全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (6): 682–691, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00682
——————————————————
收稿日期: 2013-09-24; 接受日期: 2014-06-27
基金项目: 国家自然科学基金(No.31100218, No.31000307)、教育部留学回国人员科研启动基金(No.201023)、鲁东大学博士启动基金
(2008)、山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(No.BS2010NY004)和山东省自然科学基金(No.ZR2010CM056)
* 通讯作者。E-mail: juanzh74@163.com
南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性
魏丽娟1, 张娟2*, 王蕾1, 刘林德1, 赵同欣1, 黄清荣1
1鲁东大学生命科学学院, 烟台 264025; 2鲁东大学农学院, 烟台 264025
摘要 利用兼并性引物和RACE方法 , 在南蛇藤 (Celastrus orbiculatus)中克隆了1个脯氨酸脱氢酶基因 , 并命名为
NstProDH1。序列比对显示该基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)的脯氨酸脱氢酶(ProDH)具有
很高的同源性。酶学特性分析表明该酶具有脯氨酸脱氢酶的活性。比较南蛇藤不同器官该基因的转录表达模式与脯氨酸脱
氢酶活性, 结果显示两者之间没有明显的关联, 说明该基因的表达受到转录和翻译水平的双重调控, 同时也暗示南蛇藤中
还存在其它的脯氨酸脱氢酶基因。NstProDH1基因的表达模式与野生型拟南芥中的ProDH1具有相似性 , 因此推测
NstProDH1基因可能在功能上与拟南芥ProDH1基因相似。
关键词 南蛇藤, NstProDH1, 脯氨酸脱氢酶
魏丽娟, 张娟, 王蕾, 刘林德, 赵同欣, 黄清荣 (2014). 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性. 植物学报 49, 682
–691.
脯氨酸(Pro)是一种广泛分布在动植物、真菌和藻
类中的渗透保护物质(沈义国等 , 2002; 全先庆等 ,
2007)。目前大量的研究表明, 在逆境胁迫下, 植物体
内的脯氨酸含量快速增加, 积累的脯氨酸可以防止渗
透胁迫对植物细胞的伤害, 还可以螯合胁迫产生的活
性氧, 清除氧自由基, 有效地维持细胞膜以及细胞中
蛋白质和核酸的稳定(Hare and Cress, 1997; Phang
et al., 2008; Szabados and Savoure, 2010)。胁迫解
除后, 脯氨酸降解产生大量的能量, 以快速补充植物
对碳、氮和能量的需求(Delauney and Verma, 1993;
Hare and Cress, 1997; Matysik et al., 2002; Ashraf
and Harris, 2004; 王若梦和董宽虎, 2012)。另外, 脯
氨酸在植物的生长发育中也发挥着重要作用, 游离脯
氨酸含量与植物的发育阶段和器官类型有密切的关
系(Verbruggen et al., 1993; Chiang and Dandekar,
1995; Verbruggen and Hermans, 2008; 彭婧等 ,
2010)。
植物体内脯氨酸合成代谢途径中的限速酶有2
种。其一是吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS), 该酶能够催
化谷氨酸 , 产生谷氨酸 -γ-半醛 (glutamate-γ-semi-
aldehyde, GSA), 在此过程中需要NADPH和ATP的
参与 , 然后GSA自发形成环状的吡咯啉 -5-羧酸
(pyrroline-5-carboxylate, P5C), 最后形成脯氨酸。另
一个限速酶是负责脯氨酸降解的脯氨酸脱氢酶
(ProDH), 脯氨酸从细胞质运输到线粒体后, 在脯氨
酸脱氢酶和P5C脱氢酶的作用下被催化生成谷氨酸
(Strizhov et al., 1997; Székely et al., 2008; Mattioli
et al., 2009)。目前, 已经在多种植物中克隆到脯氨酸
脱氢酶基因(Kiyosue et al., 1996; Nakashima et al.,
1998; Deuschle et al., 2004; Miller et al., 2005; Ri-
barits et al., 2007; Funck et al., 2010; 张娜等 ,
2011)。其中研究得较为深入的是模式植物拟南芥
(Arabidopsis thaliana)。在拟南芥中已发现2种脯氨酸
脱氢酶基因, 分别命名为ProDH1和ProDH2。研究表
明拟南芥中的2种脯氨酸脱氢酶基因具有不同的器官
特异性。在野生型拟南芥的根、成熟叶、花蕾、花和
荚果中均检测到ProDH1的表达, 其中在根和花蕾中
表达量最高(Deuschle et al., 2004); 而ProDH2只在
根、成熟叶和花中表达, 并且在根和成熟叶中表达量
相对较高, 在花蕾中只检测到ProDH2的微弱表达。
在开花过程中ProDH1先于ProDH2达到表达高峰。拟
南芥的2个脯氨酸脱氢酶基因在空间表达模式上存在
·研究报告·
魏丽娟等: 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性 683

