞死亡率的诱导; (B) LaCl3对IWF刺激诱发的悬浮细胞死亡率的影响; (C) EGTA对IWF刺激诱发的悬浮细胞死亡率
的影响; (D) c-PTIO对IWF刺激诱发的悬浮细胞死亡率的影响

Figure 1 Effect of different treatments on the death rate of wheat suspension cell
(A) The death rate of suspension cell induced by IWF; (B) Effect of LaCl3 on the death rate of suspension cell induced by IWF; (C)
Effect of EGTA on the death rate of suspension cell induced by IWF; (D) Effect of c-PTIO on the death rate of suspension cell
induced by IWF



图2 不同时间Fluo-3AM的装载效果
(A) 未装载Fluo-3AM的悬浮细胞; (B) 装载Fluo-3AM35分钟后的悬浮细胞; (C) 装载Fluo-3AM60分钟后的悬浮细胞。TR: 相应荧光
图的透射光照片; 右下角色柱是本图所采用伪彩的色阶标尺。Bar=20 μm

Figure 2 The loading effect of Fluo-3AM under different time
(A) Suspension cell of unloaded Fluo-3AM; (B) Suspension cell 35 mins after loading Fluo-3AM; (C) Suspension cell 60 mins
after loading Fluo-3AM. TR: The transmission photo corresponding to the fluorescent. The color bar beside the image is the
pseudocolor bar of this plate. Bar=20 μm

乔妹等: 小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中 Ca2+和 NO 的动态变化及其相互作用 5

现原来Ca2+荧光探针的发射荧光被漂白了。本实验把
A23187和Mn2+结合使用, 除了说明本实验系统确实能
够反映[Ca2+]cyt的变化之外, 还说明实验所检测的荧光
是由Ca2+和荧光指示剂Fluo-3AM结合后产生的。
2.2.3 IWF处理后小麦悬浮细胞[Ca2+]cyt变化的
CLSM观察
本课题组从感染叶锈菌的寄主细胞间隙中提取IWF,
并证实其含有诱导活性成分, 可诱导寄主产生过敏性
死亡等防卫反应, 对IWF进行分离纯化, 已初步鉴定
其活性物质为分子量约30 kDa的糖蛋白(王冬梅等,
1997; 韩胜芳等, 2000; 王庆梅等, 2000)。IWF的提
取及实验浓度的确定参考王庆梅等(2000)的方法。以
IWF作为激发子刺激悬浮细胞, 来模拟小麦叶片与叶
锈菌的互作系统, 从而在单细胞水平上阐释植物与叶
锈菌互作的分子机制。
本实验将小麦的两个品种L10和5389的悬浮细胞
装载钙离子荧光探针Fluo-3AM后, 分别置于激光共聚
焦专用培养皿上, 加入IWF260后在CLSM下进行观察
记录, 发现经激发子处理后两品种悬浮细胞[Ca2+]cyt动
态变化表现出明显的差异。L10悬浮细胞在激发子
IWF260刺激100秒后[Ca2+]cyt开始缓慢上升, 在330秒
左右达到最高峰(图3B), 此后稍有下降, 在700秒又出
现第2个钙峰(图3B), 之后又趋于下降。而小麦5389悬
浮细胞经IWF260处理后, [Ca2+]cyt水平只发生轻微变化,
在处理后800秒内一直维持较稳定的水平(图3C)。
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图3 小麦悬浮细胞经不同处理后[Ca2+]cyt的动态变化
(A) A23187和Mn2+处理后悬浮细胞[Ca2+]cyt的变化; (B) L10悬
浮细胞经IWF处理后[Ca2+]cyt的动态变化; (C) 5389悬浮细胞经
IWF处理后 [Ca2+]cyt的动态变化 ; (D) EGTA和LaCl3处理对
IWF260刺激L10悬浮细胞诱发的[Ca2+]cyt的影响; (E) c-PTIO处
理对IWF260刺激L10悬浮细胞诱发的[Ca2+]cyt的影响

