全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (3): 394–404, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00394
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收稿日期: 2014-06-04; 接受日期: 2014-09-09
基金项目: 国家重点基础研究发展规划(No.2011CB809103)、国家自然科学基金创新研究群体(No.31121065)、北京林业大学杰出青年人才
培育计划(No.JC2013-2)、新世纪优秀人才计划(No.NECT-12-0785)和国家自然科学基金(No.31271433)
* 通讯作者。E-mail: linjx@ibcas.ac.cn
pH敏感型荧光蛋白及其在植物细胞生物学中的应用
薛轶群1, 宋凯1, 范路生1, 万迎朗2, 林金星1, 2 *
1中国科学院植物研究所, 北京 100093; 2北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083
摘要 pH敏感型荧光蛋白, 即pHluorin, 是荧光强度及光谱特征随环境pH值的变化而改变的一类荧光蛋白。人们通过对密
码子使用偏好和特定剪切位点的修饰, 已使pHluorin及其衍生物成功地在动物、植物和真菌细胞中正常表达, 为测量细胞内
微环境pH值的变化, 并研究活细胞内依赖或导致pH变化的生理过程提供了有力工具。该文总结了目前已报道的pH敏感型
荧光蛋白的种类及特性, 并对其在细胞生物学, 特别是植物细胞生物学中的应用进行了详细介绍。随着报告基因技术及检
测方法的不断改进, pHluorin将在植物科学领域发挥更大的作用。
关键词 胞吞, 胞吐, pH值活体测量, 分子标记, pHluorin
薛轶群, 宋凯, 范路生, 万迎朗, 林金星 (2015). pH敏感型荧光蛋白及其在植物细胞生物学中的应用. 植物学报 50, 394–404.
自Shimomura等(1962)首次从维多利亚多管水
母(Aequorea victoria)中分离出绿色荧光蛋白(green
fluorescence protein, GFP)以来, 受此启发, 科学家
们又从珊瑚虫等生物中分离出多种荧光蛋白。近20
年来, 科学家们通过定点突变等方式对这些荧光蛋白
进行了一系列改造, 从而获得了光谱性质各异和吸收
光及发射光波长范围几乎覆盖整个可见光光谱的多
种荧光蛋白变体(Shaner et al., 2004; Tsien, 2005)。
不仅如此, 研究者们还进一步通过对荧光蛋白进行功
能性改造来满足更多方面的应用需求。例如通过改造
获得了增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluo-
rescent protein, eGFP) (Yang et al., 1996)、光激活
荧 光 蛋 白 (photoactivatable fluorescent protein,
PAFP) (Lukyanov et al., 2005; 王锋等, 2010)、荧光
计时器(fluorescent timer) (Terskikh et al., 2000)和
Ca2+浓度指示剂“cameleon”(Miyawaki et al., 1997)
等。以荧光蛋白为工具的蛋白质分子标记和活细胞内
分子示踪已被广泛应用于细胞内信号转导的研究, 极
大地促进了神经生物学及细胞生物学的发展(黄国存
等, 1998; Fricker et al., 2006; 邓超等, 2011)。
本文将介绍一类 pH 敏感的荧光蛋白 , 即
pHluorin, 当它们处于不同的环境pH条件下, 激发和/
或发射光谱会发生变化, 从而可反映所在区域氢离子
浓度的改变(Miesenböck et al., 1998)。我们将从pH
敏感型荧光蛋白的原理、种类及其应用等方面进行阐
述。
1 pH敏感型荧光蛋白的种类及特性
在野生型的GFP蛋白质结构中, 发光中心由3个氨基
酸Ser65-Tyr66-Gly67经过折叠、环合和氧化等过程
形成(Wachter, 2007)。其激发光谱有2个最大吸收峰:
在395 nm的峰值下, Ser65-Tyr66-Gly67处于质子化
状态 ; 在475 nm的峰值下 , 则呈现去质子化状态
(Bizzarri et al., 2009)。发色团内质子的转移对荧光的
产生有影响, H+结合的状态是不发出荧光的, 所以这
些氨基酸残基的质子化-去质子化状态不仅决定了
GFP的性质, 而且改变了GFP对所处环境pH值的敏