着显著差异 , 而NaCl处理只引起ProDH1的下调
(Funck et al., 2010)。同样, 在脱水处理时, 2个烟草
(Nicotiana tabacum)的ProDH表现出不同的调控方
式; 而拟南芥的2个ProDH是共调控的, 仅在表达水
平上表现出不同。进一步的研究也表明烟草的2个同
工酶几乎没有发现共表达现象。这表明烟草的2个脯
氨酸脱氢酶基因在生理作用上存在部分差异(Ribarits
et al., 2007)。在盐或干旱胁迫下, 烟草ProDH2受诱
导表达, 暗示着在该条件下对脯氨酸降解的特殊需
要, 而ProDH1基因的下调能够使脯氨酸大量积累,
以抵抗逆境。对拟南芥和烟草ProDH的研究揭示了
ProDH的表达存在物种特异性(Ribarits et al., 2007)。
有报道显示P5CS也在不同植物种类中有不同的表达
模式(Rayapati et al., 1989; Mattioli et al., 2009)。
南蛇藤(Celastrus orbiculatus)为卫矛科南蛇藤
属落叶藤本植物, 是一种重要的中药材植物, 其根、
茎、叶均可入药。南蛇藤多野生于山地沟谷及林缘灌
木丛中, 对土壤要求不严, 抗寒耐旱, 具有很好的抗
逆性。但是目前对南蛇藤的研究仅停留在化学药物研
究以及栽培技术上, 而在分子水平上对南蛇藤的研究
国内外尚未见报道, 这大大影响了对南蛇藤的开发利
用(张舰等, 2006; 张树俭和韩明福, 2009; 徐学敏,
2011; 张华等 , 2011)。本实验利用兼并性引物和
RACE方法, 在南蛇藤中克隆了1个脯氨酸脱氢酶基
因, 序列比对显示该基因与拟南芥和烟草的脯氨酸脱
氢酶基因具有很高的同源性。酶学特性分析表明该酶
是南蛇藤的脯氨酸脱氢酶。该基因在南蛇藤的不同器
官中存在表达特异性。依据本研究结果推测南蛇藤
脯氨酸脱氢酶基因在植物的生殖发育中发挥着重要
作用。
1 材料与方法
1.1 南蛇藤总RNA的提取及cDNA第1链的合成
实验材料南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb)来源
于山东省烟台市芝罘区蓁山林中 (37°31′N, 121°
23′E)。植物材料总RNA的提取参照天根公司总RNA
抽提试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, Cat.
No.74903)使用说明书进行。取3 μg样品总RNA进行
cDNA第1链的合成, 其中包括样品中DNA的去除。具
体操作步骤参照宝生物公司逆转录试剂盒使用说明
书进行(宝生物, Cat. No.DRR047S)。
1.2 目的基因的RACE克隆
采用VectorNTI软件对4种不同来源的脯氨酸脱氢酶
基因 (拟南芥的AtProDH1(At3g30775)和AtProDH2
(At5g38710); 烟草的NtPDH1(AY639145)和NtPD-
H2(AY639146))进行同源比对分析。在保守区段设计
兼并性引物, 引物序列见表1。利用兼并性引物, 以
cDNA第1链为模板扩增南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的
片段。获得的PCR片段与T载体连接后, 送华大基因
公司测序。同时将该基因命名为NstProDH1。所获得
的部分基因序列用于RACE引物的设计。引物序列信
息见表1。目的基因的RACE克隆参照Clontech试剂盒
(Cat.No.634923)说明书进行。将5′-RACE和3′-RACE
得到的目的条带与T载体连接, 验证大小后送华大基
因公司测序。拼接已知序列和测序结果得到的
NstProDH1基因序列。根据拼接序列设计引物, 验证
拼接结果。正、反向引物见表1。
1.3 NstProDH1基因表达模式的荧光定量PCR分析
植物材料的总RNA去除基因组DNA后, 被反转录形
成cDNA。荧光定量PCR采用天根公司的试剂盒(Real-
MasterMix, SYBR Green, FP202)。以南蛇藤Tubulin
基因作为内参基因。扩增引物见表1。
1.4 亚细胞定位载体的构建及洋葱表皮细胞的转化
以带有NstProDH1基因正确开放阅读框(ORF)的T载
体为模板, PCR扩增的同时在片段的两端加入KpnI和
XbaI 2个酶切位点。设计引物时, 反向引物去除3个终
止密码子, 同时注意读码框是否正确。PCR所用引物
见表1。回收的PCR片段与T载体相连, 酶切和测序正
确后用于构建亚细胞定位载体。利用KpnI和XbaI双酶
切 , 同时酶切pCAMBIA1300空载体和含有NstPro-
DH1的T载体, 回收的酶切片段用T4 DNA连接酶连
接后, 构建pCAM1300-NstProDH1-GFP荧光表达载
体。转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α, 提取质
粒。经酶切鉴定及测序均验证正确。
制备根癌农杆菌GV3101的感受态细胞(罗雯和
刘阳, 2006), 利用冻融法将pCAM1300-NstProDH1-
GFP荧光表达载体质粒转化农杆菌感受态细胞, 同
时转化pCAM300-GFP空载体作为阳性对照。经PCR
684 植物学报 49(6) 2014

