全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (2): 179–188, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00179
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收稿日期: 2010-07-23; 接受日期: 2010-11-07
基金项目: 863 计划(No.2007AA09Z110)、973 计划(No.2010CB428702)、公益行业项目(No.201005031)和 908 专项(No.908-ZC-I-02)
* 通讯作者。E-mail: doudinglu@126.com
东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析
王红霞, 陆斗定*, 黄海燕, 戴鑫烽, 夏平
国家海洋局第二海洋研究所, 国家海洋局海洋生态系统与生物地球化学重点实验室, 杭州 310012
摘要 利用光学显微镜、荧光显微镜、扫描电镜及分子生物学等方法, 对分布于我国东海海域的剧毒卡尔藻(Karlodinium
veneficum)藻株 (LAMB090611)的形态特征和显微结构进行了描述 , 并探讨了其分子系统进化关系。该藻株细胞长
11.1–18.7 µm, 平均值为(14.2±1.8) µm, 宽8.2–14.7 µm, 平均值为(10.8±1.5) µm。细胞形态结构特征为: 上下锥体积基本
相同; 顶沟短而直; 腹孔明显; 纵沟延伸至上锥; 横沟错位距离约占细胞总长的28%–38%; 含有2或4个不规则形态的叶绿
体; 细胞核位于中部或下锥。此藻种的暴发可引发有害赤潮(harmful algal bloom)。当前加强有害赤潮的预防和监测工作是
减少危害的有效途径, 而对引发赤潮原因种的准确识别和鉴定则是基础和关键。
关键词 东海, 剧毒卡尔藻, 分子系统进化, 形态特征, 扫描电镜
王红霞, 陆斗定, 黄海燕, 戴鑫烽, 夏平 (2011). 东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析. 植物学报 46, 179–188.
近年来, 有害赤潮(harmful algal bloom, HAB)频
发于我国和世界许多国家的沿海区域, 成为全球共同
关注的重大海洋环境问题和生态灾害(Hallegraeff,
1993; Anderson and Garrison, 1997)。东海因受长江
径流等陆源输入影响, 形成了独特的富营养环境, 为
赤潮暴发孕育了条件, 并已成为我国赤潮发生最严重
的区域之一(张传松等, 2008)。该海域的赤潮暴发呈
现出发生时间提前、持续时间加长、发生面积加大、
有毒有害藻类逐渐增加的特点(苏纪兰, 2001; 周名
江等, 2001)。海洋甲藻是赤潮原因种家族中最重要的
类群(陆斗定等, 2003), 而对于赤潮原因种的准确识
别和鉴定是赤潮研究和监测工作的基础和关键
(Schiller, 1933; Hallegraeff et al., 1995)。
剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum (D. Ballan-
tine) J. Larsen)是一种微小的海洋甲藻, 隶属裸甲藻
目(Gymnodiniales)凯伦藻科(Kareniaceae)卡尔藻属
(Karlodinium)。1956年, 剧毒卡尔藻被发现并描述,
命名为剧毒裸甲藻 (Gymnodinium veneficum Bal-
lantine)(Ballantine, 1956)。10年后, Leadbeater和
Dodge(1966)再次对该藻进行描述, 并命名为Wolo-
szynskia micra Leadbeater et Dodge。此后随着时间
的推移, 出现了多个同种异名, 包括Gyrodinium ga-
latheanum、 Gymnodinium galatheanum、Gymn-
odinium veneficum和Karlodinium mircum。现在被国
际上大多数学者所接受的种名为Karlodinium vene-
ficum (Bergholtz et al., 2006)。关于剧毒卡尔藻的正
确分类地位, 要归功于Daugbjerg等(2000)的研究工
作。他们通过对原先裸甲藻属(Gymnodinium)所包含
藻种的核糖体大亚基(large subunit, LSU)DNA序列、
显微形态结构特征以及叶绿体色素成分的比较分析,
将此属重新划分为4个不同的属 , 分别是裸甲藻属
(Gymnodinium)、赤潮藻属 (Akashiwo)、凯伦藻属
(Karenia)和卡尔藻属(Karlodinium)(Daugbjerg et al.,
2000)。同时, De Salas等(2003)从形态学和系统进化
学上证明 , 新描述的凯伦藻科包括达卡藻属
(Takayama)、凯伦藻属和卡尔藻属。
作为卡尔藻属的代表种, 剧毒卡尔藻表现出此属
的典型特征: 顶沟短且直, 腹孔清晰可见, 含墨角藻
黄素(De Salas et al., 2003)。同时剧毒卡尔藻还拥有
扁豆状的淀粉核与类似塞子状的质膜结构(plug-like
structures of the amphiesma)(Daugbjerg et al.,
2000)。但在卡尔藻属的其它种中并未发现这样的质
膜结构, 因此它是剧毒卡尔藻所特有的(Bergholtz et
al., 2006)。另外, 剧毒卡尔藻暴发赤潮时通常伴随鱼
·研究报告·
180 植物学报 46(2) 2011
类的死亡(Deeds et al., 2002; Kempton et al., 2002),
且从此藻种分离出来的卡尔藻毒素(karlotoxin)包括
卡 尔 藻 毒 素 1(KmTx1) 和 卡 尔 藻 毒 素 2(KmTx2)
(Place, 2004; Deeds and Place, 2006)。与凯伦藻属
相比, 有关卡尔藻属的研究发展相对缓慢, 2005年已
有10种凯伦藻被描述, 而被描述的卡尔藻只有4种
(Bergholtz et al., 2006)。目前被描述的凯伦藻达到13
种 , 与此同时被描述的卡尔藻数目也达到9种 (De
Salas et al., 2008)。
由K. veneficum引发的赤潮首次报道于南非
(Braarud, 1957; Pieterse and van der Post, 1967),
之后是欧洲(BjФrnland and Tangen, 1979; Nielsen,
1996)、 北美(Terlizzi et al., 2000; Li et al., 2000)和
澳大利亚(Cosgrove et al., 2000; Ajani et al., 2001)。
随着研究的不断扩展和深入, 世界上许多地方也陆续
发现了K. veneficum (Bergholtz et al., 2006)。然而,
至今未见关于我国海域K. veneficum的分类学报道。
本研究中所用的K. veneficum藻株分离于东海(East
China Sea, ESC)海区南麂列岛赤潮水样, 对其进行
了形态特征描述、分子测序以及系统发育分析, 以期
为阐明该藻的地理分布特征以及提高赤潮藻监测和
预警的质量奠定基础。
1 材料与方法
1.1 藻种的分离纯化和培养
实验所用剧毒卡尔藻 (Karlodinium veneficum (D.
Ballantine) J. Larsen)藻种分离于2009年6月在浙江
省温州东海海域南麂列岛所采的赤潮水样。取样时用
直径为20 µm的浮游植物筛网滤去个体较大的浮游生
物, 最后得到大约1.5 L水样。记录采样时间和地点,
样品经低温保存并送回实验室进行分离。藻株分离采
用逐级稀释法并结合毛细管分离法, 获得单细胞藻
株。藻种分离培养的条件是温度17–20°C, 盐度为
28–30, 光暗循环为12小时光照/12小时黑暗, 光合
有效辐射(photosynthetically active radiation, PAR)
值为9.6–10.6 µmol·m–2·s–1, 光照强度为810 lux。
1.2 样品处理与形态观察
1.2.1 光学和荧光显微镜下观察
在光学显微镜(OLYMPUS CX31)下对剧毒卡尔藻的
活体藻细胞的生长情况进行观察。待藻细胞达到一定
密度后, 取少许处于指数生长期的藻液, 用鲁哥染液
固定。选取50个藻细胞进行测量, 此步骤通过光学显
微镜(LEICA DM2500)来实现。为了确定剧毒卡尔藻
细胞核的位置 , 用核染料4,6-二脒基 -2-苯基吲哚
(4’6-diamidino-2-phenylindoledihydrochoride, DAPI)
对藻细胞进行染色 , 然后在荧光显微镜 (LEICA
DM5000B)下进行观察。