感性(Kneen et al., 1998)。野生型的GFP对pH值变化
的响应并不显著(图1A), 科学家们在此基础上进行改
造, 获得了多种对pH敏感的GFP变体, 统称为pHlu-
orin。
Miesenböck等(1998)在来源于维多利亚多管水
母的绿色荧光蛋白(Aequorea victoria GFP, AvGFP)
中引入了一系列点突变, 发现突变体GFP吸收光谱
的特征发生了变化, 并受到所处环境pH值的显著影
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薛轶群等: pH 敏感型荧光蛋白及其在植物细胞生物学中的应用 395



图1 GFP及pHluorin的荧光激发光谱 (Miesenböck et al.,
1998)
(A) 野生型GFP; (B) 比率pHluorin; (C) 盈缺pHluorin

Figure 1 Fluorescence excitation spectra (Miesenböck et
al., 1998)
(A) Wild-type GFP; (B) Ratiometric pHluorin; (C) Ecliptic
pHluorin


响, 该蛋白成为首个被报道的pHluorin蛋白。此蛋白
质中202位的丝氨酸突变为组氨酸, 这个重要位点的
突变使荧光蛋白具有比率性质。pH从7.5到5.5的变化
过程中, pHluorin在395 nm下的吸光值显著降低, 而
在475 nm下的吸光值显著升高(图1B)。pHluorin的
pKa值为6.9, 当所处环境pH值介于5.4到8.4之间时
能够发出荧光信号, 此时便可利用2个最大吸收峰值
处荧光强度的比率测量pH值(表1)。故以此为代表的
一类pHluorin称为比率pHluorin (ratiometric pHluo-
rin), 其pH测量范围适用于大多数的生物亚细胞腔
室。还有一类pHluorin被称为盈缺pHluorin (ecliptic
pHluorin)。此类pHluorin由于吸光度随pH降低也呈现
降低的趋势而得名, 它在pH7.5时荧光强度最高, 随
着pH值的降低荧光逐渐减弱, pH值低于6.0时几乎完
全淬灭, 并且在475 nm下的激发峰消失(图1C)。这2
类荧光蛋白对pH响应而发生的荧光强度变化均是可
逆的 , 响应时间短于20毫秒 (Miesenböck et al.,
1998)。
由于pHluorin及其衍生物的基因序列最初源于维
多利亚多管水母的野生型绿色荧光蛋白(AvGFP)的
基因片段, 因此可以直接在动物细胞中表达。而植物
或酵母等生物中有不同的密码子使用偏好 (codon
usage bias)以及一些特定的剪切位点, 因此需要将
pHluorin进行相应的修饰才能使其在其它物种中稳定
遗传与表达(表1)。例如, 比率Venus Citrine (RaVC)
适合在曲霉菌中表达(Bagar et al., 2009), PRpH-
luorin (plant-solubility-modified ratiometric pHluorin)
则适合在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中表达(Shen
et al., 2013)。将GFP的65位丝氨酸突变成苏氨酸, 发
射光谱由于碱化而黄移, 可以避免色差导致的pH测
量错误, 这类双发射光谱GFP (dual emission GFP,
deGFP)含有2个位点突变, 即T203C和H148G或H-
148C (Hanson et al., 2002)。此外, 还有一些变体,
如E2GFP不仅有双发射峰, 而且有双激发峰(Bizzarri
et al., 2006; Arosio et al., 2007)。
然而pHluorin及其衍生物在pH4.5的酸性环境中
会快速淬灭, 这使它们的适用范围受到限制。研究者
又设计出2种方法来解决这个问题: 一种方法是使用
从橙色海笔(Ptilosarcus gurneyi)中分离出来的
Pt-GFP, 虽然这种荧光蛋白的pKa值(7.3)与pHluorin
很接近, 但是其pH响应范围更广泛, 在酸性条件中
也更加稳定(Schulte et al., 2006); 另一种方法是使
用2种pH响应范围差别很大的荧光蛋白, 通过它们之
间发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance
energy transfer, FRET)来测量pH值。例如, 对受体黄
色荧光蛋白YFP进行pH敏感性调整, 然后与增强型
青色荧光蛋白eCFP融合产生pHlameleon家族
(Esposito et al., 2008)。另外, eGFP与单体红色荧光