Figure 3 Cytosolic calcium dynamics in wheat suspension
cell after different treatments
(A) Changes of cytosolic calcium dynamics in suspension cell
after A23187 and Mn2+ treatment; (B) Cytosolic calcium dy-
namics in L10 suspension cell after IWF treatment; (C) Cy-
tosolic calcium dynamics in 5389 suspension cell after IWF
treatment; (D) Effect of EGTA and LaCl3 on the cytosolic
calcium dynamics in L10 suspension cell after IWF260 treat-
ment; (E) Effect of c-PTIO on the cytosolic calcium dynamics
in L10 suspension cell after IWF260 treatment
6 植物学报 50(1) 2015
实验中以IWFck处理作为对照, 小麦L10的悬浮
细胞在IWFck处理后800秒内, [Ca2+]cyt水平只发生轻
微变化, 与未经任何处理的L10悬浮细胞相比基本没
有发生变化(图3B); 5389也表现相似的趋势(图3C)。
以上实验结果表明, 亲和性不同的小麦品种悬浮
细胞在应答激发子刺激时, 其[Ca2+]cyt水平的变化有
着明显的差异, 表明胞质Ca2+可能参与小麦悬浮细胞
应答激发子所诱发的过敏性反应过程。
2.3 钙离子代谢或钙通道相关药物对IWF诱导的
小麦悬浮细胞死亡的影响
Ca2+是真核生物中调节细胞信号转导的中心环节 ,
Ca2+参与植物对冷激、红光/远红光、病菌和伤害等一
系列刺激反应的调节(Kenton et al., 1999)。本课题组
刘刚等在超微结构方面的研究已证明, 在叶锈菌侵染
小麦的不亲和互作过程中, 胞外Ca2+进入胞质是一件
重要事件(Liu et al., 2010)。张蓓等(2010)借助药物学
实验证明, 胞外钙进入胞内是小麦应答叶锈菌侵染诱
发的过敏性反应中的重要信号分子。本实验结果(图
3B)表明, 激发子刺激导致抗病品种L10悬浮细胞胞
质Ca2+水平升高。为进一步探讨Ca2+是否介导悬浮细
胞应答激发子诱发的过敏性死亡过程, 本实验设计了
以下药物学实验。
LaCl3通常被用作质膜钙通道抑制剂, 而EGTA
可作为胞外钙离子螯合剂使用。实验结果显示, 附加
La3+使IWF260诱发的[Ca2+]cyt升高呈现大幅度降低(图
3D), 细胞死亡率也降至对照水平(图1B); 附加EGTA
使胞质Ca2+浓度降低的幅度更大, 趋于对照水平(图
3D), 同时也大大降低了IWF260诱发的细胞死亡率(图
1C)。由此说明悬浮细胞经激发子处理后[Ca2+]cyt的升
高主要是依赖于胞外Ca2+内流。这一结论与前期获得
结论相符。
综上所述, 我们推测L10悬浮细胞经IWF260处理
后[Ca2+]cyt的升高可能主要是依赖于胞外Ca2+内流,
且[Ca2+]cyt增加作为信号分子参与激发子诱发的细胞
死亡过程。这与刘刚等(2004)和张蓓等(2010)用活体
实验系统所得的结论一致。
2.4 IWF处理后悬浮细胞胞质NO水平的变化
2.4.1 DAF-FM DA装载的适宜条件
实验确定了DAF-FM DA装载到悬浮细胞胞质中的最
佳条件: 黑暗, 温度为25°C, 装载时间为5分钟, 装
载浓度为1 μmol·L–1。

2.4.2 IWF处理对小麦悬浮细胞胞质NO变化的影响
为了使装载了DAF-FM DA的悬浮细胞能够准确反映
出胞质NO浓度的变化, 我们选用了NO供体SNP和
NO清除剂c-PTIO进行预备实验。当L10悬浮细胞经
SNP处理后, 胞质NO荧光在200秒左右开始迅速上
升 , 400秒以后保持平稳的上升趋势。当将100
μmol·L–1c-PTIO和SNP共同加入悬浮细胞后, 800秒
内NO荧光只在一定范围内有微小的波动。SNP和
c-PTIO的结合使用确保本实验系统能够反映胞质NO
浓度的变化(图4A)。在此基础上, 小麦的两个品种
L10和5389的悬浮细胞首先与荧光探针DAF-FM DA
共孵育, 之后分别经过IWFCK和IWF260处理, 在激光
共聚焦扫描显微镜下观察两个处理中NO的变化, 以
未经IWF处理的正常培养细胞为对照。实验结果显示,
经激发子处理后两品种悬浮细胞胞质NO动态变化表
现出明显的差异。L10悬浮细胞在IWF260刺激100秒后
胞质NO开始缓慢上升, 在400秒达到高峰, 在此水平
持续约200秒, 随后逐渐下降, 在1 000秒以后降至对
照水平(图4B)。而小麦5389悬浮细胞经IWF260处理
后, 胞质NO水平只发生轻微变化, 在处理时间内一
直保持与对照相近的水平(图4C)。两种悬浮细胞经
IWFck处理后胞质NO水平与未经任何处理的对照相
比基本没有发生变化(图4B, C)。
以上结果表明, 亲和性不同的小麦品种悬浮细胞
在应答激发子刺激时, 其胞质NO水平的变化有着明
显的差异, 表明胞质NO可能参与小麦悬浮细胞应答
激发子诱发的过敏性反应过程。
2.5 NO清除剂对IWF诱导的小麦悬浮细胞死亡的
影响
为了进一步探讨激发子诱发的NO是否介导悬浮细胞
的死亡过程, 本实验使用NO专一性清除剂c-PTIO预
处理小麦悬浮细胞0.5小时后, 再加入IWF, 检测不同
时间的细胞死亡率。结果表明, L10悬浮细胞经100
μmol·L–1c-PTIO预处理后再经IWF260处理, 其细胞死
亡率降至对照水平(图1D), 而胞质NO也降到对照水
平(图4D)。实验结果表明, L10悬浮细胞经IWF260处理
后胞质NO的升高可能作为信号分子参与激发子诱发
乔妹等: 小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中 Ca2+和 NO 的动态变化及其相互作用 7