1.2.2 扫描电镜下观察
吸取指数期的藻液5 mL于离心管中, 经低转速离心
(Bolch et al., 1999)后收集大约0.5 mL浓缩的藻液。
然后用加有培养液的4%锇酸在室温下固定1.5小时,
先用培养液、半盐度过滤海水和去离子水进行洗脱;
再用浓度分别为10%、30%、50%、70%、80%、90%
和95%的乙醇各脱水15分钟(De Salas et al., 2008);
最后用100%乙醇和100%丙酮各脱水2次。处理后利
用HITACHI HCP-2临界点干燥器进行干燥 , 用
HITACHI E-1010镀金装置进行喷金。在HITACHI S-
3000N扫描电镜下观察。
1.3 分子测序与系统进化分析
1.3.1 分子测序
取指数期藻培养液50 mL, 在室温下1 343 ×g离心10
分钟 , 收集藻细胞沉淀并将其小心转移至1.5 mL
EP(eppendorf tube)管中。然后用UNIQ-10柱式植物
基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取总DNA。提取
的DNA序列作为PCR反应的模板来扩增大约700 bp
(base pair)的ITS(internal transcribed spacer) rDNA
序列, 扩增引物为ITS4和ITS5(侯建军等, 2005)。
PCR反应体系为50 µL, 包括浓度为10 µmol·L–1的正
向引物ITS4和反向引物ITS5各1 µL, 10×Buffer 5 µL,
1 mmol·L–1dNTP混合液4 µL, 5 U·µL–1 Taq DNA 聚
合酶0.5 µL, 基因组DNA提取液2 µL, 加无菌双蒸水
至50 µL。PCR反应程序为: 95°C预变性5分钟; 94°C
1分钟, 55°C 1分钟, 72°C 2分钟, 30个循环; 72°C延
伸5分钟。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,
电压为120 V, 电泳时间为30分钟。然后用浓度为
0.5%的EB(溴化乙锭)染色。在凝胶成像分析仪下进行
凝胶成像与图谱分析, 选择条带清晰的序列送上海生
工测序。
王红霞等: 东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析 181
1.3.2 系统进化分析
所测得的ITS序列先在NCBI数据库中与其它藻株的
序列进行比对。然后采用ClustalW软件包对ITS序列
与从GenBank数据库中获得的相关序列进行多序列
匹配排列。系统进化分析中所用的相关序列信息见表
1。利用Mega4.1软件包, 根据Kimura双参数法则, 分
别采用邻接法(neighbor-joining, NJ)、最小进化法
(minimum-evolution, ME)和最大简约法(maximum-
parsimony, MP)构建系统发育树, 各分支的重复数均
为1 000。利用Mega4.1软件包 , 以邻接法Jukes-
Cantor方式计算获得Jukes-Cantor距离矩阵。
2 结果与讨论
2.1 细胞形态特征
2.1.1 光学和荧光显微镜下细胞形态特征
剧毒卡尔藻属于微型海洋甲藻, 分离于东海海区的K.
veneficum (LAMB090611), 其细胞大小如下: 体长
11.1–18.7 µm, 平均值为(14.2±1.8) µm; 体宽8.2–
14.7 µm, 平均值为(10.8±1.5) µm。在光学显微镜下
可看到细胞整体形状似葫芦, 上锥与下锥大小基本相
同。横沟位于细胞中间, 将其分为上下两部分(图1A)。
纵沟在光学显微镜下不太明显, 但叶绿体清晰可见,
一般有2或4个, 在细胞内呈不规则分布且颜色为黄
褐色(图1B, C)。叶绿体在上、下锥部各有2个(图1C),
不规则地排列在细胞内部边缘。在光学显微镜下细胞
核模糊可见(图1B); 而用DAPI染色后, 在荧光显微镜
下可清楚地看到细胞核大且圆, 位于细胞中部或下锥
部分(图1D)。东海藻株LAMB090611与1977年分离自
挪威奥斯陆峡湾 (Oslofjord)的K. veneficum藻株
K-0522及1950年分离自英国德文郡港(Devorport)的
K. veneficum藻株Plymouth 103的比较见表2。