蛋白mRFP1的组合非常适合测量质外体的pH值
(Gjetting et al., 2012)。近期, 基于生物发光共振能量
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表1 部分pH敏感型荧光蛋白的光谱特性及pH测量范围(改编自Martinière et al., 2013a)
Table 1 Spectral character of selected pH-sensitive fluorescence proteins and their pH measurement range (adapted from
Martinière et al., 2013a)
荧光蛋白名称 类型 激发光
(nm)
发射光
(nm)
pH范围 pKa 目前应用范畴 参考文献
pHluorin 比率 395/475 510 5.4–8.4 6.9 测量动物细胞内涵体和TGN中pH值 Miesenböck et al., 1998
pHluorin2 比率 395/475 510 5.4–8.4 6.9 检测动物细胞中激素受体内吞 Mahon, 2011
RaVC 比率 395/475 510 5.4–8.4 6.9 测量曲霉菌中胞质pH值 Bagar et al., 2009
pHGFP 比率 395/475 510 5.4–8.4 6.9 测量拟南芥根中胞质pH值 Moseyko and Feldman,
2001
Ratiometric
AtpHluorin
比率 395/475 510 5.4–8.4 6.9 测量拟南芥根质外体和细胞质中pH值 Gao et al., 2004
PRpHluorin 比率 395/475 510 5.4–8.4 6.9 测量拟南芥原生质体中细胞器pH值 Shen et al., 2013
Ecliptic pHluorin 盈缺 395/477 510 6.5–8.0 7.2 检测动物细胞突触囊泡胞吐 Miesenböck et al., 1998
Ecliptic AtpHluorin 盈缺 395/477 510 6.5–8.0 7.2 测量拟南芥根质外体和细胞质中pH值 Gao et al., 2004
PEpHluorin 盈缺 395/477 510 6.5–8.0 7.2 测量拟南芥原生质体中细胞器pH值 Shen et al., 2013
Superecliptic
pHluorin
盈缺 477 510 5.5–8.5 7.2 检测动物细胞突触末端胞吞胞吐 Sankaranarayanan and
Ryan, 2001
deGFP 比率 396 460/515 6–9.0 7.3 测量动物细胞中pH值 Hanson et al., 2002
E2GFP 比率 458/488 500/560 5–8.5 6.9/7.5 测量动物细胞中pH值 Bizzarri et al., 2006;
Arosio et al., 2007
ptGFP 比率 390/475 540 3.8–8.2 7.3 测量拟南芥根质外体和细胞质中pH值 Schulte et al., 2006
pHlameleon 6 比率 458 481/533 5–7.5 5.6 基于FRET原理测量动物细胞中pH值 Esposito et al., 2008
pHusion 比率 488/458 510/600 4.5–8 5.8 基于FRET原理测量拟南芥叶肉和根
的固定细胞中质外体和胞质pH值
Gjetting et al., 2012
pHlash 比率 不适用 475/525 5.4–9 不适用 基于BRET原理测量动物细胞中胞质
pH值
Zhang et al., 2012


转移 (bioluminescence resonance energy transfer,
BRET)原理, Zhang等(2012)研发出一种新的pH生物指
示剂, 称为pHlash。该指示剂将荧光素酶作为供体, 融
合pH敏感的Venus作为受体, 显著提高了信噪比, 使其
在整个组织或器官水平的研究中具有很强的实用性。
2 pH敏感荧光蛋白在酵母和动物细胞
生物学研究中的应用
2.1 活细胞中pH值的动态测量
将pHluorin与特定组织器官定位的蛋白融合并在活细
胞中表达, 可以对不同亚细胞结构内部的pH值进行
动态测量, 从而研究细胞器(如细胞质(Karagiannis
and Young, 2001)、过氧化物酶体 (peroxisome)
(Jankowski et al., 2001)、内涵体(endosome)和反式
高尔基体网(trans-Golgi network, TGN) (Machen et
al., 2003))中pH环境受生理条件或生长过程影响的规