表1 PCR反应引物
Table 1 Primers used in this study


验证正确后进行亚细胞定位。分别挑取携带有pCA-
M300-GFP空载体和pCAM1300-NstProDH1-GFP质
粒的单克隆农杆菌在液体YEP培养基(另加50 mg·L–1
利福平, 50 mg·L–1卡纳霉素, 20 μg·L–1乙酰丁香酮)中
28°C过夜培养。然后将农杆菌重悬于附加10 mmol·
L–1MgCl2和100 μmol·L–1乙酰丁香酮的YEP液体培养
基中。将洋葱内表皮细胞于28°C在固体MS培养基上
培养24小时后, 与农杆菌C58C1共培养30分钟, 再
移至固体MS培养基培养2天(25°C, 16小时光照/8小
时黑暗)。在荧光显微镜(BX51, Model 7.3, Olympus,
Japan)下观察洋葱内表皮细胞。
1.5 原核表达载体的构建以及蛋白纯化
设计带有特定酶切位点的引物扩增NstProDH1, 回
收的PCR片段连接T载体, 验证正确后用于构建原核
表达载体。利用BamHI和XhoI同时双酶切pET32a空
载体和含有NstProDH1的T载体。酶切片段回收后用
T4 DNA连接酶连接, 连接产物转化大肠杆菌DH5α,
挑取相应的单克隆, 提取质粒进行酶切验证, 命名为
pET32a-NstProDH1。验证正确后的载体利用热击法
转化大肠杆菌表达菌株BL21。
挑取正确的目的菌落于37°C过夜培养, 按1:100
体积比接种于LB液体培养基中, 振摇至A600=0.5, 然
后加入终浓度为0.5 mmol·L–1的IPTG 20°C诱导16小
时。取少量细菌裂解液进行SDS-PAGE检测。
离心收集表达细菌的培养物, 弃上清, 用裂解缓
冲液(50 mmol·L–1Tris-HCl(pH8.0), 0.25 mol·L–1 Na-
Cl, 1 mmol·L–1DTT, 1 mmol·L–1EDTA, 使用前加入
终浓度为0.25 mmol·L–1PMSF)重悬, 超声破碎, 4°C
下13 000 ×g离心10分钟。取上清, 室温下, 经Ni-
NTA Agrose层析柱, 去除杂蛋白, 收集目的蛋白, 于
4°C保存。并取少量纯化蛋白进行SDS-PAGE检测。
1.6 南蛇藤ProDH酶活鉴定及脯氨酸含量测定
植物组织器官中ProDH的提取参照赵福庚等(2002)
的方法。分别取南蛇藤幼叶、成熟叶、茎、花和花蕾
组织各1 g, 液氮充分研磨后加入5 mL提取缓冲液
(0.1 mol·L–1Na2HPO4/KH2PO4, pH7.8, 1 mmol·L–1
EDTA, 10 mmol·L–1β-巯基乙醇), 匀浆液于4 000 ×g
离心 10分钟。取上清加入终浓度为0.15%Triton
X-100, 冰浴30分钟后, 10 000 ×g离心30分钟, 取上
清液待用。酶活性测定的反应混合液中包含1.6 mL
0.15 mmol·L–1Na2CO3-NaHCO3(pH10.3)缓冲液, 0.2
mL0.1 mol·L–1L-脯氨酸溶液, 0.2 mL0.9 mmol·L–1
2,6-二氯酚靛酚, 30°C保温5分钟后, 加入0.5 mL(0.8
mg蛋白·mL–1)酶提取液, 充分混匀后加入新配制的9
mg·mL–1PMS试剂0.2 mL, 摇匀后立即用分光光度计
在600 nm下检测光密度变化, 以0.01ΔA600·g–1FW·
Primer name Primer sequence Use
NstPdh-JBF TTTTAYGAMCATTTYTGYGCYGG Degenerate primers for partial fragment of NstProDH1
NstPdh-JBR CTASACATDTAAGCMCCYCTCACCA
NstPdh5GSP1 TGCGCGAATTCGAGCCTCCCATTCCCTC Specific and anchored primers for 5′RACE
NstPdh5NGSP1 TTGTGGATGGGAGAGTCGAACCCCAGTG
NstPdh3GSP1 TGTCTAAACCAGAACCATTGACACCAC Specific and anchored primers for 3′RACE
NstPdh3NGSP1 ACTCGTGGTTGATGCAGAGGATACAC
NstPDH-F ATGGCCACCCGTGTAATCCCACC Amplifying wild type NstProDH1 coding sequence
NstPDH-R TTACACACTGTGCTGAGGATAGCC
NstPDH-qF ATGGCCACCCGTGTAATCCCACC Quantitative RT-PCR
NstPDH-qR TCCACCACAGACTCCGTGGCAGC
Actin2-qF CAGAAGGATGCATATGTTGGTGATG Quantitative RT-PCR
Actin2-qR GCTGGTCTTTGAGGTTTCCATCTCC
NSTPDH-KpnI-F AAGGTACCATGGCCACCCGTGTAATCCCACC Amplifying wild type NstProDH1 coding sequence for
constructing pCAM1300-NstProDH1-GFP NSTPDH-XbaI-R AATCTAGACACACTGTGCTGAGGATAGC
NSTPDH-BamHI-F AAGGATCCATGGCCACCCGTGTAATCCCACC Amplifying wild type NstProDH1 coding sequence for
constructing pET32a-NstProDH1 NSTPDH-XhoI-R AACTCGAGTTACACACTGTGCTGAGGATAAGC
魏丽娟等: 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性 685