的细胞死亡过程。
2.6 NO清除剂对 IWF诱导的小麦悬浮细胞
[Ca2+]cyt的影响
上述实验已经证明Ca2+和NO可作为胞内信号分子参
与IWF刺激诱发的细胞死亡过程。为进一步探讨二者
之间的关系, 我们设计以下药物学实验进行分析。首
先, 将L10悬浮细胞经100 μmol·L–1c-PTIO预处理后
再经IWF260处理, 观察[Ca2+]cyt的动态变化。结果表明
(图3E), c-PTIO的使用对IWF260刺激诱发的胞质Ca2+
浓度变化无影响。这一结果表明, IWF260刺激诱发的
钙峰可能与NO无关。然后, 我们利用影响钙离子代谢
的药物探讨[Ca2+]cyt的变化对胞质NO的影响。
2.7 钙离子代谢或钙通道相关药物对IWF诱导的
小麦悬浮细胞胞质NO的影响
为进一步检测[Ca2+]cyt对胞质NO的影响, 我们使用了
质膜钙通道抑制剂LaCl3和胞外钙离子螯合剂EGTA
进行实验。首先 , 将L10悬浮细胞分别经LaCl3和
EGTA预处理0.5小时, 然后再加入IWF260, 观察胞质
NO动态变化。结果(图4E)表明, EGTA能使IWF260诱
发NO峰消减近一半, 而LaCl3却对之影响不明显。 结
合前一实验的结果(图3D), 我们认为, EGTA螯合了
胞外钙离子, 阻断了胞外钙向胞内流入, 而此时NO
峰没有完全降为对照水平的原因是可能还有其它信
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图4 小麦悬浮细胞经不同处理后胞质NO的动态变化
(A) L10悬浮细胞经SNP和c-PTIO处理后胞质NO动态变化; (B)
L10悬浮细胞经IWF处理后胞质NO动态变化; (C) 5389悬浮细
胞经IWF处理后胞质NO动态变化; (D) c-PTIO处理对IWF260刺
激L10悬浮细胞诱发的胞质NO的影响; (E) EGTA和LaCl3处理
对IWF260刺激L10悬浮细胞诱发的胞质NO的影响