律。Orij等(2009)利用比率pHluorin在酵母细胞质和线
粒体基质中检测了酵母细胞质的缓冲能力以及细胞
质与线粒体pH对养分有效性、呼吸链活性、环境pH
变化及山梨酸刺激的响应。研究结果表明, 葡萄糖培
养的酵母在指数生长期, 其胞质和线粒体的pH值相
对恒定(分别为7.2和7.5), 但是会受到碳源和呼吸链
抑制剂的调控。在山梨酸刺激或葡萄糖饥饿时, 细胞
内pH值会降低, 细胞生长停滞; 而山梨酸刺激消失
或加入葡萄糖后, 随着胞内pH值的恢复, 细胞生长
状态也会恢复。
2.2 胞吞胞吐的动态检测及速率测量
在神经生物学研究中, 也常使用pHluorin来监测突触
囊泡胞吞胞吐的过程(Miesenböck et al., 1998; Ash-
by et al., 2004)。pHluorin与囊泡相关膜蛋白(vesicle-
薛轶群等: pH 敏感型荧光蛋白及其在植物细胞生物学中的应用 397

associated membrane protein, VAMP)/小突触囊泡
蛋白(synaptobrevin)位于囊泡腔内的C端相连, 实现
对囊泡膜的标记 , 这种融合蛋白称为synapto-pH-
luorin (简称SpH)。由于囊泡腔内是酸性环境 ,
pHluorin在囊泡腔会显示出较弱甚至难以检测的荧光
信号。在胞吐时, 囊泡与质膜融合, 囊泡腔内的pH值
显著升高, pHluorin的发色团将因失去1个质子而发
出较强荧光, 这样便可通过观察荧光强度的变化清晰
地观察胞吐过程。而发生胞吞时, 囊泡腔内进行重酸
化(reacidification), pHluorin会因重新进入酸性环境
而荧光大幅度减弱甚至消失。因此, 可把pHluorin的
荧光从产生到消失的时间记作胞吐到胞吞所经历的
时间。利用SpH的比率特性可以实现对pH值变化进行
持续和精确的分析, 避免了细胞移动、焦平面改变或
光漂白的干扰。盈缺SpH在低pH值的静息状态下发出
的荧光很弱, 因此更容易检测到胞吐时荧光信号的增
强。这种高灵敏度使单个囊泡的胞吐事件更易于从多
个细胞中区分出来(Miesenböck et al., 1998; Ashby
et al., 2004)。
Sankaranarayanan和Ryan (2000)利用SpH来
研究海马神经元突触前末梢的胞吐动力学和囊泡循
环, 证明了pHluorin可以用于监测蛋白胞吐后在细胞
膜上随着磷脂双分子层进行的侧向移动。在此基础上,
后续研究使用SpH分析了突触前分泌囊泡胞吞过程
中的动力学和钙依赖性 (Sankaranarayanan and
Ryan, 2001; Li and Murthy, 2001)。此外 , 盈缺
pHluorin还被用于MIN6 b细胞系的膜融合动力学研
究。Tsuboi和Rutter (2003)通过全内反射荧光显微镜
(total internal reflection fluorescence microscopy,
TIRFM)观察了SpH。Ohara-Imaizumi等(2002)通过
对一种选择性囊泡膜蛋白phogrin与pHluorin融合蛋
白的共聚焦成像观察, 探讨了致密核心囊泡(dense
core vesicle)融合事件的时间进程及机制。
SpH还可用来检测神经细胞胞吞胞吐的速率。为
了便于单独研究胞吐过程, 引入一种膜透的ATP酶抑
制剂bafilomycin (Baf), 该抑制剂可使囊泡在胞吞过
程中不被重酸化 , 这样囊泡中环境就始终呈碱性 ,
pHluorin的荧光信号随时间的变化就可以作为胞吐过
程的单纯量度。不使用药物时, pHluorin的荧光信号指
示的是胞吞胞吐的平衡状态, 通过二者比较可以得到
反映胞吞过程的曲线, 进而计算出胞吐和胞吞的速率
(Nicholson-Tomishima and Ryan, 2004; Kononenko
et al., 2013)。Nicholson-Tomishima和Ryan (2004)
利用此方法, 发现Syt1敲除的细胞中胞吐-胞吞的平
衡被扰乱, 说明Syt1在突触囊泡的内吞补偿中起重要
作用。Kononenko等(2013)利用类似方法证明了石蛋
白Stn2是神经突触囊泡组成所必需的, 但与维持其
循环的速度无关。
胞吞胞吐是细胞中发生的非常快速的事件。若将
pH敏感与不敏感的荧光蛋白均定位到囊泡腔中, 可
以观察到pHluorin的荧光强度随pH值的变化而变化;
而pH不敏感的荧光蛋白会稳定发光, 通过比较二者
荧光强度的变化, 可以将胞吞胞吐事件与荧光蛋白光
漂白或降解引起的荧光淬灭区分开。周围等(2007)用
囊泡乙酰胆碱转运体(vesicular acetylcholine trans-
porter, VAChT)特异标记类突触小囊泡(vesicular mo-