min–1为1个酶活力单位(1 U)。
植物各组织器官中脯氨酸含量的测定采用磺基
水杨酸法(职明星和李秀菊, 2005)。分别称取南蛇藤
幼叶、成熟叶、幼嫩茎、花和花蕾各0.5 g, 经液氮充
分研磨后加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液, 沸水浴10分
钟后冷却至室温, 用定性滤纸过滤后的滤液即为脯氨
酸的提取液。吸取2 mL提取液放入另一干净具塞试管
中, 加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂, 沸水
浴30分钟后, 溶液即呈红色。将溶液冷却后加入4 mL
甲苯, 摇荡30秒后静置片刻, 取上层液至10 mL离心
管中, 在3 000 ×g下离心5分钟。吸取上层脯氨酸红色
甲苯溶液于比色杯中, 以甲苯为空白对照, 用分光光
度计测定520 nm处吸光值。
2 结果与讨论
2.1 南蛇藤总RNA的提取和RACE法克隆目的基因
通过分析拟南芥中2个脯氨酸脱氢酶基因的序列, 设
计了兼并性引物。利用兼并性引物, 以南蛇藤总RNA
合成的第1链cDNA为模板, 进行PCR扩增, 并得到1
个目的片段。回收该片段后, 与T-载体连接, 经生物
公司测序后得到一段序列。此序列与拟南芥2个脯氨
酸脱氢酶基因具有较高的同源性, 初步确定此片段可
能是南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的部分序列。基于得到
的序列信息, 我们设计了相应的特异性引物(表1), 通
过5′-RACE和3′-RACE, 对得到的序列进行拼接, 得
到了该基因的全长序列。利用该基因的两端序列设计
引物进行PCR扩增(图1), 相应的PCR产物测序后得
到了验证。该基因含有长1 533 bp的开放阅读框, 编
码510个氨基酸 , 与拟南芥中脯氨酸脱氢酶基因
AtProDH1和AtProDH2编码蛋白的氨基酸序列同源
性分别达72%和75%; 与烟草脯氨酸脱氢酶基因
NtPDH1和NtPDH2编码蛋白的氨基酸序列同源性高
达76%和75%(图2)。在本研究中该基因被命名为
NstProDH1。
2.2 NstProDH1基因编码蛋白质的序列分析
利用ProtParam工具(http://www.wxpasy.org/tools/prot-
param.html)分析结果显示, 该基因编码510个氨基
酸, 其中非极性氨基酸(Ala、Val、Leu、Ile、Pro和
Phe)201个, 极性不带电荷氨基酸(Gly、Ser、Thr、


图1 南蛇藤NstProDH1基因RT-PCR扩增结果
M: DL2000 PCR marker; 1: RT-PCR扩增结果

Figure 1 RT-PCR amplification of NstProDH1 gene in Ce-
lastrus orbiculatus
M: DL2000 PCR marker; 1: Product of RT-PCR amplification