2.1.2 扫描电镜下细胞形态特征
东海藻株K. veneficum(LAMB090611)在扫描电镜下
细胞整体呈椭圆形, 被横沟分为上、下锥两部分, 上
锥顶部较尖, 下锥近似半圆形, 且两部分大小基本相
同(图2B, F)。腹孔清晰可见, 它位于顶沟的左侧, 呈
狭长状, 长度约为0.8–1 µm(图2B–D)。顶沟位于细胞
顶部(图2C–E), 腹孔的右侧, 它从细胞的顶腹面一直
延伸到顶背面(图2E), 背面观顶沟清晰可见, 顶沟长
度约占上背面长度的1/5(图2F), 且其延伸方向与腹
孔方向呈斜对(图2C, D)。纵沟明显延伸至上锥(图2A,
D)。横沟处于细胞中间, 在腹面与纵沟交界处产生错
位, 错位的长度约占细胞总长的28%–38%。同时还
可观察到鞭毛缠绕在横沟与纵沟里面(图2A, B)。
2.2 分子序列
本实验中的东海藻株K. veneficum(LAMB090611)的
ITS序列总长度为640 bp, 其中GC含量为49%。将K.
veneficum (LAMB090611)与GenBank中序列编号分
别为GU263462、AJ557028、AJ557027和AJ534656