Figure 4 Cytosolic NO dynamics in wheat suspension cell
after different treatments
(A) Cytosolic NO dynamics in L10 suspension cell after SNP
and c-PTIO treatment; (B) Cytosolic NO dynamics in L10
suspension cell after IWF treatment; (C) Cytosolic NO dy-
namics in 5389 suspension cell after IWF treatment; (D) Ef-
fect of c-PTIO on cytosolic NO dynamics in L10 suspension
cell after IWF260 treatment; (E) Effect of EGTA and LaCl3 on
cytosolic NO dynamics in L10 suspension cell after IWF260
treatment
8 植物学报 50(1) 2015
号分子参与了对NO的诱发。施加LaCl3只部分抑制质
膜钙通道, 使[Ca2+]cyt降低的水平小于EGTA的使用,
所以对Ca2+诱发的NO影响较小。综合以上结果初步
证明, L10悬浮细胞经IWF260处理后胞质NO的增加可
能与胞外Ca2+内流有关, 在小麦悬浮细胞应答激发子
刺激诱发的过敏性反应过程中, 钙在NO的上游发挥
作用。
2.8 讨论
2.8.1 选用悬浮细胞的必要性
大量研究表明, 利用激发子-悬浮细胞体系进行动态
监测可以准确呈现植物中信号分子的动态变化。胡向
阳等(2002)利用化学发光光度计检测激发子刺激拟
南芥悬浮细胞中钙离子发光强度, 获得胞质Ca2+变化
情况, 但是未进行实时变化监测。高海波和沈应柏
(2011)利用非损伤微测技术检测了激发子诱导合作
杨悬浮细胞钙离子流及氢离子流的振荡。刘刚(2004)
利用荧光指示剂孵育法对小麦叶肉细胞原生质体胞
质游离Ca2+的变化进行了动态监测, 获得了与本实验
类似的双峰曲线, 原生质体在受激发子刺激后第1个
峰出现在250秒, 而悬浮细胞第1个峰出现在330秒,
这可能由于悬浮细胞比原生质体结构复杂, 因而时间
滞后。陈阳辉等(2011)利用激发子诱导小麦悬浮细胞
产生NO, 使用Griess试剂来检测NO含量, 同样获得
了与本实验类似的单峰曲线, 出现峰值的时间在1小
时。而本实验利用激光共聚焦扫描显微镜进行实时监
测, 在400秒出现最大峰, 出现的时间差异可能是因
为两种检测方法不同所致。柯学等(2011)对机械刺激
诱导的烟草悬浮细胞一氧化氮产生途径及其与Ca2+
和钙调素的关系研究表明, Ca2+螯合剂EGTA、质膜
Ca2+通道阻断剂La3+、胞内Ca2+通道拮抗剂钌红, 以
及钙调素抑制剂CPZ和TFP预处理均不同程度地抑
制了机械刺激诱导的烟草细胞NO的产生, 而机械刺
激过程中钙调素活性显著上升, 并与NOS活性和NO
含量的变化相一致。徐茂军等(2004)对NO参与真菌
诱导子对红豆杉(Taxus mairei)悬浮细胞中PAL活化
和紫杉醇生物合成的促进作用进行研究, 动态监测结
果表明NO作为信号分子活化PAL并触发紫杉醇的生
物合成。在小麦-叶锈菌互作体系中, 叶锈菌属于活体
营养寄生菌, 只有在小麦叶片上才能进行夏孢子的繁
殖。由于小麦叶片较厚, 木质化程度较高, 对该互作
体系中钙信号或NO信号的检测表明, 不能通过荧光
探针孵育法进行即时观察监测, 所以Ca2+和NO相互
作用的动态变化尚未被呈现。因此, 本文借助激光共
聚焦扫描显微镜来呈现激发子-悬浮细胞体系中Ca2+
和NO的动态变化。