noamine transporters, VMATS), 同时使用VAMP2-
pHluorin记录膜融合事件, 并运用TIRFM技术对神经
胞吐囊泡的融合模式进行了研究。通过双通道拍摄,
经对比发现囊泡融合主要存在3种模式, 即完全融合
(full fusion)、部分融合即离开(kiss and run)和部分融
合且停留(kiss and stay), 其中部分融合即离开的模式
所占比例最大, 同时测得了单个囊泡在膜上的停留时
间约为3秒。此外, Hanna等(2009)对人类胰岛β细胞中
囊泡融合模式的研究表明, 在高K+状态下, 部分融合
即离开模式所占的比例会明显增加。在酵母中, 将甲
硫氨酸酶Mup1分别连上pHluorin和GFP标签, 在静息
状态下, Mup1停留在细胞表面, 检测到pHluorin与
GFP的荧光强度变化没有明显差异; 在甲硫氨酸处理
下, Mup1发生内吞而进入囊泡, Mup1-pHluorin荧光强
度降低了80%。由于GFP标签蛋白在液泡中会被降解,
其荧光强度也会降低, 但降低程度远小于Mup1-pH-
luorin, 通过比较它们荧光变化的差别可以对胞吞进
行定量分析(Prosser et al., 2010)。
2.3 细胞质膜蛋白的标记
膜蛋白合成后到达细胞膜表面的过程中需要经过内
质网、高尔基体及TGN等细胞器的修饰与输送, 这一
过程与一系列的囊泡出芽和融合相关 (Lippincott-
Schwartz et al., 2000)。对跨膜蛋白而言, 其膜外结
构域在分泌过程中都定位在囊泡腔内部, 而在随囊泡
运输和融合上膜的过程中, 会被翻转到膜外侧, 暴露
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在pH值较高的环境中。因此, 如果将pHluorin连接于
目标蛋白不同的结构域, 就能通过荧光强度的变化区
分蛋白是位于细胞膜上还是细胞内部(Ashby et al.,
2004)。例如, 突触后膜上AMPA受体(谷氨酸受体的
一个亚型)的传递和招募对维持神经细胞的功能起着
重要作用, 特别是突触后膜上AMPA受体的快速循环
会涉及突触传递的效率 (Malinow and Malenka,
2002)。AMPA受体亚基GluR1-4的结构决定了AMPA
受体在位于突触后膜上时N-端部分在细胞外, C-端部
分在细胞内, 如果将盈缺pHluorin连接在其N-端, 就
可以将细胞膜上的AMPA受体与位于细胞内的受体
区分开(Ashby et al., 2004)。
3 pH敏感荧光蛋白在植物细胞生物学
研究中的应用
过去, 常通过pH敏感的荧光染料标记等传统方法来
实现对活体植物细胞内pH值的实时测量。例如, 葡聚
糖共轭形式的异硫氰酸荧光素(fluorescein isothio-
cyanate, FITC) (Hoffmann and Kosegarten, 1995)
或俄勒冈绿(Oregon Green) (Gehring et al., 1997)可
用于检测质外体的pH值; 2, 7-二-(2-羧乙基)-5(6)-羧
基荧光素(BCECF)和半萘酚罗丹荧(SNARF)可用于
测量胞质和液泡中的pH值(Gonugunta et al., 2008;
Krebs et al., 2010)。这些染料的应用为荧光检测活体
植物pH值提供了方便, 并可实时检测细胞内pH的动
态分布。但作为化学染料, 它们也存在很多难以避免
的问题, 如膜通透性差、标记区域特异性不足以及对
细胞毒性较大等(Shen et al., 2013)。近年来, 量子点
作为一种新型的荧光标记物已被广泛应用于生物学
研究中(李晓娟等, 2009)。当介质pH发生改变时, 量
子点的荧光强度也会随着发生变化。借助该特性, 量
子点也可以作为pH敏感的荧光探针来使用(Jin et al.,
2010)。然而, 量子点仍然难以顺利通过由植物细胞
壁与细胞膜构成的屏障, 进入完整的植物细胞内部。
采用遗传编码的pHluorin可以很好的避免上述方法所
存在的问题, 这种荧光标记方法也在植物细胞生物学
研究中取得了较大的应用进展。
3.1 质外体中pH值的测量
植物中细胞质膜上的质子泵属于P型ATP酶, 质子从
质膜扩散到质外体的速度会受限制。利用弱酸内流估
测pH值的方法, 发现质膜附近不流动水层(unstirred
aqueous layers)的局部pH比其外侧液体环境中要低
很多(Sentenac and Grignon, 1987; Grignon and
Sentenac, 1991)。Thibaud等(1988)用同样的方法研
究根部外界pH与跨膜运输的关系, 证实了膜表面的
pH值存在稳定差异。这些研究结果表明, pH的变化对
细胞膜势能(membrane energization)具有很大的贡