表1 基于ITS序列进行的系统发育分析中所用藻种来源
Table 1 Origin of materials for the ITS sequences used in the phylogenetic analysis
Taxon Strain Sampling locations Source of sequence Accession No.
Karlodinium veneficum CCMP1609 USA Bowers and Place, 2009 GU263462
Karlodinium veneficum GC1-CSIC Alfacs Bay, Spain Garcés et al., 2006 AJ534656
Karlodinium veneficum GC5-IRTA Alfacs Bay, Spain Garcés et al., 2006 AJ557028
Karlodinium veneficum GC8-IRTA Alfacs Bay, Spain Garcés et al., 2006 AJ557027
Karlodinium veneficum LAMB090611 East China Sea, China This study HQ434334
Karlodinium armiger GC7-IRTA Alfacs Bay, Spain Garcés et al., 2006 AJ557024
Karlodinium armiger GC3-IRTA Alfacs Bay, Spain Garcés et al., 2006 AM184205
Takayama cf. pulchellum TPXM Xiamen, China Gu and Sun, 2004 AY764179
Takayama sp. IEO-VGO341 Atlantic Coast, Spain Garcés et al., 2006 AM183261
Karenia bidigitata CAWD80 Forveaux Strait, New Zealand Stern and Keeling, 2009 FJ823561
Karenia brevis SP3 Gulf of Mexico, USA Loret et al., 2001 AF352825
Prorocentrum minimum RCC922 South East Pacific Ocean, Chile Stern and Keeling, 2009 FJ823585
CCMP: Culture collection of marine phytoplankton, Provasoli-Guillard National Center, Maine, USA
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图1 光学和荧光显微镜下观察剧毒卡尔藻(LAMB090611)的细胞形态
(A) 细胞整体形状和横沟(箭头所示); (B) 细胞叶绿体和细胞核(箭头所示); (C) 叶绿体不规则分布(箭头所示); (D) 细胞核位于下锥
(箭头所示)。CI: 横沟; CH: 叶绿体; N: 细胞核。Bar=10 µm

Figure 1 Light and epifluorescence micrographs of Karlodinium veneficum (LAMB090611)
(A) Cell in surface focus, showing the whole cell shape and cingulum (arrow); (B) Cell showing the chloroplasts and nucleus
(arrows); (C) Cell showing the four chloroplasts, with irregular distribution and two in epicone and two in hypocone (arrow); (D)
Cell showing the nucleus in the hypocone (arrow). CI: Cingulum; CH: Chloroplasts; N: Nucleus. Bar=10 µm