Cys、Tyr、Asn和Gln)166个, 碱性氨基酸(Lys、Arg
和His)70个, 酸性氨基酸(Asp和Glu)53个。编码蛋白
平均分子量为56 573.9 Da, 理论等电点是8.31。初步
的生物信息学分析显示, NstProDH1编码的蛋白质属
于碱性蛋白。
利用NCBI网站上的BlastP对NstProDH1基因编
码的氨基酸序列进行分析, 结果显示该序列含有1个
ProDH的结构域。ProDH是脯氨酸降解的关键酶和限
速酶, 在植物生长发育和逆境胁迫过程中发挥重要作
用。蛋白质二级结构预测显示该基因编码的蛋白质含
有20个α螺旋, 9个β折叠。在该蛋白质的N端预测到2
个蛋白质非稳定区域, 碳端预测到1个蛋白质非稳定
区段, 这些区段可能参与蛋白质的同源互作或者异源
互作, 表明该基因表达的蛋白质可能会以同源或异源
二聚体的形式参与脯氨酸的代谢过程。尽管该蛋白与
大肠杆菌PutA ProDH结构域只有21.9%的序列同源
性, 但是蛋白质三级结构预测显示, 该蛋白与大肠杆
菌PutA空间结构中的ProDH结构域具有相似性(图3),
且三级结构预测的模板就是大肠杆菌的PutA(Kiefer
et al., 2009)。该基因的二级结构分析显示其具有保守
的PutA ProDH的活性位点, 这些保守的活性位点暗
示了南蛇藤ProDH与大肠杆菌的PutA ProDH结构域
具有共同的酶学特性。同时也表明, 预测的南蛇藤
686 植物学报 49(6) 2014



图2 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因(NstProDH1, AY639145)与其它不同植物脯氨酸脱氢酶基因(拟南芥AtProDH1, At3g30775; At-
ProDH2, At5g38710; 烟草NtPDH1, AY639145; NtPDH2, AY639146)编码蛋白的氨基酸序列比对
相同的氨基酸残基用黑色表示; 相似的氨基酸残基用灰色表示

Figure 2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of Celastrus orbiculatus proline dehydrogenase (NstProDH1,
AY639145) with amino acid sequences of different plant proline dehydrogenases (Arabidopsis thaliana AtProDH1, At3g30775;
AtProDH2, At5g38710; Nicotiana tabacum NtPDH1, AY639145; NtPDH2, AY639146)
Identical amino acid residues are shaded black, and similar amino acids are shaded grey


NstProDH1基因表达的蛋白质三级结构是正确的。
2.3 NstProDH1基因编码蛋白质的亚细胞定位
为了验证克隆的南蛇藤NstProDH1基因的亚细胞定
位, 我们构建了在CaMV35启动子下的NstProDH1和
绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白NstProDH1-GFP。利
用农杆菌介导法, 以空载体pBI121-GFP为对照, 将
重组质粒导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达。培养36
小时后, 在荧光显微镜下观察。如图4所示, 对照组空
载体pBI121-GFP蛋白在细胞核和细胞质中均有绿色
魏丽娟等: 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性 687



图3 预测NstProDH1基因的蛋白质三级结构(A)与已知的大肠杆菌PutA的ProDH结构域的三级结构(B)比较

Figure 3 Comparison of predicted tertiary structure between NstProDH1 (A) and proline dehydrogenase domain of Escherichia
coli PutA (B)



图4 野生型NstProDH1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞的亚细胞定位
(A) pCAM300-GFP空载体转化的洋葱表皮细胞, GFP蛋白分布在整个细胞中; (B) 野生型NstProDH1-GFP融合蛋白定位在线粒体
上; (C) 放大后的图(B)

Figure 4 Intracellular localization of wild-type NstProDH1-GFP fusion proteins in onion epidermal cells
(A) The free green fluorescent protein (GFP) was distributed throughout the entire cell; (B) The wild-type NstProDH1-GFP fusion
protein was located specifically in the mitochondria; (C) Two-fold magnification of figure (B)


荧光信号的表达, 而NstProDH1-GFP融合蛋白主要
定位在细胞质中的微粒上。由于显微镜分辨率的限制,
无法确切认定该微粒是线粒体。根据以往关于ProDH
的文献报道 (Kiyosue et al., 1996; Funck et al.,
2010), 我们推断NstProDH1-GFP融合蛋白定位在洋
葱表皮细胞的线粒体上。
2.4 NstProDH1在不同器官中的转录表达模式
分别抽提野生型南蛇藤幼茎、成熟叶、幼叶、花蕾和
花的总RNA, 反转录成cDNA。以南蛇藤Tubulin基因
为内标, 利用荧光定量PCR检测基因NstProDH1在
上述不同器官中的表达量。结果(图5)表明, NstPro-
DH1基因在幼叶中表达量最高, 其次是花蕾, 在幼茎
和花中也有一定的表达, 在成熟叶中的表达量最低。
2.5 NstProDH1基因表达蛋白的酶活检测分析
构建NstProDH1基因的原核表达载体pET32a-Nst-
ProDH1 , 转化大肠杆菌的表达菌株BL21后 , 经
688 植物学报 49(6) 2014