献, 许多生理过程都可能与这个因素有关, 例如硝酸
化、磷酸化或K+运输中的动力学和热力学 , HCO3–的
影响, 营养元素的转运速率, 以及细胞表面离子的减
少等 (Thibaud et al., 1988; Toulon et al., 1989,
1992)。
目前, 已经报道的测量质外体pH值的方法有质
子选择性微电极(proton-selective micro-electrodes)
(Felle, 1998)、 非渗透性pH敏感的染料(Taylor et al.,
1996; Monshausen et al., 2011)以及收集质外体流
(Mühling and Sattelmacher, 1995) 3种。然而, 这些
方法测量到的pH值可能与临近质膜的局部pH存在差
异, 而后者才是离子运输时感受到的实时pH (Mar-
tinière et al., 2013b)。此外, 质外体的不均一性也为
pH值的测量带来了难度。在根的皮层和内皮层细胞
中, 质外体是连续的, 成为减缓质子向外部溶液迁移
扩散的屏障, 使得质子传输的速率和方向存在差异。
在根尖不同功能区域, 如生长点、伸长区和成熟区的
表面pH值都存在纵向不均一性 (Martinière et al.,
2013b)。因此, 在植物细胞中, 特别是完整植物体中
关于膜电位和运输活力方面的研究甚少, 而可遗传编
码的pH探针为根结构与功能的研究领域开启了新视
角。Moseyko和Feldman (2001)将比率pHluorin与
soluble-modified GFP (smGFP)结合, 首次报道了适
用于拟南芥和烟草 (Nicotiana tabacum)的pHGFP,
证明了它能够在植物体内表达, 其荧光光谱依然保持
pH值敏感性, 并且能够快速指示外界环境引发的胞
质内pH值的变化。随后, Gao等(2004)也报道了可以
在拟南芥中稳定表达的比率AtpHluorin和盈缺AtpH-
luorin, 紧接着, 他们从橙色海笔中分离并改造出了
一种测量范围更宽且在酸性环境中稳定性更好的
ptGFP (Schulte et al., 2006)。利用这些荧光蛋白, 他
们测量了拟南芥根系在受到非生物胁迫时质外体和
细胞质中pH的变化(Gao et al., 2004; Schulte et al.,
薛轶群等: pH 敏感型荧光蛋白及其在植物细胞生物学中的应用 399

2006)。当用100 mmol·L–1 NaCl处理时, 根部细胞质
外体呈偏碱性, 细胞质呈偏酸性, 这些变化可能是质
膜上SOS1 (Salt-Overly-Sensitive 1)响应盐胁迫而调
控Na+/H+反向运输活性的一些特异活动引起的
(Quintero et al., 2011)。上述研究证明了pH敏感型荧
光蛋白在植物中的表达可以帮助快速探明根结构与
功能的关系, 以及膜势能、离子运输和植物适应环境
胁迫的规律。
3.2 细胞壁pH与植物的生长发育
细胞控制质外体pH的能力同样在植物生长和发育中
起重要作用。根据酸生长理论, 较低的pH能使细胞壁
松弛, 从而为细胞伸长提供空间(Rayle and Cleland,
1992)。酸生长理论可以概括为, 生长素刺激细胞质
膜上的质子泵ATP酶释放质子, 引起细胞壁酸化, 细
胞壁松弛蛋白被激活, 细胞壁微纤维松弛, 细胞伸
长。通常, 根部伸长区质外体比完全分化区的质外体
更偏酸性(Staal et al., 2011)。Monshausen等(2011)
利用pH敏感型荧光蛋白进行标记, 经检测发现根表
面pH存在酸化和碱化高度动态交替的过程, 这一结
果支持了表皮上会发生质子内流的结论。用生长素处
理根尖会使伸长区细胞质外体的pH增加0.5–0.8 (Gj-
etting et al., 2012), 这可能与根尖细胞壁的周期性碱
化有关(Monshausen et al., 2011)。
3.3 细胞器中pH的测量及蛋白定位
随着蛋白定位技术的发展, 适当的定位信号可以将可
遗传编码的pHluorin定位到各种不同的细胞膜或腔室
中。此方法不仅可以用于哺乳动物细胞, 而且已在植
物细胞(如拟南芥原生质体、烟草叶片表皮细胞和拟
南芥根尖细胞)中得到应用(Martinière et al., 2013a;
Shen et al., 2013)。这些研究直接揭示了内膜系统的
pH环境, 其中内质网中的pH值最高, 液泡中的pH值
最低。然而, 不同植物种类相应腔室的pH有差异(细
胞质、内质网和液泡), 这些差异可能是所用系统不同
(完整细胞还是原生质体)或生长条件不同造成的。
Shen等(2013)通过特定的点突变将pHGFP进一步修
饰 , 并将蛋白的稳定性和亮度进行了改进 , 得到