表2 剧毒卡尔藻不同藻株的细胞大小和形态特征比较
Table 2 Cell measurements and morphological characteristics of Karlodinium veneficum strains
Strain number LAMB090611 K-0522 Plymouth 103
Cell length (µm) 11.1–18.7 (14.2±1.8, n=50) 8–18 (13.6±1.9, n=50) 9–18
Cell width (µm) 8.2–14.7 (10.8±1.5, n=50) 8–14 (11.1±1.4, n=50) 7–14
Length-to-width ratio 1.14–1.64 (1.32±0.08, n=50) 0.97–1.49 (1.23±0.1, n=50) 1.26
Cingulum displacement
(%total cell length)
28–38 23–32 <20
Sulcal extension Yes Yes Yes
Apical groove Straight, descending one-fifth
down the dorsal epicone
Straight, descending one-sev-
enth down the dorsal epicone
–
Ventral pore Pore size 0.8–1 µm, located
to the left of the apical groove
Elongated pore (1 µm) to the left
of the apical groove
–
Nucleus Large, round, located
centrally at hypocone
Large, round, located on the left
side of the hypocone or centrally
Median, indistinct except
prior to cell division
Chloroplasts 2 or 4, with equal number in
epi-and hypocone
2–4, with equal number in epi-
and hypocone, orange-brown in
color
2–8(usually four), irregular
in shape, golden brown in
color


的其它剧毒卡尔藻藻株ITS序列进行比对, 分析结果
见表3。通过比对可知, 藻株LAMB090611与GU26-
3462无碱基差异 , 相似度为100%; 与AJ557028相
比有5个碱基差异 , 6个插入 /缺失不同 , 相似度为
98.3%。而藻株AJ557027和AJ534656的ITS序列无
碱基差异 , 二者相似度为 100% 。它们与藻株
LAMB090611有6个碱基差异, 6个插入/缺失不同, 相
似度为98.1%。
2.3 系统进化关系
利用东海藻株Karlodinium veneficum (LAMB09-
0611)的ITS序列及GenBank中与它相关的其它藻株
王红霞等: 东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析 183



图2 扫描电镜下剧毒卡尔藻(LAMB090611)的细胞形态
(A) 腹面观, 箭头示细胞腹孔、横沟错位及纵沟延伸; (B) 右腹面观, 箭头示顶沟、腹孔及鞭毛; (C) 顶面观, 箭头示顶沟和腹孔; (D)
顶腹面观, 箭头示顶沟、腹孔及纵沟延伸; (E) 顶背面观, 箭头示顶沟和腹孔; (F) 背面观, 箭头示顶沟及鞭毛
SE: 纵沟延伸; VP: 腹孔; CD: 横沟错位; AG: 顶沟; F: 鞭毛。Bar=5 µm

Figure 2 Scanning electron micrographs of Karlodinium veneficum (LAMB090611)
(A) Ventral view showing the ventral pore, cingulum displacement and sulcal extention (arrows); (B) Right ventral view showing
the whole cell shape with apical groove, ventral pore and flagellum (arrows); (C) Apical view showing the apical groove and
ventral pore (arrows); (D) Apical ventral view showing the apical groove, ventral pore and sulcal extention (arrows); (E) Apical
dorsal view showing the apical groove and ventral pore (arrows); (F) Dorsal view showing the apical groove and flagellum
(arrows)
SE: Sulcal extension; VP: Ventral pore; CD: Cingulum displacement; AG: Apical groove; F: Flagellum. Bar=5 µm