图5 NstProDH1在南蛇藤不同器官的转录表达模式

Figure 5 Transcription expression pattern analysis of
NstProDH1 among different organs of Celastrus orbiculatus




图6 NstProDH1基因原核表达蛋白的酶活性鉴定

Figure 6 Enzyme activity identification of NstProDH1 pro-
tein from prokaryotic expression

Ni-NTA Agrose层析柱提纯表达蛋白。SDS-PAGE电
泳检测后发现该蛋白的分子量约为56 kDa。表达蛋白
的酶活检测参照赵福庚等(2002)的方法, 以L-脯氨酸
为底物, 测定单位时间内600 nm波长处的吸光值的
变化。结果(图6)显示, 当酶活性测定反应开始时, 反
应液在600 nm处的吸光值随着反应时间的延长不断
升高, 颜色逐渐加深; 而对照溶液的吸光值在相应的
时间段内没有任何变化。这表明我们克隆的NstPro-
DH1基因具有ProDH活性。
2.6 南蛇藤不同器官的脯氨酸含量比较和ProDH
活性比较
如图7所示, 南蛇藤不同器官中游离脯氨酸含量差异
显著。在南蛇藤的花中游离脯氨酸含量最高, 高达
293.13 µg·g–1FW。脯氨酸在植物生长和生物胁迫过


图7 南蛇藤不同器官的游离脯氨酸含量比较

Figure 7 Comparison of proline contents from different
organs of Celastrus orbiculatus




图8 南蛇藤不同器官中ProDH活性比较

Figure 8 Comparison of enzyme activities of proline dehy-
drogenase from different organs of Celastrus orbiculatus


程中发挥着重要作用。脯氨酸降解可以产生高达30
个ATP, 为花和花粉提供能量来源。在花蕾和成熟叶
中游离脯氨酸的含量分别是188.53 µg·g–1FW和
105.03 µg·g–1FW。在幼嫩茎和幼叶中含量最少, 仅
为69.58 µg·g–1FW和69.91 µg·g–1FW。成熟叶中脯氨
酸含量多于幼叶可能是因为植物叶片衰老产生的信
号转导与逆境胁迫相似, 因此植物体会在成熟叶中积
累一定量的游离脯氨酸以抵抗胁迫。
南蛇藤不同器官ProDH活性比较结果(图8)表明,
在花蕾和花中ProDH的活性最高, 分别高达138 U和
120 U。在幼叶中检测到微弱的酶活性, 仅为7.8 U。
而在成熟叶和茎中, 没有检测到ProDH的活性。综合
植物各组织器官中游离脯氨酸含量和ProDH的活性
比较, 进一步印证了在不同器官中游离脯氨酸的作
魏丽娟等: 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性 689