plant-solubility-modified ecliptic pHluorin (PepHluo-
rin)和plant-solubility-modified ratiometric pHluorin
(PRpHluorin), 并且把它们定位到拟南芥原生质体的
特定细胞器 , 检测到过氧化物酶体、线粒体基质
(mitochondrial matrix)及质体(plastid)等特定位置的
pH值。另外, 通过对拟南芥与哺乳动物细胞中细胞器
的pH进行比较, 发现拟南芥中多数细胞器的pH值与
哺乳动物细胞相似, 但也有一些细胞器(例如高尔基
体、TGN和过氧化物酶体)的pH值与哺乳动物细胞差
别较大。
鉴于多数定位在内膜系统腔室的标记物会在至
少2种细胞器中循环, 所以至今仍无法将pHluorin精
确并特异地定位到TGN、液泡前体(prevacuolar comp-
artment, PVC)或晚期PVC (late PVC)中。目前, 借助
液泡分选受体(vacuolar sorting receptor, VSR)突变型
材料, 可以部分解决定位的问题。Y165A和IMAA是2
种VSR点突变型材料, 不同的点突变会造成蛋白质定
位发生改变, Y165A材料中VSR会停留在TGN中, 而
IMAA材料中VSR会在晚期PVC中短期累积 (Saint-
Jean et al., 2010; Martinière et al., 2013b)。将这2种蛋
白分别与pHluorin融合, 并追踪荧光信号, 就可以把
TGN和PVC区分开, 并且能够分别检测到这2个区域
的pH值(Martinière et al., 2013b; Shen et al., 2013)。
通常, VSR标记腔室的pH值介于反式高尔基体
(trans-Golgi)与液泡(vacuole)的pH值中间, 然而, 活
体实验测量到的结果显示, TGN (pH值约为6)比PVC
(pH值约为6.8)和晚期PVC (pH值约为7.1)的pH值更
低, 其原因可能是TGN膜上定位的V型ATP酶会泵入
质子(Martinière et al., 2013b)。确实, VHA-a1 (vac-
uolar proton ATPase a1)蛋白会优先在TGN中累积
(Dettmer et al., 2006), 在多泡体(Robinson et al.,
2012)或PVC (Monshausen et al., 2011)中未检测
到。根据质子漏模型, 当V型ATP酶使腔室酸化时, 逆
向运输蛋白会参与排出质子(Demaurex, 2002)。因
此, 在去往液泡的途中会经过腔室, VHA-a1和质子
逆向运输蛋白的分布对质子平衡和蛋白质分选起主
导作用。Bassil等(2011)的研究发现在植物内涵体中,
Na+/H+逆向运输蛋白NHX5和NHX6参与质子的外排,
在nhx5 nhx6双突变体拟南芥中可溶性液泡标记物会
错误定位。另外 , VHA-a1和Na+/H+逆向运输蛋白
NHX5/6的活性会影响TGN和PVC的pH值(Mühling
and Sattelmacher, 1995)。
VSR调控的液泡分选模型表明, PVC中的酸化会
引起受体释放配体 , 而实验测得PVC的pH环境比
400 植物学报 50(3) 2015

TGN更偏碱性, 这似乎有些矛盾(Martinière et al.,
2013b)。事实上, 在体外实验中, VSR与配体的结合
曲线呈钟形, 最佳pH值是6 (Kirsch et al., 1994), 该
值与TGN中测得的pH值相符(Shen et al., 2013), 表
明配体与VSR最适合在TGN中结合, 在偏酸或偏碱
性的环境中, 结合程度都会显著降低。此外, 使用比
率pHluorin测量内膜系统腔室中pH值的研究表明
PVC内VSR释放配体的事件是由碱性(不是酸性)环境
引发的(Martinière et al., 2013a)。当然, 这些研究并
没有把TGN或PVC中的其它环境因素考虑在内, 比
如Ca2+浓度也能够调控配体与VSR家族成员的结合,
VSR介导的运输模型还需要进一步完善(Robinson
and Pimpl, 2014)。
4 展望
质子流动和pH调控在细胞活动中起着重要作用, 因
此可遗传编码的pH报告系统对于快速及非损伤地指示
细胞内pH值变化提供了很大帮助, 它们将为细胞区室
化、蛋白运输、酸性生长或离子扩散等研究提供有价值
的数据, 有着十分广阔的应用前景。从Miesenböck等
(1998)首先报道了pHluorin的特性以后, 盈缺pHluorin
作为胞吞胞吐指示剂已经用于很多研究中, 然而, 在
活体植物细胞中检测胞吞胞吐事件的研究还不多见。近
期, 可变角全内反射荧光显微术(variable-angle total