表3 5株Karlodinium veneficum ITS序列比较
Table 3 An alignment of ITS sequences from 5 strains of Karlodinium veneficum
K. veneficum (LAMB090611) GTC―T TCACA―CA - - - - TCTG―G―TTGG―T―T―TCATTCAAGACATG
K. veneficum (GU263462) - - - - - - - - A C A…CA - - - - TCTG―G…TTGG…T…T…. - - - - - - - - - - - - - - -
K. veneficum (AJ557028) - - - - - - - -A C A…TAGT TCT….G…R…CT - - …C…A…TCATT - - - - - - - - - -
K. veneficum (AJ557027) - - - - - - - -A C A…TAGT TCT….T….R…CT - - …C…A…TCATT - - - - - - - - - -
K. veneficum (AJ534656) - - - - - - - -A C A…TAGT TCT….T….R…CT - - …C…A…TCATT - - - - - - - - - -
表中只列出碱基有差异和插入/缺失不同的位点。R代表兼并碱基。LAMB090611为本实验所测的K. veneficum藻株编号, GU263462、
AJ557028、AJ557027和AJ534656序列号来自GenBank。
Only the sites that differ from K. veneficum (LAMB090611) are shown. R was A or G. LAMB090611 was the species number in
this study, while GU263462, AJ557028, AJ557027 and AJ534656 were accession numbers in GenBank.
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ITS序列构建凯伦藻科(Kareniaceae)的系统发育树,
分别用邻接法、最小进化法和最大简约法构建系统发
育树, 所得结果一致。因此本文只显示用邻接法构建
的系统发育树(图3)。以Prorocentrum minimum (FJ8-
23585)为种外群, 从系统发育树上可知, 测序的东海
藻株K. veneficum (LAMB090611)与GenBank中的
K. veneficum (GU263462)、K. veneficum (AJ557-
028)、K. veneficum (AJ557027)和K. veneficum
(AJ534656)聚在一起 , 且支持率为100%。并且K.
veneficum(LAMB090611)与K. veneficum (GU263-
462)关系更近, 它们并在一起成为一个分支, 支持率
为95%。同时, K. veneficum (AJ557027)和K. ven-
eficum (AJ534656)关系密切, 二者聚在一起, 支持
率为76%。然后它们与另一藻株K. veneficum (AJ55-
7028)聚成一簇, 构成另一分支, 支持率为84%。这2
个分支最后以100%的支持率构成K. veneficum。2株
Karlodinium armiger以100%的支持率聚集在一起,
K. veneficum与K. armiger同属于Karlodinium, 故合
并在一起, 且关系要近于Takayama和Karenia。此系
统发育树符合凯伦藻科的亲缘关系。该科包括3个
属: Karlodinium、Takayama和 Karenia。并且Karl-
odinium与Takayama的亲缘关系要近于Karenia。
使用Mega4.1软件包建立系统发育分析中各藻
株间的遗传距离矩阵(表4)。从表中可看出遗传距离矩
阵与系统发育树相吻合。结果显示, K. Veneficum
(LAMB090611)与K. veneficum(GU263462)亲缘关
系最近, 遗传距离为0.000, 而与K. veneficum (AJ-
557028) 关 系 其 次 , 遗 传 距 离 为 0.007, 与 K.
veneficum (AJ557027)和K. veneficum (AJ534656)
亲缘关系较远, 遗传距离均为0.009。由遗传距离矩阵
所反映出的Karlodinium种内遗传距离差异范围为
0.000–0.009; 而与Karlodinium armiger的遗传距离
差异范围为0.149–0.151, 为属内差异。Karlodinium
与Takayama和Karenia的亲缘关系依次递减, 符合
凯伦藻科之间的亲缘关系。测序的东海藻株K.
veneficum与种外群Prorocentrum minimum亲缘关
系最远, 遗传距离达0.479。
2.4 讨论
剧毒卡尔藻分布广泛, 是沿岸水域中常见的浮游微
藻, 但由于其细胞个体偏小, 常规监测中很容易被忽
视。由它引发的有毒赤潮经常伴随着鱼类死亡事件,



图3 基于凯伦藻科不同藻株rDNA的ITS序列构建的系统发育树(标尺0.05代表核苷酸替换率)

Figure 3 Phylogenetic trees of Kareniaceae based on the ITS–5.8S rDNA sequences (0.05 was the nucleotide substitution)