用, 即在花和花蕾中, 脯氨酸主要作用于生长发育,
因此需要相应的ProDH催化脯氨酸为生长发育提供
能量; 而在成熟叶中积累的脯氨酸多用于逆境胁迫,
因此其相应的ProDH活性较低。
2.7 讨论
越来越多的研究表明, 脯氨酸在植物生长发育和逆境
胁迫中发挥着重要作用。随着研究的深入, 人们发现
在逆境胁迫过程中, 不仅是简单的脯氨酸积累, 而且
是整个脯氨酸的代谢途径都发挥着重要作用(Naka-
shima et al., 1998; Miller et al., 2005)。拟南芥和烟
草中ProDH的表达模式和调控方式不同, 暗示了脯氨
酸代谢途径的种间特异性 (Ribarits et al., 2007;
Funck et al., 2010)。
南蛇藤不仅抗逆性强, 而且是重要的中草药, 其
本身具有很高的园林用途和工业价值。为了进一步开
发利用其应用价值, 从分子水平上对其研究至关重
要。本研究利用兼并性引物和RACE方法, 从南蛇藤
中克隆了1个可能的脯氨酸脱氢酶基因NstProDH1,
序列同源性比较显示, 该酶与拟南芥和烟草等植物的
ProDH具有很高的同源性, 预测的其蛋白质空间结构
与大肠杆菌的脯氨酸利用蛋白(PutA)的结构相似。原
核表达的蛋白酶活性检测显示该酶具有ProDH的特
性。NstProDH1在不同器官之间的转录表达模式分析
显示, 该酶在幼叶中表达量最高, 其次是花蕾、花和
幼茎, 在成熟叶中表达量最低。南蛇藤各组织器官的
ProDH活性比较表明, 花蕾和花中ProDH的活性最
高, 在幼叶中检测到了微弱的酶活性, 在成熟叶和幼
茎中没有检测到酶活性。南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因转
录表达模式与植株ProDH活性结果的不一致表明, 该
基因的酶活性受到转录和翻译水平的双重调控, 而且
在拟南芥和烟草中均克隆到了2个有功能的脯氨酸脱
氢酶基因。因此南蛇藤中极有可能存在多个脯氨酸脱
氢酶基因。野生型拟南芥的ProDH1主要在根、成熟
叶、花蕾、花和荚果中表达; 而ProDH2只在根、成
熟叶和花中表达, 在花蕾中只检测到微弱表达。从表
达模式的相似性 , 可以推测本实验中克隆的Nst-
ProDH1基因可能在功能上与拟南芥的ProDH1相似。
对拟南芥和烟草中ProDH的研究表明, 在不同的
植物物种中, ProDH的调控方式存在着很大差异, 因
此研究不同物种ProDH的特性, 才能揭示该酶在本物
种抗逆和生长发育中发挥的作用。本研究在分子水平
上以脯氨酸脱氢酶基因为基础, 研究了南蛇藤生长发
育及抗逆的调控机理, 随着南蛇藤组织培养和愈伤转
化技术的完善, 相关的研究将会更加深入。
参考文献
罗雯, 刘阳 (2006). 根癌农杆菌转化条件优化的研究. 生物技
术 16, 41–43.
彭婧, 巩振辉, 黄炜, 李大伟, 陈儒钢, 逯明辉 (2010). 辣椒
雄性不育材料H9A小孢子败育机理. 植物学报 45, 44–51.
全先庆, 张渝洁, 单雷, 毕玉平 (2007). 脯氨酸在植物生长和
非生物胁迫耐受中的作用. 生物技术通讯 18, 159–162.
沈义国, 张万科, 阎冬青, 杜保兴, 张劲松, 陈受宜 (2002).
榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白基因的克隆及转基因拟南芥的耐
盐性. 植物学报 44, 956–962.
王若梦, 董宽虎 (2012). NaCl胁迫对苦马豆苗期脯氨酸代谢
的影响. 草地学报 20, 705–710.
徐学敏 (2011). 垂直绿化植物——南蛇藤的园林用途及培育.
中国林副特产 (4), 62–63.
张华, 员林, 钱亚云, 侯莹, 郭试瑜, 久光正, 刘延庆 (2011).
南蛇藤提取物含药血清对人肝癌SMMC 7721细胞增殖、迁
移和黏附作用的影响. 南京中医药大学学报 27, 44–48.
张舰, 许运明, 王维民, 刘延庆 (2006). 南蛇藤提取物体内抗
肿瘤作用的实验研究. 中国中药杂志 31, 1514–1516.
张娜, 黄韫宇, 冯洁, 刘莉莎, 杨鹏, 赵冰, 郭仰东 (2011).
甘蓝脯氨酸脱氢酶基因克隆与RNAi表达载体构建. 中国农
业大学学报 16(3), 87–94.
张树俭, 韩明福 (2009). 南蛇藤播种育苗技术. 吉林林业科技
38(3), 46–47.
赵福庚, 孙诚, 刘友良, 章文华, 刘兆普 (2002). ABA和NaCl
对碱蓬多胺和脯氨酸代谢的影响. 植物生理与分子生物学
学报 28, 117–120.
职明星, 李秀菊 (2005). 脯氨酸测定方法的改进. 植物生理学
通讯 41, 355–357.
Ashraf M, Harris PJC (2004). Potential biochemical indica-
tors of salinity tolerance in plants. Plant Sci 166, 3–16.
Chiang HH, Dandekar AM (1995). Regulation of proline
accumulation in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh during
development and in response to desiccation. Plant Cell
Environ 18, 1280–1290.
Delauney AJ, Verma DPS (1993). Proline biosynthesis and
osmoregulation in plants. Plant J 4, 215–223.
Deuschle K, Funck D, Forlani G, Stransky H, Biehl A,
690 植物学报 49(6) 2014