2.8.2 小麦-叶锈菌互作过程中NO代谢与Ca2+信号
的相互关系
Ca2+作为重要的胞内第二信使, 参与了植物对环境信
号的应答反应(Furch et al., 2009), 是植物信号转导
的主要分子。除此之外, Ca2+还参与了细胞内多种生
理活动的调节, 如气孔的开关等(Kudla et al., 2010)。
各种生物或非生物逆境, 包括病原菌侵染、干旱、盐
害、冷害、热害等均能诱导植物细胞质Ca2+浓度提高,
从而将信号通过钙结合蛋白, 如钙调素、钙依赖的蛋
白激酶、钙依赖的磷酸化酶等转导放大(王海波等,
2010)。
Ca2+和NO是植物体内广泛存在的信号分子, 参
与调控植物生长发育的各个阶段和植物对生物及非
生物胁迫的响应。大量证据表明, NO是植物防御反应
中的关键信使, 其信号转导机制也受到越来越多的关
注(赵晓刚等, 2004)。一系列的文献证据表明, 植物中
NO担任钙离子活动的信使(Jeandroz et al., 2013)。
Ca2+既可以激活NO信号, 也可以感知NO信号。如
Ca2+参与介导激发子诱导的烟草和葡萄(Vitis vinif-
era)中NO的产生, 且NO产生后可进一步引起胞内
Ca2+浓度升高(Vandelle et al., 2006)。Ma等(2013)
在拟南芥中发现, 植物真菌激发子引发的免疫信号途
径中, NO、H2O2和CDPK位于早期钙信号的下游。也
有文献报道, Ca2+和NO均参与乙烯诱导的蚕豆气孔
关闭, 且NO(主要由NR途径合成)可能位于Ca2+下游
参与调控这一信号转导过程(刘国华等, 2009)。这一
结论在Park等(2013)的实验中也被证实, 远红外光照
射产生的NO依赖Ca2+, Ca2+增加后会导致NO的激
增。但是目前关于植物与病原菌互作过程中胞质Ca2+
的升高和NO生成的信号转导机制及二者相互关系尚
不清楚。
本课题组近几年来在探讨Ca2+是否作为胞内第
二信使参与小麦与叶锈菌互作过程的研究中, 已经从
胞外钙、钙调素浓度的改变、影响钙离子代谢和钙通
乔妹等: 小麦悬浮细胞应答激发子刺激的过敏性反应中 Ca2+和 NO 的动态变化及其相互作用 9
道的药物实验(侯春燕等, 2007)、叶肉细胞中Ca2+的
亚细胞定位(Liu et al., 2010)及激发子-原生质体系统
[Ca2+]cyt的变化(刘刚等, 2004)等多方面系统证明了
钙信使系统介导小麦-叶锈菌的互作过程, Ca2+内流
是互作过程中小麦抗叶锈菌侵染表达防卫反应所必
需的(关春蕾等, 2006)。
本实验通过改进实验手段, 用更灵敏的激光共聚
焦扫描显微镜对激发子-悬浮细胞互作体系中胞质
Ca2+和NO的变化进行实时监测。结果表明, La3+预处
理L10悬浮细胞使激发子诱发的钙峰消减了近一半,
而EGTA的使用将质膜外溶液的钙离子螯合后使激发
子对L10悬浮细胞诱发的[Ca2+]cyt增加大大降低, 降
至与对照相近的水平。LaCl3是熟知的细胞质膜钙离
子通道抑制剂, 可以使Ca2+通道开放程度减弱或使其
开放时间缩短, 阻止或减弱Ca2+流入细胞质中, 部分
抑制质膜钙通道, 而[Ca2+]cyt升高一般源于胞外钙离
子内流和胞内钙库释放两个途径。由此说明悬浮细胞
经激发子处理后[Ca2+]cyt的升高主要依赖于胞外钙离
子内流 , 这一结论与前期研究所得结论相符。而
c-PTIO清除NO后, IWF260处理诱发的钙峰几乎不受
影响, 但EGTA却使IWF260刺激产生的NO峰大大降
低, 而LaCl3却对之影响不明显。我们认为, EGTA螯
合了胞外钙离子阻断其进入胞内, 因此由钙信号诱发
的NO峰受到较大影响, 但并未使NO峰值降至对照水
平 , 可能还有其它信号分子参与对NO的诱发。而
LaCl3只部分抑制质膜钙通道, 使[Ca2+]cyt降低的水平
小于EGTA, 所以对Ca2+诱发的NO影响较小。以上结
果说明L10悬浮细胞经IWF260处理后产生的NO可能
与Ca2+内流有关, 而NO对[Ca2+]cyt的变化影响不明
显。值得说明的是, 本实验结果是借助激光共聚焦扫
描显微镜对悬浮细胞内NO和[Ca2+]cyt的实时动态变
化监测而得出的, 而对于小麦与叶锈菌互作体系中
NO和[Ca2+]cyt的关系还有待进一步研究。
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Dynamics and Interaction of Ca2+ and Nitric Oxide in Wheat
Suspension Cells in the Hypersensitive Response
Mei Qiao, Jiawei Sun, Yan Chen, Shengfang Han, Chunyan Hou, Gang Liu*, Dongmei Wang*
College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China
Abstract Suspension cells of wheat varieties Lovrin 10 and Zhengzhou 5389 were stimulated with IWF-260, a leaf in-
tercellular washing fluid induced by leaf rust. The dynamics and interaction of Ca2+ and nitric oxide (NO) in the hypersen-
sitive response induced by IWF-260 were analysed. The fluorescence molecular probe Fluo-3AM and DAF-FM DA were
used to mark Ca2+ and NO, respectively. The two kinds of suspension cells showed differences in the concentration of
Ca2+. Lovrin 10, a disease-resistant variety, showed two peaks of [Ca2+]cyt, at 330 and 700 s, on stimulation, whereas
Zhengzhou 5389, a susceptible variety, showed no obvious change in [Ca2+]cyt with stimulation. The increased [Ca2+]cyt
depended on Ca2+ flowing into cells, which suggests that Ca2+ may be involved in the hypersensitive response. Like Ca2+,
NO showed a similar pattern after elicitor stimulation. For Lovrin 10, NO showed a peak, with no change for Zhengzhou
5389. Thus, NO production and extracellular calcium influx are closely related to wheat suspension cells’ response to
stimulation; NO may play a role downstream of calcium.
Key words calcium (Ca2+), elicitor, nitric oxide (NO), suspension cell, wheat
Qiao M, Sun JW, Chen Y, Han SF, Hou CY, Liu G, Wang DM (2015). Dynamics and interaction of Ca2+ and nitric oxide
in wheat suspension cells in the hypersensitive response. Chin Bull Bot 50, 1–11.
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* Authors for correspondence. E-mail: gangliu2004@126.com; dongmeiwang63@126.com
(责任编辑: 白羽红)