王红霞等: 东海剧毒卡尔藻的形态特征及其系统进化分析 185
表4 凯伦藻科不同藻株rDNA ITS序列的Jukes-Cantor距离矩阵
Table 4 Jukes-Cantor corrected distance based on the ITS sequences of different strains of Kareniaceae
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1
2 0.000
3 0.007 0.007
4 0.009 0.009 0.002
5 0.009 0.009 0.002 0.000
6 0.149 0.151 0.149 0.151 0.151
7 0.149 0.151 0.149 0.151 0.151 0.000
8 0.234 0.225 0.229 0.231 0.231 0.238 0.238
9 0.229 0.237 0.236 0.239 0.239 0.239 0.239 0.054
10 0.385 0.389 0.383 0.380 0.380 0.388 0.388 0.381 0.385
11 0.386 0.396 0.395 0.392 0.392 0.394 0.394 0.387 0.401 0.193
12 0.464 0.453 0.444 0.447 0.447 0.473 0.473 0.439 0.422 0.464 0.479
1: K. veneficum (LAMB090611); 2: K. veneficum (GU263462); 3: K. veneficum (AJ557028); 4: K. veneficum (AJ557027); 5: K.
veneficum (AJ534656); 6: K. armiger (AJ557024); 7: K. armiger (AM184205); 8: T. pulchellum (AY764179); 9: Takayama sp.
(AM183261); 10: K. bidigitata (FJ823561); 11: K. brevis (AF352825); 12: P. minimum (FJ823585)


而产生毒素的量与藻细胞密度紧密相关, 因此藻细胞
密度可作为监测潜在致毒事件的有效指标(Adolf et
al., 2009)。剧毒卡尔藻在通常情况下细胞密度偏低,
一般为102–103 cells·mL–1, 当达到 104–105 cells·
mL–1 时会形成藻华 , 导致鱼类死亡(Deeds et al.,
2002; Kempton et al., 2002; Fensin, 2004; Goshorn
et al., 2004)。此外, K. veneficum与K. australe一样,
都是混合营养型(De Salas et al., 2005), 但是从未发
现过剧毒卡尔藻的孢囊(Bachvaroff et al., 2009)。与
凯伦藻属相比, 以往对卡尔藻属研究较少, 主要是由
于以下原因: (1) 卡尔藻属细胞个体微小, 长度大多
在20 µm以下; (2) 扫描电镜下观察卡尔藻属细胞,
由于前期处理比较困难, 不易得到理想的电镜形态。

2.4.1 细胞形态特征
分别在光学显微镜、荧光显微镜以及扫描电镜下观察
分析东海藻株LAMB090611, 可确定其为剧毒卡尔
藻, 但不同地域的藻株在形态特征上存在差别。K.
veneficum首次被Ballantine(1956)描述如下: 细胞长
度为9–18 µm, 平均值为12 µm; 宽度为8–14 µm,
平均值为10 µm; 上锥与下锥等体积, 且上锥比下锥
更尖; 细胞内有2–8个叶绿体, 最典型的为4个, 平均
分布在上下锥, 叶绿体颜色为黄褐色; 纵沟延伸, 细
胞核位于中间(Ballantine, 1956)。但可能由于当时技
术条件的限制, 上述文献未对顶沟和腹孔进行描述。
而东海藻株细胞长度为11–19 µm, 平均值为14 µm;
宽度为8–15 µm, 平均值为11 µm。相比之下, 东海藻
株细胞长宽值更大些。叶绿体为2或4个, 一般不规则
分布于细胞内。本研究结果与Ballantine(1956)对叶绿
体的描述稍有差异。