Leister D, van der Graaff E, Kunze R, Frommer WB
(2004). The role of ∆1-pyrroline-5-carboxylate dehydro-
genase in proline degradation. Plant Cell 16, 3413–3425.
Funck D, Eckard S, Müller G (2010). Non-redundant func-
tions of two proline dehydrogenase isoforms in Arabidop-
sis. BMC Plant Boil 10, 70.
Hare PD, Cress WA (1997). Metabolic implications of
stress-induced proline accumulation in plants. Plant Gro-
wth Regul 21, 79–102.
Kiefer F, Arnold K, Künzli M, Bordoli L, Schwede T
(2009). The SWISS-MODEL repository and associated
resources. Nucleic Acids Res 37, D387–D392.
Kiyosue T, Yoshiba Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shino-
zaki K (1996). A nuclear gene encoding mitochondrial
proline dehydrogenase, an enzyme involved in proline
metabolism, is upregulated by proline but downregulated
by dehydration in Arabidopsis. Plant Cell 8, 1323–1335.
Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura MM, Costan-
tino P, Trovato M (2009). The proline biosynthetic genes
P5CS1 and P5CS2 play overlapping roles in Arabidopsis
flower transition but not in embryo development. Physiol
Plant 137, 72–85.
Matysik J, Alia, Bhalu B, Mohanty P (2002). Molecular
mechanisms of quenching of reactive oxygen species by
proline under stress in plants. Curr Sci 82, 525–532.
Miller G, Stein H, Honig A, Kapulnik Y, Zilberstein A
(2005). Responsive modes of Medicago sativa proline
dehydrogenase genes during salt stress and recovery
dictate free proline accumulation. Planta 222, 70–79.
Nakashima K, Satoh R, Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki
K, Shinozaki K (1998). A gene encoding proline dehy-
drogenase is not only induced by proline and hypoosmo-
larity, but is also developmentally regulated in the repro-
ductive organs of Arabidopsis. Plant Physiol 118, 1233–
1241.
Phang JM, Donald SP, Pandhare J, Liu YM (2008). The
metabolism of proline, a stress substrate, modulates car-
cinogenic pathways. Amino Acids 35, 681–690.
Rayapati PJ, Stewart CR, Hack E (1989). Pyrroline-5-
carboxylate reductase is in pea (Pisum sativum L.) leaf
chloroplasts. Plant Physiol 91, 581–586.
Ribarits A, Abdullaev A, Tashpulatov A, Richter A,
Heberle-Bors E, Ouraev A (2007). Two tobacco proline
dehydrogenases are differentially regulated and play a
role in early plant development. Planta 225, 1313–1324.
Strizhov N, Abrahám E, Okrész L, Blickling S, Zilberstein
A, Schell J, Koncz C, Szabados L (1997). Differential
expression of two P5CS genes controlling proline accu-
mulation during salt-stress requires ABA and is regulated
by ABA1, ABI1 and AXR2 in Arabidopsis. Plant J 12,
557–569.
Szabados L, Savouré A (2010). Proline: a multifunctional
amino acid. Trends Plant Sci 15, 89–97.
Székely G, Ábrahám E, Cséplő A, Rigó G, Zsigmond L,
Csiszár J, Ayaydin F, Strizhov N, Jásik J, Schmelzer
E, Koncz C, Szabados L (2008). Duplicated P5CS genes
of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and
developmental control of proline biosynthesis. Plant J 53,
11–28.
Verbruggen N, Hermans C (2008). Proline accumulation in
plants: a review. Amino Acids 35, 753–759.
Verbruggen N, Villarroel R, Van Montagu M (1993). Os-
moregulation of a pyrroline-5-carboxylate reductase gene
in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 103, 771–781.


魏丽娟等: 南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性 691

Cloning and Expression of a Proline Dehydrogenase Gene from
Celastrus orbiculatus
Lijuan Wei1, Juan Zhang2*, Lei Wang1, Linde Liu1, Tongxin Zhao1, Qingrong Huang1
1Life Sciences School of Ludong University, Yantai 264025, China; 2Agricultural School of Ludong University, Yantai 264025, China
Abstract We cloned a proline dehydrogenase gene from Celastrus orbiculatus using degenerate primers and RACE
and named it NstProDH1. Sequence alignment showed that NstProDH1 has high sequence similarity with corresponding
genes from Arabidopsis and tobacco. Enzymatic characteristic analysis identified the activity of proline dehydrogenase.
Comparison of gene expression patterns and proline dehydrogenase activity were not associated in different organs, so
NstProDH1 was regulated by transcription and translation. The gene expression pattern of NstProDH1 was similar to that
of Arabidopsis ProDH1, therefore NstProDH1 may be functionally similar to Arabidopsis ProDH1.
Key words Celastrus orbiculatus, NstProDH1, proline dehydrogenase
Wei LJ, Zhang J, Wang L, Liu LD, Zhao TX, Huang QR (2014). Cloning and expression of a proline dehydrogenase
gene from Celastrus orbiculatus. Chin Bull Bot 49, 682–691.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: juanzh74@163.com
(责任编辑: 白羽红)