internal reflection fluorescence, VA-TIRFM)已成功用
于活体植物荧光标记蛋白的单分子检测和追踪(Wan et
al., 2011; Wang et al., 2013)。选择pHluorin作为蛋白
标记方式并将其与先进的成像技术相结合, 有望实现
植物胞吞胞吐过程在时空上的可视化, 为植物囊泡的
动态转运过程及机制研究作出贡献。
细胞质膜上存在的蛋白和脂类组分对质子扩散
有重要影响, 并且在质子泵附近的局部浓度较高, 从
而使膜表面不同位置的pH值不尽相同。所以需要改进
pH敏感型荧光蛋白反馈pH信息的精确度, 以满足细
胞微环境研究的需求。在应用pH敏感型荧光蛋白时,
要注意根据密码子偏好性和物种差异选择合适的种
类, 进行pH值测量之前还要对所选pH敏感型荧光蛋
白进行校正, 以确定其在表达后对所处环境pH值变
化能够正确响应(Arosio et al., 2007; Martinière et
al., 2013a, 2013b)。此外, 目前所报道的pH敏感型荧
光蛋白的激发光和发射光波长都与GFP相似, 研发
不同光谱特征且仍对环境pH敏感的变体, 将有助于
对蛋白质进行双色甚至多色标记, 追踪它们导致(或
依赖) pH变化的生理过程, 以使pH敏感型荧光蛋白
在细胞生物学领域发挥更大的作用。
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404 植物学报 50(3) 2015

pH-sensitive Fluorescent Proteins and Their Applications
in Plant Cell Biology
Yiqun Xue1, Kai Song1, Lusheng Fan1, Yinglang Wan2, Jinxing Lin1, 2*
1Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
2College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Abstract pHluorin is a pH-sensitive variant of green fluorescent protein; its fluorescence signals display a strong pH
dependence. Since the codon usage was optimized and the site of aberrant splicing was removed, pHluorin and its de-
rivatives have been successfully expressed and used in animal, plant and fungi cells. These pH sensors have helped
shed light on measure of the difference in pH of cellular microenvironment and many cell functions for which intracellular
pH is an important modulator. Here, we review the characteristics of known pHluorins and their applications in cell biology,
particularly plant cell biology. With the improvements in pHluorins by genetic engineering and the advancing in detection
technology, the future for pHluorins in plant science is exciting.
Key words endocytosis, exocytosis, in vivo pH measurement, molecular labelling, pHluorin
Xue YQ, Song K, Fan LS, Wan YL, Lin JX (2015). pH-sensitive fluorescent proteins and their applications in plant cell
biology. Chin Bull Bot 50, 394–404.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: linjx@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)