2.4.2 分子系统发育
用核糖体大亚基rDNA构建的系统进化树显示, 卡尔
藻属、凯伦藻属与达卡藻属构成一个独立的进化分支,
被命名为凯伦藻科。并且卡尔藻属与达卡藻属之间的
亲缘关系要近于凯伦藻属。此3属在细胞形态及光合
色素结构上相似, 但达卡藻属的顶沟为S形, 卡尔藻
属与凯伦藻属的顶沟则是直的。卡尔藻属与凯伦藻属
之间的区别是前者有腹孔, 而后者无腹孔。因此依据
顶沟形状所进行的分类与分子系统发育树所呈现的
亲缘关系不一致(Bergholtz et al., 2006)。
ITS序列通常作为鉴定种及亚种的分子指标, 已
有研究证实ITS序列适用于卡尔藻属种间的系统进化
分析(Garcés et al., 2006)。Bachvaroff等(2009)通过
对不同地域的18株剧毒卡尔藻的形态、毒素和ITS序
列进行分析, 得出它们属于同一种, 并且提出对于K.
veneficum的鉴定, ITS序列作为分子指标要优于毒素
类型(Bachvaroff et al., 2009)。本研究中的东海藻株
LAMB090611通过测定其ITS序列, 与GenBank中其
它序列进行比对后, 确定其为剧毒卡尔藻。而且它与
186 植物学报 46(2) 2011
K. veneficum(GU263462)亲缘关系最近, 所比对的
序列完全一致, 相似性为100%。同时在此基础上构
建了凯伦藻科的系统发育树和遗传距离矩阵, 所得结
果均表明东海藻株LAMB090611为K. veneficum。
由于K. veneficum产生的卡尔藻毒素对渔业可造
成巨大的危害, 其越来越受到关注。研究人员从形态
结构、系统进化、生理特征及毒素机理等各方面对
K.veneficum进行了深入研究。在毒素机理作用方面,
已有研究表明, 卡尔藻毒素在K. veneficum整个生长
史中作用巨大(Bachvaroff et al., 2009)。本研究对东
海藻株进行了光学形态、显微结构及分子系统进化方
面的分析, 而关于其生理特征和毒素机理等有待进一
步研究。为了减少有害赤潮对经济发展和人类健康的
危害, 有效的预防和监测工作尤为重要。利用分子探
针快速而准确地对易发海域进行赤潮藻监测, 是一种
快捷有效的方式, 将成为今后的发展方向。
致谢 澳大利亚塔斯马尼亚大学Dr. De Salas和浙江
大学陈汉民老师对扫描电镜实验给予了热情指导, 吴
月红和孟凡旭博士在分子生物学实验及藻类系统发
育分析方面提供了无私帮助, 特此一并致谢。
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188 植物学报 46(2) 2011
Morphological and Phylogenetic Analysis of Karlodinium
veneficum Isolated from the East China Sea in China
Hongxia Wang, Douding Lu*, Haiyan Huang, Xinfeng Dai, Ping Xia
Laboratory of Marine Ecosystem and Biogeochemistry, Second Institute of Oceanography, State Oceanic Administration,
Hangzhou 310012, China
Abstract Karlodinium veneficum (D. Ballantine) J. Larsen (LAMB090611), isolated from the East China Sea of Zhejiang
province, was reported for the first time in China. The strain of LAMB090611 was described on the basis of morphological
characteristics, and molecular phylogenetics. The results of this study were acquired by light microscopy, fluorescence
microscopy, scanning electron microscopy and molecular sequencing. The cells have a mean length of 14.2±1.8 µm
(range 11.1–18.7 µm) and mean width of 10.8±1.5 µm (range 8.2–14.7 µm). The size of epicone is approximately the
same as that of hypocone. The cell has a short, straight apical groove and distinct ventral pore, with usually 2 or 4
chloroplasts distributed irregularly in the cell. The sulcus extends onto the epicone. The cingulum displacement is about
28%–38% of the body length. The nucleus is in middle of the cell or in the hypocone. A high density of this species results
in harmful algal bloom. Therefore, the precise identification and detection of the causative species are important for
monitoring and mitigation of such blooms.
Key words East China Sea, Karlodinium veneficum, molecular phylogeny, morphology, scanning electron microscopy
Wang HX, Lu DD, Huang HY, Dai XF, Xia P (2011). Morphological and phylogenetic analysis of Karlodinium veneficum
isolated from the East China Sea in China. Chin Bull Bot 46, 179–188.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: doudinglu@126.com
(责任编辑: 白羽红)